鉴定麝香化合物的方法与流程

文档序号:13985096
鉴定麝香化合物的方法与流程

本技术领域涉及气味剂和香味受体以及可用于鉴定气味剂和/或香味化合物以及更具体而言麝香化合物增强剂的测定法。



背景技术:

嗅觉是人类感官系统中最复杂和最不充分理解的系统之一。从嗅觉受体(OR)的激活到感知,还有很多步骤需要进一步研究。麝香化合物是包含大环麝香、多环麝香、脂环麝香和硝基麝香的一组结构多样性的化学物质的一部分。这些麝香化合物被用于香料业,并在许多商业配方中形成基础香调。因此,需要鉴定新型麝香化合物和增强香料中麝香感知的化合物。



技术实现要素:

本文提供了一种宿主细胞,其经转化以表达具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少75%相同的氨基酸序列的多肽。

本文还提供了一种表达载体,其包含核酸,该核酸编码具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少75%相同的氨基酸序列的多肽。

本文还提供了一种具有核酸的表达载体,其中该核酸包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3至少75%相同的核苷酸序列。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由多环麝香或硝基麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少75%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

还进一步提供了一种细胞,其经重组修饰以表达上述多肽。

附图说明

图1显示了嗅觉感觉神经元的Ca2+成像痕迹,其响应于麝香化合物的混合物(图1A),以及小鼠受体Olfr96和Olfr235的后续鉴定(图1B)。

图2显示了Olfr96与多环麝香化合物vulcanolide和吐纳麝香(tonalide)的麝香剂量响应曲线。

图3显示了Olfr96和OR11A1与多环麝香化合物vulcanolide、吐纳麝香和开司米木麝香(cashmeran)以及硝基麝香化合物麝香X的麝香剂量响应曲线。

具体实施方式

对于本文和所附权利要求书中的描述,除非另有说明,“或”的使用意指“和/或”。类似地,“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”可以互换使用并且不旨在限制。

还应当理解的是,在各个实施方案的描述使用术语“包含”的情况下,本领域技术人员能够理解,在一些具体情形中,可以替代地使用语言“基本上由……组成”或“由……组成”来描述一个实施方案。

在一个实施方案中,宿主细胞被转化以表达多肽,其中该多肽包含与SEQ ID NO:2至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%相同的氨基酸序列。

在一个实施方案中,宿主细胞被转化以表达多肽,其中该多肽包含与SEQ ID NO:2至少80%、85%、90%、95%、98%或99%相同的氨基酸序列。

在一个实施方案中,宿主细胞被转化以表达多肽,其中该多肽包含与SEQ ID NO:2至少85%、90%、95%、98%或99%相同的氨基酸序列。

在一个实施方案中,宿主细胞被转化以表达多肽,其中该多肽包含与SEQ ID NO:2至少90%、95%、98%或99%相同的氨基酸序列。

在一个实施方案中,宿主细胞被转化以表达多肽,其中该多肽包含与SEQ ID NO:2至少95%、98%或99%相同的氨基酸序列。

在一个实施方案中,宿主细胞被转化以表达多肽,其中该多肽包含与SEQ ID NO:2至少98%或99%相同的氨基酸序列。

在一个实施方案中,宿主细胞被转化以表达多肽,其中该多肽包含与SEQ ID NO:2至少99%相同的氨基酸序列。

在一个实施方案中,宿主细胞被转化以表达多肽,其中该多肽包含与SEQ ID NO:4至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%相同的氨基酸序列。

在一个实施方案中,宿主细胞被转化以表达多肽,其中该多肽包含与SEQ ID NO:4至少80%、85%、90%、95%、98%或99%相同的氨基酸序列。

在一个实施方案中,宿主细胞被转化以表达多肽,其中该多肽包含与SEQ ID NO:4至少85%、90%、95%、98%或99%相同的氨基酸序列。

在一个实施方案中,宿主细胞被转化以表达多肽,其中该多肽包含与SEQ ID NO:4至少90%、95%、98%或99%相同的氨基酸序列。

在一个实施方案中,宿主细胞被转化以表达多肽,其中该多肽包含与SEQ ID NO:4至少95%、98%或99%相同的氨基酸序列。

在一个实施方案中,宿主细胞被转化以表达多肽,其中该多肽包含与SEQ ID NO:4至少98%或99%相同的氨基酸序列。

在一个实施方案中,宿主细胞被转化以表达多肽,其中该多肽包含与SEQ ID NO:4至少99%相同的氨基酸序列。

在一个实施方案中,宿主细胞被转化以表达,其具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4相同的氨基酸序列;更特别是与SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列;甚至更特别是与SEQ ID NO.:4相同的氨基酸序列。

本文还提供了一种包含核酸的表达载体,该核酸编码具有与SEQ ID NO:2至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽。

本文还提供了一种包含核酸的表达载体,该核酸编码具有与SEQ ID NO:2至少80%、85%、90%、95%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽。

本文还提供了一种包含核酸的表达载体,该核酸编码具有与SEQ ID NO:2至少85%、90%、95%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽。

