本发明涉及分子生物学
技术领域：
，进一步涉及筛查MDS相关基因突变的检测试剂盒及其医学解读数据库，具体涉及一种检测MDS相关基因群的检测试剂盒。
背景技术：
：MDS(骨髓增生异常综合征)是一组起源于造血髓系定向干细胞或多能干细胞的异质性克隆性疾患，主要特征是无效造血和高危演变为急性髓系白血病，临床表现为造血细胞在质和量上出现不同程度的异常变化。其具体临床表现为贫血，可伴有感染或出血，部分病人可无症状。部分患者可有肝，脾，淋巴结轻度肿大，少数患者可有胸骨压痛，肋骨或四肢关节痛。血象可呈全血细胞减少，或任何一系及二系血细胞减少。1982年由FAB协作组建议确立病名，并将MDS分为五型：难治性贫血；难治性贫血伴环状铁粒幼细胞增多；难治性贫血伴原始细胞增多，转变中的难治性贫血伴原始细胞增多；慢性粒－单核细胞白血病。MDS发病率约10/10万～12/10万人口，多累及中老年人，50岁以上的病例占50％～70％，男女之比为2：1。MDS30％～60％转化为白血病。其死亡原因除白血病之外，多数由于感染，出血，尤其是颅内出血。MDS的病因尚不明确，推测是由于生物，化学，或物理等因素引起基因突变，染色体异常使某个恶变的细胞克隆性增生。业已公认，诱变剂如病毒，某些药物(如化疗药)，辐射(放疗)，工业反应剂(如苯，聚乙烯)以及环境污染等的可致癌作用，诱变剂可引起染色体的重排或基因重排，也可能只引起基因表达的改变导致MDS.MDS和急性白血病一样，是由一个异常的造血干细胞衍生的恶性克隆发展起来的“克隆性疾病”。主要累及髓系细胞，使骨髓粒，红及巨三系细胞无效病态造血，其凋亡细胞数量明显增加。目前检测MDS的方法主要涉及细胞形态、流式细胞学、细胞遗传学、分子生物学。其中分子生物学的实验方法主要有巢式PCR、一代测序等。PCR方法不能直观的得到具体的突变序列，而一代测序的方法受到测序通量的影响，无法一次性检测多个基因的全部外显子区域。而二代测序作为一种高通量的检测方法，可以一次性准确测量多个基因的外显子序列，使精准治疗成为可能。技术实现要素：本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种检测MDS相关基因群的检测试剂盒，以解决现有技术中MDS的诊断方法较为局限，缺乏从分子生物学的角度诊断MDS的依据。本发明要解决的另一技术问题是现有技术的MDS的诊断方法准确性较低。为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：一种检测MDS相关基因群的检测试剂盒，该试剂盒包括以下16个基因：U2AF1，CEBPA，SF3B1，TP53，SETBP1，NRAS，NPM1，RUNX1，TET2，KRAS，IDH1，DNMT3A，ASXL1，JAK2，PTPN11，SRSF2上述16个基因，由85个热点突变组成，其突变位点为本领域常规的突变位点，较佳地包括了indel突变位点(插入或缺失引起的序列改变insertionordeletion，indel)、无义突变位点、拼接区突变位点或错义突变位点，更佳地本发明所述的16个基因外显子区域的热点突变如表1所示。表1热点突变列表本发明所述的16个基因外显子区域的热点突变可用于对MDS做出辅助诊断，本领域MDS常规的诊断方法有形态学、细胞遗传学和流式细胞学，本发明所述方法较佳地从分子生物学角度对MDS做出诊断。本发明提供一组检测本发明所述MDS相关基因外显子区域的多重PCR引物，所述引物的扩增范围包括16个与MDS相关基因的外显子区域，扩增得到的单个片段长度为250bp左右。利用本发明提供的多重PCR引物，结合二代测序技术，能够检测本发明所述突变基因群中的全部外显子区域。其中所述的二代测序试剂为本领域常规使用的试剂，只要能够满足对所得序列进行二代测序的要求即可。所述试剂制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为市售可得。本发明所述检测试剂盒更佳地还包括将检测对象中提取的基因组DNA制成可供测序使用的文库的试剂，该种试剂为本领域常规使用试剂，只要能够满足多重PCR对基因组DNA质量的要求即可。所述试剂制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为市售可得。本发明所述检测试剂盒较佳地还包括：dNTP溶液，DNA聚合酶，用于分离或纯化核酸的是Backman磁珠。本发明所述的样本为检测对象的组织，只要能从检测样本中抽提检测对象的基因组DNA即可。所述检测样本较佳地为骨髓、血液、实体瘤样本中的一种或几种，优选地为骨髓样本。一种本发明所述试剂盒的使用方法，其包括以下步骤：(1)利用本发明所述检测试剂盒抽提检测对象的骨髓，提取基因组DNA；(2)用多重PCR引物对基因组DNA中发明中所述16个MDS相关基因的外显子区域进行扩增；(3)将步骤(2)中扩增所得的片段制成可供IonTorrent测序平台测序的文库；(4)对步骤(3)中所得DNA文库进行测序，得到下机数据；(5)对(4)中的下机数据进行生物信息学分析，而后利用医学解读数据库进行解读做出诊断即可。以上各个步骤的具体操作方法详见试剂盒说明书。