本文还提供了一种包含核酸的表达载体,该核酸编码具有与SEQ ID NO:2至少90%、95%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽。

本文还提供了一种包含核酸的表达载体,该核酸编码具有与SEQ ID NO:2至少95%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽。

本文还提供了一种包含核酸的表达载体,该核酸编码具有与SEQ ID NO:2至少98%或99%相同的氨基酸序列的多肽。

本文还提供了一种包含核酸的表达载体,该核酸编码具有与SEQ ID NO:2至少99%相同的氨基酸序列的多肽。

本文还提供了一种包含核酸的表达载体,该核酸编码具有与SEQ ID NO:4至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽。

本文还提供了一种包含核酸的表达载体,该核酸编码具有与SEQ ID NO:4至少80%、85%、90%、95%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽。

本文还提供了一种包含核酸的表达载体,该核酸编码具有与SEQ ID NO:4至少85%、90%、95%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽。

本文还提供了一种包含核酸的表达载体,该核酸编码具有与SEQ ID NO:4至少90%、95%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽。

本文还提供了一种包含核酸的表达载体,该核酸编码具有与SEQ ID NO:4至少95%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽。

本文还提供了一种包含核酸的表达载体,该核酸编码具有与SEQ ID NO:4至少98%或99%相同的氨基酸序列的多肽。

本文还提供了一种包含核酸的表达载体,该核酸编码具有与SEQ ID NO:4至少99%相同的氨基酸序列的多肽。

本文还提供了一种包含核酸的表达载体,该核酸编码多肽,该多肽具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4相同的氨基酸序列;更特别是与SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列;甚至更特别是与SEQ ID NO:4相同的氨基酸序列。

本文还提供了一种具有核酸的表达载体,其中该核酸包含与SEQ ID NO:1至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%相同的核苷酸序列。

本文还提供了一种具有核酸的表达载体,其中该核酸包含与SEQ ID NO:1至少80%、85%、90%、95%、98%或99%相同的核苷酸序列。

本文还提供了一种具有核酸的表达载体,其中该核酸包含与SEQ ID NO:1至少85%、90%、95%、98%或99%相同的核苷酸序列。

本文还提供了一种具有核酸的表达载体,其中该核酸包含与SEQ ID NO:1至少90%、95%、98%或99%相同的核苷酸序列。

本文还提供了一种具有核酸的表达载体,其中该核酸包含与SEQ ID NO:1至少95%、98%或99%相同的核苷酸序列。

本文还提供了一种具有核酸的表达载体,其中该核酸包含与SEQ ID NO:1至少98%或99%相同的核苷酸序列。

本文还提供了一种具有核酸的表达载体,其中该核酸包含与SEQ ID NO:1至少99%相同的核苷酸序列。

本文还提供了一种具有核酸的表达载体,其中该核酸包含与SEQ ID NO:3至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%相同的核苷酸序列。

本文还提供了一种具有核酸的表达载体,其中该核酸包含与SEQ ID NO:3至少80%、85%、90%、95%、98%或99%相同的核苷酸序列。

本文还提供了一种具有核酸的表达载体,其中该核酸包含与SEQ ID NO:3至少85%、90%、95%、98%或99%相同的核苷酸序列。

本文还提供了一种具有核酸的表达载体,其中该核酸包含与SEQ ID NO:3至少90%、95%、98%或99%相同的核苷酸序列。

本文还提供了一种具有核酸的表达载体,其中该核酸包含与SEQ ID NO:3至少95%、98%或99%相同的核苷酸序列。

本文还提供了一种具有核酸的表达载体,其中该核酸包含与SEQ ID NO:3至少98%或99%相同的核苷酸序列。

本文还提供了一种具有核酸的表达载体,其中该核酸包含与SEQ ID NO:3至少99%相同的核苷酸序列。

本文还提供了一种具有核酸的表达载体,其中该核酸包含与SEQ ID NO:1相同的核苷酸序列。

本文还提供了一种具有核酸的表达载体,其中该核酸包含与SEQ ID NO:3相同的核苷酸序列。

在一个实施方案中,本文提供了一种细胞,其经重组修饰以表达具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少75%相同的氨基酸序列的多肽。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由多环麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少75%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由多环麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:2至少75%、80%、85%、90%、95%、98%和99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

c)使该受体或其嵌合体或其片段与化合物接触;

d)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由多环麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:2至少80%、85%、90%、95%、98%和99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由多环麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:2至少85%、90%、95%、98%和99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由多环麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:2至少90%、95%、98%和99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由多环麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:2至少95%、98%和99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由多环麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:2至少98%和99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由多环麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:2至少99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由多环麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:4至少75%、80%、85%、90%、95%、98%和99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由多环麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:4至少80%、85%、90%、95%、98%和99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由多环麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:4至少85%、90%、95%、98%和99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由多环麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:4至少90%、95%、98%和99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由多环麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:4至少95%、98%和99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由多环麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:4至少98%和99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由多环麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:4至少99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由多环麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:4相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由多环麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由硝基麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少75%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由硝基麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:2至少75%、80%、85%、90%、95%、98%和99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由硝基麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:2至少80%、85%、90%、95%、98%和99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由硝基麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:2至少85%、90%、95%、98%和99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由硝基麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:2至少90%、95%、98%和99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由硝基麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:2至少95%、98%和99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由硝基麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:2至少98%和99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由硝基麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:2至少99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由硝基麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:4至少75%、80%、85%、90%、95%、98%和99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由硝基麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:4至少80%、85%、90%、95%、98%和99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由硝基麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:4至少85%、90%、95%、98%和99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由硝基麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:4至少90%、95%、98%和99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由硝基麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:4至少95%、98%和99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由硝基麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:4至少98%和99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由硝基麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:4至少99%相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由硝基麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:4相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由硝基麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是具有与SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列的多肽,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

还提供了许多麝香化合物中的任一种,该化合物激活、模拟、阻断、抑制、调节和/或增强嗅觉受体的活性,并且通过本文公开的方法鉴定。

本发明的另一个实施方案涉及具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少75%相同的氨基酸序列的多肽的用途,用于鉴定麝香化合物,该化合物激活、模拟、阻断、抑制、调节和/或增强嗅觉受体的活性。

还进一步提供了一种细胞,其经重组修饰以表达上述多肽。

在一个实施方案中,本文提供了一种非人细胞,其经转化以表达多肽,该多肽具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4相同的氨基酸序列;更特别是与SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列;甚至更特别是与SEQ ID NO:4相同的氨基酸序列。

本文还提供了一种包含核酸的表达载体,该核酸编码多肽,该多肽具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4相同的氨基酸序列;更特别是与SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列;甚至更特别是与SEQ ID NO:4相同的氨基酸序列。

在一个实施方案中,本文提供了一种细胞,其经重组修饰以表达具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少75%相同的氨基酸序列的多肽。

在一个实施方案中,本文提供了一种细胞,其经重组修饰以表达多肽,该多肽具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4相同的氨基酸序列;更特别是与SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列;甚至更特别是与SEQ ID NO:4相同的氨基酸序列。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法,该化合物阻断、抑制、调节和/或增强由多环麝香激活的嗅觉受体的活性,其中该受体是一种多肽,该多肽具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4相同的氨基酸序列,更特别的是与SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列;甚至更特别是与SEQ ID NO:4相同的氨基酸序列,其中该方法包括:

a)使该受体或其嵌合体或片段与化合物接触;和

b)确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

在一个实施方案中,本文提供了一种细胞,其中该细胞是原核细胞。在另一个实施方案中,本文提供的细胞是真核细胞。在一个具体的实施方案中,本文提供的细胞是从由酵母细胞和植物细胞构成的群组中选出的。在本文提供的更具体的实施方案中,细胞是从由HEK293、CHO、非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)、COS、酵母、细菌和源自嗅觉基板的细胞构成的群组中选出的。

为了鉴定未知的麝香特异性受体,使用代表性的麝香混合物来筛选分离的嗅觉感觉神经元(OSN)。单独的麝香化合物可以进一步用于基于细胞的剂量响应实验,该实验对特定的麝香受体进行以评估受体的特异性和敏感性。

例如,麝香化合物是包含如下所述的大环麝香、多环麝香、脂环麝香和硝基麝香的一组结构多样性的化学物质的一部分。

一方面,本文提供了鉴定麝香香料化合物的哺乳动物气味剂受体的方法和该受体用于筛选,特别是用于麝香调节剂(例如增强剂)和新麝香化合物的高通量筛选(HTS)的用途。本文特别提供小鼠受体,例如Olfr96(SEQ ID NO:2)及其人类对应物OR11A1(SEQ ID NO:4)作为包含Vulcanolide、开司米木麝香、吐纳麝香和麝香X的麝香化合物的受体。

尽管不希望受任何理论的束缚,但小鼠受体Olfr235是受体Olfr1440的旁系同源物(paralog)和人受体OR5AN1的直系同源物(ortholog)。这些受体先前被鉴定为对麝香酮和麝香烯酮敏感的受体(WO2015/020158;Shirasu等,Neuron(2013))。

在另一个实施方案中,用于监测嗅觉受体活性的指标选自荧光钙指示剂染料、钙指示剂蛋白质、荧光cAMP指示剂、cAMP应答元件(CRE)介导的报道蛋白、生化cAMP HTRF测定,β抑制蛋白测定或电生理记录。具体而言,选择钙指示剂染料,其可用于监测在嗅觉神经元(例如,Fura-2AM)的膜上表达的嗅觉受体的活性。

在具体的实施方案中,依次筛选化合物,并使用荧光显微镜或荧光激活细胞分选仪(FACS)测量钙染料荧光的气味依赖性变化。

在另一个实施方案中,使用嗅觉受体的分子3D受体建模来评估电脑模拟(in silico)的结合潜力,并鉴定可激活、模拟、阻断、抑制、调节和/或增强嗅觉受体活性的化合物。