本发明所用的试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：利用本发明提供的可用于筛查MDS相关基因突变的基因群，结合高通量测序技术，可以实现在形态学和流式细胞学之外对MDS进行辅助诊断，特别是对于疾病预后做出评估和针对相关靶药的作用效果做出预判具有特殊的优势。本发明提供的用于筛查MDS相关基因突变的基因群的检测试剂盒具有检测效率高、检出率高等优点。具体实施方式以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。材料和方法：在中国医学科学院血液病医院和协和华美医学诊断中心2015年10月至2016年7月诊断的患者中，根据以下标准，我们进行连续性入组(194名)。入选标准为：经细胞形态学和流式细胞学诊断为骨髓增生异常综合征(MDS)的患者。194名患者的诊断结果如表2所示：表2患者诊断结果列表收集3mL患者骨髓提取基因组DNA待测，该检测经过中国医学科学院血液病医院伦理委员会批准。样本处理：样本中基因组利用天根DNA提取试剂盒(货号：DP318-03)进行抽提，具体操作方法参见试剂盒的使用说明书。用多重PCR引物对基因组DNA进行扩增，实验操作方法参见Life公司试剂盒的使用说明书。文库的构建：对扩增得到的DNA片段使用Life公司生产的IonTorrent平台建库试剂盒进行测序文库的构建，实验操作方法参见Life公司试剂盒的使用说明书。高通量测序：将构建好的测序文库经油包水处理后在IonTorrent平台上进行高通量测序，油包水处理方法和高通量测序方法请参考高通量测序仪IonTorrent以及其配套设备OneTouch的使用说明书。生物信息学分析：首先，使用IonReport软件(v4.6,ThermoFisher,Carlsbad,CA,USA)过滤低质量的测序片段，并将合格的测序片段比对到人类参考基因组hg19(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads.html)，使用TorrentVariantCaller(v4.6.0.7)子程序检测突变位点，软件参数使用的是默认的设置。此软件已经被优化用于处理IonTorrent测序平台特有的错误类型。最后对找出的突变包括SNP和Indel使用ANNOVAR(http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/)软件进行注释，注释内容包括突变在基因组中的位置，关联的基因，基因外显子编号，核苷酸水平变异，对应的蛋白水平变异，该突变在dbSNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)，1000Genomes数据库(http://www.1000genomes.org/)和癌症突变数据库COSMIC(http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic)中的注释，PolyPhen(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和SIFT(http://sift.jcvi.org/)功能预测结果等。进一步使用一下原则筛选致病突变位点：(1)根据突变所在的基因组位置和类型，过滤掉对蛋白产物序列不产生影响的突变；(2)利用1000Genomes数据，注释每个突变在人群中的比例，如果比例小于等于1％则不认为是多态性位点；(3)检索癌症数据库COSMIC，查询一个突变在COSMIC中是否有记载，其出现在血液系统肿瘤中；(4)利用蛋白质功能预测软件PolyPhen-2预测该突变是否影响蛋白功能；(5)如果经过(2)(3)(4)后，一个突变满足“非多态性”、“在血液系统肿瘤中记载过”和“影响蛋白功能”这三条中至少两条的，将被判为与疾病可能相关。最后，如果一个突变虽然不满足(5)但是在COSMIC中记录为在肿瘤中检测到过，则被判读为意义不明的突变。最后如果一个突变在文献中被明确记载未与疾病高度相关，则直接判为热点突变。统计分析：统计每个基因携带致病突变的比例，筛选出突变率最高的基因，使用的软件为Excel。医学解读：用医学解读数据库对生物信息学分析得出的基因突变型做出分子病理诊断。所用的医学解读数据库如下：(1)U2AF1基因突变主要见于MDS，AML。U2AF1突变会导致其蛋白水平上升，并改变其剪切方式。U2AF1突变的MDS患者易进展为继发性急性髓系白血病，但对其总体生存率没有影响。(PMID：22158538)(2)CEBPA是维护粒细胞造血系统分化的重要转录因子。CEBPA基因突变主要见于AML患者，尤其是M1、M2和M4，目前已知CEBPA双等位基因突变的AML患者预后良好。(3)SF3B1基因突变主要见于CLL,MDS以及MPN患者，在CLL患者中预后不良。在MDS中，SF3B1突变最常见的亚型为难治性贫血伴环形铁粒幼细胞增多(RARS)，且总体生存率提高。(PMID：21995386)(4)TP53基因突变主要见于MDS,AML,CLL等血液系统疾病以及实体瘤。TP53基因突变的MDS患者生存率降低且大多预后不良。