举例来说,嗅神经元通过使用连接到显微操作器或FACS机器上的玻璃微电极被一种或多种麝香化合物分离。小鼠嗅觉感觉神经元通过类似于之前描述程序的Ca2+成像进行筛选(Malnic等人,1999;Areneda等人,2004;WO2014/210585)。特别地,使用电动可移动显微镜台以将可以筛选的细胞数量增加至每实验至少1,500个。由于小鼠中有大约1,200种不同的嗅觉受体,并且每种嗅觉感觉神经元仅表达1,200种嗅觉受体基因中的1种,所以这种筛选能力实际上将覆盖整个小鼠气味剂受体库。换句话说,用于高通量嗅觉感觉神经元筛选的钙成像的组合导致几乎所有的响应于特定气味剂特征的气味剂受体的识别。在一个特定方面,可以分离响应于麝香化合物的气味剂受体。例如,至少一个神经元被分离。

对于嗅神经元的钙成像,主要的嗅觉上皮细胞可以在神经元解离之前从小鼠解剖。然后可以将解剖的嗅觉上皮转移到解离缓冲液中进行机械解离和酶解。然后可以将解离的神经元接种到盖玻片上,允许通过荧光显微镜检查筛选数千个细胞,并且细胞可以在31℃例如加载钙敏感性染料(Fura-2AM)约30分钟,并转移到显微镜以备筛选。细胞通过在解离的嗅神经元上灌注气味剂(在生理盐水中)的稀释溶液来刺激。响应于恶臭化合物的稀有细胞通过例如用50μm的麝香化合物刺激受体,然后通过监测由Fura-2荧光变化指示的细胞内Ca2+通量来鉴定。分析后,响应细胞可以用吸取微量移液器从玻璃盖玻片获取。然后将分离的细胞汇集成一个样品用于随后鉴定在响应细胞中表达为mRNA的气味剂受体基因。

在一个具体的实施方案中,根据Marko,N.F.等(2005)A robust method for the amplification of RNA in the sense orientation.BMC genomics,6,27;doi:10.1186/1471-2164-6-27(Eberwine method)中一般描述的方法来纯化并扩增嗅神经元的mRNA。使用新一代测序(NGS)对转录组的至少一部分(至多包括整个转录组)进行测序,或使用微阵列技术与已知基因杂交。NGS一般讨论并描述于Metzker,M.L.(2010).Sequencing technologies-the next generation.Nature reviews.Genetics,11(1),31–46;doi:10.1038/nrg262。在一个特定实施方案中,汇集呈现相同响应曲线的最少5个神经元。采取后立即通过细胞裂解来释放mRNA;没有DNA酶没有进行纯化步骤。通过两轮连续的体外转录(IVT)来扩增mRNA。扩增可根据MesageAmpII aRNA试剂盒(Ambion,AMA1751)以如下参数进行:两轮连续14小时的长IVT。

在另一个实施方案中,通过将从分离的激活的嗅觉感觉神经元获得的NGS读数的结果与相同物种的参考基因组序列进行比较来确定麝香嗅觉受体的组或基因家族的身份(例如达到与所采取的神经元的数目一样多)。特别地,推定的麝香受体将是嗅神经元衍生的NGS样品中最高丰度的mRNA或存在于多于一个独立的生物学复制品中。由于嗅觉代码的组合性质(一种化合物激活许多OR,一种OR可以被许多化合物激活),将由给定化合物激活的几个神经元汇集在一起使得几乎所有负责这些分子感知的受体在一个NGS实验中取得。汇集功能上相似的神经元从而极大地提高脱孤产量和速度。

然后使用标准生物信息学工具以在假定同源序列受体保持相似功能的情况下,鉴定与其他推定的哺乳动物(非人类)麝香受体最密切相关的人类气味剂受体。Adipietro等(2012)Functional Evolution of Mammalian Odorant Receptors.PLoS Genet 8(7):e1002821.doi:10.1371/journal.pgen.1002821。可以使用BLASTP和/或BLASTN算法的默认参数。

人类或非人类哺乳动物麝香受体可适用于可用于鉴定激活、模拟、阻断、调节和/或增强麝香化合物活性的化合物的功能测定。特别地,该测定可以是基于细胞的测定或结合测定,并且用于鉴定化合物的方法可以是高通量筛选测定。更具体而言,本文提供了基于受体的测定法,其适合用于发现调节化合物(例如阻断、增强和掩蔽)的化合物文库对受体的高通量筛选。

在一个具体的实施方案中,如下从麝香化合物敏感性细胞中鉴定麝香受体基因序列:将汇集的神经元加热至75℃达10分钟以打破细胞膜并使其mRNA可用于扩增。当使用有限数量的起始材料,通常在5~15个细胞的NGS技术时,此扩增步骤是重要的。根据Eberwine方法(IVT)的线性扩增确保了所表达基因的相对转录水平的维持。使用连续两轮(14h)的体外转录来产生足量的cRNA;然后使用所扩增的cRNA产生Illumina HiSeq cDNA文库。所产生的典型150个碱基对的短序列(通常称为“读数”)与小鼠的参考基因组(例如UCSC版本mm9或mm10)比对以建立这些细胞的完整转录组。转录组数据的定量分析产生转录的气味剂受体基因及其各自表达水平的列表。显示最丰富水平的mRNA(最丰富的“读数”)或存在于一个以上重复实验中的气味剂受体基因被认为是推定的麝香化合物受体。

然后使用预测的小鼠OR基因来挖掘小鼠和人基因组数据库的最新版本,以鉴定小鼠(旁系同源基因)和人(直系同源基因)中最密切相关的受体(即最高序列相似性)。该过程可以使用作为序列相似性搜索工具的BLAST搜索算法(在NCBI网站公开可得)来执行,其中将从初始转录组分析中预先获得的每个推定的基因序列用作查询序列。在假设旁系同源和直系同源基因极有可能具有相似的活性的情况下,从该数据挖掘过程中发现的新鉴定的基因也被认为是潜在的麝香受体。在一个具体的实施方案中,使用以下迭代方案进行序列同源性的成对比较以鉴定小鼠和人类中紧密相关的受体:

旁系同源物=同一物种中的同源物直系同源物=其他物种中的同源物

然后使用多重比对工具比对旁系同源基因以产生系统发生树。功能性体外数据可以根据紧密相关但不同的受体之间的这种系统发生关系来解释。此步骤在鉴定完全OR基因家族中是必不可少的,所述OR基因家族在不同程度上对测试化合物如vulcanolide有响应。

与先前建立的单细胞RT-PCR方法相比,这种方法具有几个主要优点。首先,通过汇集具有相似结合特性的多个神经元,由一个独特的mRNA测序实验(NGS)鉴定几乎所有被目标麝香化合物激活的受体。因此通量比以前达到的要高。其次,因为可以将多个细胞汇集成一个样品,所以这种方法允许通过跨多个实验重复样品的综合比较来选择基因。第三,NGS不需要使用特异于OR的PCR引物。NGS也不需要使用特异于OR的简并引物,后者是有问题的,并且由于非线性或非特异性PCR扩增而常常导致假阳性。特别地,由于OR编码序列位于单个外显子内,因此基因组DNA的样品污染容易导致OR基因序列的非特异性扩增。第四,由于固有的假阳性率,RT-PCR分析难以针对汇集的样本进行。已经使用高密度DNA微阵列芯片进行单细胞mRNA杂交实验。然而,这种方法一般不如NGS敏感,而且还限于需要合成相应DNA探针的已知基因。因此,与标准(例如RT-PCR和微阵列)方法相比,使用NGS显著有利于快速鉴定OR并最终导致候选受体的更准确选择。虽然NGS方法是优选的,但也可以使用其他方法,例如RT-PCR和微阵列方法。

在进一步的实施方案中,为了完成脱孤过程,候选OR基因在体外进一步表达以确认针对用于分离嗅觉感觉神经元和其它结构上相关的感兴趣的化合物的化合物的活性。从分离的嗅神经元中鉴定的对两种麝香化合物都有响应的小鼠受体在其N-末端用短多肽序列(例如Flag(SEQ ID NO:6)、Rho(SEQ ID NO:8;牛视紫红质受体的头20个氨基酸)或Lucy(SEQ ID NO:10)标签)修饰,在HEK 293T细胞中瞬时表达,并用麝香化合物分别刺激以确认其作为真正麝香化合物受体的身份。人Gα亚基Gαolf在这种基于细胞的测定中的共表达激活了Gs转导途径,其在与适当的配体结合后导致内部cAMP增加。或者,人Gα亚基Gα15在基于细胞的测定中的共表达激活了Gq转导途径,其在与适当的配体结合后导致内部Ca2+增加。上述过程和迄今获得的结果有助于验证用于麝香化合物的哺乳动物气味剂受体的快速和可靠鉴定的过程。

定义

除非另有说明,以下术语具有归于它们的含义。

“OR”是指在嗅觉细胞中表达的G蛋白偶联受体家族的一个或多个成员。嗅觉受体细胞也可以基于形态或通过在嗅细胞中特异性表达的蛋白质的表达来鉴定。OR家族成员可能具有作为嗅觉转导受体的能力。

“OR”核酸编码具有7个跨膜区的GPCR家族,所述跨膜区具有“G蛋白偶联受体活性”,例如,它们可响应细胞外刺激而结合G蛋白并通过例如磷脂酶C和腺苷酸环化酶的酶的刺激来促进第二信使例如IP3、cAMP、cGMP和Ca2+

“N末端结构域”区域从N末端开始,延伸到接近第一个跨膜区开始的区域。包含7个“跨膜区”的“跨膜结构域”是指位于质膜内的OR多肽的结构域,也可以包括相应的细胞质(细胞内)和细胞外环。这七个跨膜域和细胞外和细胞质环可以使用例如描述于Kyte&Doolittle,J.Mol.Biol.,157:105-32(1982)或Stryer中的标准方法鉴定。跨膜结构域,特别是G蛋白偶联受体如嗅觉受体的七个跨膜结构域的一般二级和三级结构是本领域已知的。因此,可以基于已知的跨膜结构域序列来设计或预测一级结构序列,如下详细描述。这些跨膜结构域可用于体外配体结合测定,包括可溶相和固相。