作用于TP53及其通路相关的药物有Cisplatin，Fluorouracil，Docetaxel，Paclitaxel，Aspirin。(PMID：21714648)(5)SETBP1基因编码蛋白参与DNA复制的调控。SETBP1体细胞突变与髓系白血病转化相关，在MDS和CMML中预后不良。(PMID：23832012)(6)NRAS基因突变主要见于AML,CML,ALL,MPN等血液系统疾病以及实体瘤。RAS蛋白NRAS主要参与RAS信号通路。在AML中，如果患者同时携带NRAS,DNMT3A和NPM1突变，则提示预后良好。RAS突变尚不足以成为AML中的独立预后因素。但是最近的研究提示，对于携带RAS突变的AML患者，在缓解后使用高剂量的阿糖胞苷进行巩固治疗可能是有益的。(PMID：26376137)(7)NPM1突变主要见于AML，尤其是正常核型的AML。NPM1突变多为Exon12的移码突变，以A型突变最为常见。NPM1单独突变提示患者预后良好；当合并其它预后不良基因突变时(如FLT3、DNMT3A)，患者预后不良；文献报道对于超过65岁的老年AML患者，NPM1突变不再提示预后良好。NPM1突变还可用于微小残留疾病的监测。NPM1突变的患者使用大剂量柔红霉素治疗可能获益。(PMID：26755712；22417203；26376137；25713434)(8)RUNX1突变主要见于髓系肿瘤患者，尤其多见于AML患者。RUNX1突变的MDS和AML患者预后水平与总体生存率都会降低。(PMID：19808697；22689681；21714648)(9)TET2基因突变主要见于AML患者，在CML,MDS,MPN及淋巴瘤患者中亦存在，目前TET2基因突变在CMML中是预后较好的指标，而在MDS/MPN、继发性AML中预后不良。(10)KRAS突变可见于MDS,AML,MPN,MM等血液系统疾病以及实体瘤。RAS蛋白KRAS主要参与RAS信号通路。KRAS突变不会诱导细胞形态学和迁移能力的改变，但会增强ERK、PDK1和AKT的磷酸化。RAS突变尚不足以成为AML中的独立预后因素。但是最近的研究提示，对于携带RAS突变的AML患者，在缓解后使用高剂量的阿糖胞苷进行巩固治疗可能是有益的。(11)IDH1基因突变主要见于AML,MDS和MPN患者。IDH1基因编码异柠檬酸脱氢酶1，参与胞内氧化损伤防御机制。对于AML患者，合并NPM1突变时可能预后较好。IDH1抑制剂AG-120已在AML患者中进行I期临床试验(NCT02632708)。(PMID：22915641；27245312；26660517；22417203)(12)DNMT3A基因突变主要见于AML，尤其是正常核型的AML，亦可见于其他血液疾病，或者正常的老年人(发生在正常人中，一般负荷较低，且独立突变)。DNMT3A作为一个表观遗传相关的基因，一般发生在前白血病阶段，其突变负荷一般较高。DNMT3A基因主要突变形式为点突变，多常见于R882位的氨基酸，最常见的突变形式为R882H。DNMT3A基因突变患者大多预后不良。DNMT3A突变患者使用高剂量的柔红霉素可能获益，对DNA甲基化转移酶抑制剂地西他滨有良好反应。(PMID：25426837；26755712；22417203；19776405)(13)ASXL1基因突变在AML,CML,MDS,MPN患者中均有报道，与AML患者总体生存率降低相关(PMID:22417203)。(14)目前已知JAK2exon12/14突变检测有助于MPN诊断，V617F突变可见于90-95％的PV患者以及50-60％的ET和PMF患者。JAK2蛋白是与细胞因子受体信号通路相关的非受体型酪氨酸激酶，参与细胞的生长，发育，分化。ruxolitinib为JAK2抑制剂，能够改善MPN患者脾大等症状。(PMID：24740812)(15)PTPN11基因突变主要见于CML,AML,ALL和MPN患者。PTPN11是蛋白酪氨酸磷酸酶，在细胞生长、分化、有丝分裂周期和致癌转化中均有重要作用。Dodecane-Trimethylamine可以靶定PTPN11(在研中)。(16)SRSF2突变主要见于MDS,t-AML以及CML等疾病，SRSF2突变的MDS患者总体生存率降低，向AML转化的风险提高。(PMID：22389253)使用本发明试剂盒检测结果：194名患者所检测出16个基因的阳性率如下表3所示：表316个基因阳性率列表突变基因突变病例数突变率突变基因突变病例数突变率U2AF14422.68％TET284.12％CEBPA2311.86％KRAS73.61％SF3B12211.34％IDH163.09％TP53147.22％DNMT3A63.09％SETBP1105.15％ASXL163.09％NRAS94.64％JAK263.09％NPM194.64％PTPN1142.06％RUNX184.12％SRSF242.06％经统计后表明：(根据上述表格进行总结)由此可见，使用二代测序的方法对骨髓增生异常综合征进行辅助诊断，具有诊断准确、获得信息量大的特点。以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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