在用于测试调节OR家族成员介导的嗅觉转导的化合物的测定法的上下文中的短语“功能性作用”包括确定间接或直接在受体影响下的任何参数,例如功能性、物理和化学作用。它包括配体结合、离子通量的变化、膜电位、电流、转录、G蛋白结合、GPCR磷酸化或去磷酸化、信号转导受体-配体相互作用、第二信使浓度(例如cAMP、cGMP IP3或细胞内Ca.2+),体外、体内和离体,还包括其它生理学效应,例如神经递质或激素释放的增加或减少。

在测定法的上下文中“确定功能性作用”或“确认活性”是指针对化合物的测试法,该化合物增加或减少间接或直接受OR家族成员影响,例如功能性、物理和化学作用的参数。这种功能性作用可以通过本领域技术人员已知的任何方式来测量,例如光谱特性(例如荧光、吸光度、折射率)的变化,流体动力学(例如形状)、色谱或溶解度特性,膜片钳位,电压敏感染料,全细胞电流,放射性同位素外排,诱导型标记,卵母细胞OR基因表达;组织培养细胞OR表达;OR基因的转录激活;配体结合分析;电压、膜电位和电导变化;离子通量分析;细胞内第二信使如cAMP、cGMP和三磷酸肌醇(IP3)的变化;细胞内钙水平的变化;神经递质释放等。

OR基因或蛋白质的“抑制剂”、“激活剂”、“抵消剂”和“调节剂”可互换使用,指的是使用体内、体外和体内的嗅觉转导测定法鉴定的抑制、激活或调节分子,例如配体、激动剂、拮抗剂、增强剂及它们的同系物和模拟物。抑制剂是这样一种化合物,其例如结合、部分或完全阻断刺激、降低、预防、延迟激活、失活、脱敏或下调嗅觉转导,例如拮抗剂。激活剂是这样一种化合物,其例如结合、刺激、增加、开放激活、促进、增强活化、敏化或上调嗅觉转导,例如激动剂。调节剂包括这样一种化合物,其例如改变受体与如下物质的相互作用:结合活化剂或抑制剂的胞外蛋白(例如,气味剂结合蛋白,ebnerin和疏水性载体家族的其他成员);G蛋白;激酶(例如涉及受体的失活和脱敏的视紫红质激酶和β肾上腺素能受体激酶的同系物);和抑制蛋白,其也使受体失活和脱敏。调节剂可以包括例如具有改变的活性的OR家族成员的基因修饰形式,以及天然存在的和合成的配体、拮抗剂、激动剂、小化学分子等。用于抑制剂和激活剂的这种测定法包括例如在细胞或细胞膜中表达OR家族成员,在存在或不存在调味或芳香分子(例如,麝香)的情况下施用推定的调节剂化合物,然后确定对嗅觉转导的功能性作用,如上所述。将包含用潜在的激活剂、抑制剂或调节剂处理的OR家族成员的样品或测定法与没有抑制剂、激活剂或调节剂的对照样品进行比较,以检查调节的程度。对照样品(未用调节剂处理)被赋予100%的相对OR活性值。当相对于对照的OR活性值为约80%、可选的50%或25~0%时,实现对OR的抑制。当相对于对照的OR活性值是110%、可选的150%、可选的200~500%或者1000~3000%那么高时,实现OR的激活。

本文使用的术语“纯化的”、“基本上纯化的”和“分离的”是指不含本发明化合物通常以其天然状态所结合的其他不同化合物的状态,从而“纯化的”、“基本纯化的”和“分离的”物质占给定样品质量按重量计的至少0.5%、1%、5%、10%或20%、并且最优选至少50%或75%。在一个优选实施方案中,这些术语是指占给定样品质量的至少95重量%的本发明化合物。如本文所使用的,当提及一种核酸或蛋白质或多种核酸或蛋白质时,术语“纯化的”、“基本上纯化的”和“分离的”、“分离的”还指纯化或浓缩的状态,其不同于在哺乳动物,尤其是人体内天然存在的状态。任何程度的大于在哺乳动物,尤其是人体内天然存在的程度的纯化或浓缩,包括(1)从其他相关结构或化合物中的纯化,或(2)与通常在哺乳动物,尤其是人体内不结合的结构或化合物的缔合,都在“分离的”意思范围内。本文所述的核酸或蛋白质或核酸或蛋白质类别可以根据本领域技术人员已知的多种方法和过程分离,或以其他方式与事实上通常不结合的结构或化合物相缔合。

如本文所用,当提及核酸或多肽时,术语“分离的”是指一种纯化或浓缩的状态,其不同于在哺乳动物,特别是人体内天然存在的状态。任何程度的大于在体内天然存在的程度的纯化或浓缩,包括(1)从其他天然存在的相关结构或化合物中的纯化,或(2)与通常在体内不结合的结构或化合物的缔合,都在本文使用的“分离的”意思范围内。本文所述的核酸或多肽可以根据本领域技术人员已知的多种方法和过程分离,或以其他方式与事实上通常不结合的结构或化合物相缔合。

如本文所用,术语“进行扩增”和“扩增”是指使用任何合适的扩增方法来产生或检测天然表达的核酸的重组体,如以下详细描述。例如,本发明提供用于在体内或体外扩增(例如通过聚合酶链式反应,PCR)天然表达的(例如,基因组DNA或mRNA)或重组的(例如,cDNA)本发明核酸的方法和试剂(例如特异性简并寡核苷酸引物对)。

术语“7-跨膜受体”是指属于跨膜蛋白超家族的多肽,该蛋白具有跨越质膜七次的七个结构域(因此,这七个结构域被称为“跨膜”或“TM”结构域TM I至TM VII)。嗅觉和某些味觉受体家族都属于该超级家族。7跨膜受体多肽具有相似和特征的一级、二级和三级结构,如下文进一步详细讨论。

术语“核酸”或“核酸序列”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸寡核苷酸。该术语包括含有已知的天然核苷酸类似物的核酸,即寡核苷酸。该术语还包括具有合成骨架的核酸样结构。除非另外指出,否则特定的核酸序列也隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。具体而言,简并密码子取代可以通过产生例如序列来实现,该序列中一个或多个选择的密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用,是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于这样的氨基酸聚合物,其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人造化学模拟物,以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。当关于核酸的部分使用时,术语“异源的”表示核酸包含在自然界中彼此没有发现相同关系的两个或更多个子序列。例如,通常重组产生核酸,其具有来自不相关基因的两个或更多个序列,所述序列被排列以制备新的功能性核酸,例如来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区。类似地,异源蛋白质指示该蛋白质包含在自然界中彼此没有发现相同关系的两个或更多个子序列(例如融合蛋白质)。

“启动子”定义为指导核酸转录的核酸序列阵列。如本文所用,启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列,例如在聚合酶II型启动子的情况下是TATA元件。启动子还可选地包含远端增强子或阻遏子元件,其可以位于距转录起始位点几千个碱基对处。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下具有活性的启动子。术语“可操作地连接”是指核酸表达控制序列(例如启动子或转录因子结合位点阵列)与第二核酸序列之间的功能性连接,其中表达控制序列指导核酸对应于第二序列的转录。

如本文所用,“重组”是指合成的或以其他方式体外操作的多核苷酸(例如“重组多核苷酸”),指使用重组多核苷酸以在细胞或其它生物系统中产生基因产物的方法,或指由重组多核苷酸编码的多肽(“重组蛋白质”)。“重组”还指将具有来自不同来源的各种编码区或结构域或启动子序列的核酸连接到用于表达例如包含本发明的移位结构域和使用本发明的引物扩增的核酸序列的融合蛋白的诱导型或组成型表达的表达盒或载体中。“重组”也指通过细胞的基因组编辑技术如CRISPR/Cas9获得的修饰,所述细胞导致本文所指内源基因(例如受体基因)的稳定或瞬时表达。

术语“表达载体”是指用于在任何细胞(包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞)中体外或体内组成性或诱导性地表达本发明核酸序列的任何重组表达系统。该术语包括线性或循环表达系统。该术语包括保持附加型或整合到宿主细胞基因组中的表达系统。表达系统可以具有自我复制或不复制的能力,即仅驱动细胞中的瞬时表达。该术语包括重组表达“只含有重组核酸转录所需的最少元件的表达盒”。

“宿主细胞”是指含有表达载体并支持表达载体复制或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞例如大肠杆菌,或真核细胞例如酵母、昆虫、两栖类或哺乳动物细胞例如CHO、HeLa、HEK-293等,例如培养的细胞、外植体和体内细胞。

以下列出了本文鉴定和/或使用的核酸和氨基酸序列:

小鼠Olfr96(SEQ ID NO:1DNA;SEQ ID NO:2蛋白质)

SEQ ID NO:1

atgggaatcctttccacaggaaatcaaactgtcactgagtttgtacttcttggtttccatgaagtccctgggctgcacctcctgtttttttctgtgttcaccatcctctatgcctccatcatcacagggaacatgctcattgcagtggtggtggtgagctcccagaggcttcacacacccatgtatttctttctggtgaatctgtccttcatagagattgtctatacctccacagtggtgcccaaaatgctggaaggcttcttacaggaggccaccatatctgtggctggctgcttgctccagttctttgtttttggctctctggccacagatgagtgttttctgctggctgtgatggcatatgatcgatatctcgcaatttgtcaccctctacgatacccacacctcatggggcctcaatggtgcctggggttggtgctcacagtctggctgtctggcttcatggtagatggactagttgttgctctgatggcccagttgagattctgtggccccaacttagttgatcacttttactgtgatttttcacctttgatggtcctggcttgctcagatacccaagtggcccaggtgactacatttgttctctctgtggtcttcctgactgtcccctttgggctggttctgatctcctatgctcagattgtagtgactgtgctgagagttccttctgggaccagaagaaccaaggccttctccacatgctcctctcacctggctgtggtgtccacgttctatggaacactcatggtattgtacattgtgccctctgctgttcattctcagctcctctccaaggtcattgccctgctctacacagtggtcactcccatcttcaaccctgtcatctacaccttgaggaaccaggaggtgcagcaggcactaagaaggcttctctactgcaaaccaactgaaatgtga

SEQ ID NO:2

mgilstgnqtvtefvllgfhevpglhllffsvftilyasiitgnmliavvvvssqrlhtpmyfflvnlsfieivytstvvpkmlegflqeatisvagcllqffvfgslatdecfllavmaydrylaichplryphlmgpqwclglvltvwlsgfmvdglvvalmaqlrfcgpnlvdhfycdfsplmvlacsdtqvaqvttfvlsvvfltvpfglvlisyaqivvtvlrvpsgtrrtkafstcsshlavvstfygtlmvlyivpsavhsqllskviallytvvtpifnpviytlrnqevqqalrrllyckptem

人OR11A1(SEQ ID NO:3DNA;SEQ ID NO:4蛋白质)

SEQ ID NO:3

atggaaattgtctccacaggaaacgaaactattactgaatttgtcctccttggcttctatgacatccctgaactgcatttcttgttttttattgtattcactgctgtctatgtcttcatcatcatagggaatatgctgattattgtagcagtggttagctcccagaggctccacaaacccatgtatattttcttggcgaatctgtccttcctggatattctctacacctccgcagtgatgccaaaaatgctggagggcttcctgcaagaagcaactatctctgtggctggttgcttgctccagttctttatcttcggctctctagccacagctgaatgcttactgctggctgtcatggcatatgaccgctacctggcaatttgctacccactccactacccactcctgatggggcccagacggtacatggggctggtggtcacaacctggctctctggatttgtggtagatggactggttgtggccctggtggcccagctgaggttctgtggccccaaccacattgaccagttttactgtgactttatgcttttcgtgggcctggcttgctcggatcccagagtggctcaggtgacaactctcattctgtctgtgttctgcctcactattccttttggactgattctgacatcttatgccagaattgtggtggcagtgctgagagttcctgctggggcaagcaggagaagggctttctccacatgctcctcccacctagctgtagtgaccacattctatggaacgctcatgatcttttatgttgcaccctctgctgtccattcccagctcctctccaaggtcttctccctgctctacactgtggtcacccctctcttcaatcctgtgatctataccatgaggaacaaggaggtgcatcaggcacttcggaagattctctgtatcaaacaaactgaaacacttgattga

SEQ ID NO:4

meivstgnetitefvllgfydipelhflffivftavyvfiiignmliivavvssqrlhkpmyiflanlsfldilytsavmpkmlegflqeatisvagcllqffifgslataeclllavmaydrylaicyplhypllmgprrymglvvttwlsgfvvdglvvalvaqlrfcgpnhidqfycdfmlfvglacsdprvaqvttlilsvfcltipfgliltsyarivvavlrvpagasrrrafstcsshlavvttfygtlmifyvapsavhsqllskvfsllytvvtplfnpviytmrnkevhqalrkilcikqtetld

Flag标记(SEQ ID NO:5DNA;SEQ ID NO:6蛋白质)

SEQ ID NO:5

gattacaaggacgacgacgataag

SEQ ID NO:6

dykddddk

Rho标记(SEQ ID NO:7DNA;SEQ ID NO:8蛋白质)

SEQ ID NO:7

atgaacgggaccgagggcccaaacttctacgtgcctttctccaacaagacgggcgtggtg

SEQ ID NO:8

mngtegpnfyvpfsnktgvv

Lucy标记(SEQ ID NO:9DNA;SEQ ID NO:10蛋白质)

SEQ ID NO:9

atgagaccccagatcctgctgctcctggccctgctgaccctaggcctggct

SEQ ID NO:10

mrpqillllalltlgla

以下实施例仅是说明性的,并不意味着限制在发明内容、说明书或权利要求书中提出的发明范围。

实施例

实施例1

多环麝香受体小鼠Olfr96和人OR11A1的鉴定。

分离麝香响应细胞并进一步处理以用于基于下一代测序(NGS)的转录组分析。制备了开司米木麝香、吐纳麝香和佳乐麝香的混合物(混合物A)。还制备了麝香酮、麝香烯酮和环十五烯内酯的混合物(混合物B)。每种单独的麝香以50μM的最终浓度混合。记录由混合物A和/或混合物B激活的不同的嗅觉感受神经元(OSN)的Ca2+成像迹线。图1A的Y轴显示相对荧光单位的平均强度,作为比例340/380nm Ca2+成像记录的结果。图1A的X轴显示了时间帧(8s/帧)。汇集响应细胞进行RNA提取和随后的下一代测序实验(即RNAseq)。所有表达水平进一步标准化为嗅觉标记蛋白(OMP)。所得到的转录组分析的分析揭示了最高度表达的气味剂受体(即最丰富的读数,通过FPKM标准化):Olfr235和Olfr96(图1B)。它们分别对应于以下人直系同源基因:OR5AN1和OR11A1。

实施例2

小鼠Olfr96和人OR11A1麝香受体的功能特征

进行功能性剂量响应实验以评估修饰细胞系的功能活性水平。使用基于细胞的测定法,在HEK293T细胞系中测试小鼠Olfr96,该细胞系中内源性RTP1基因已被激活并且气味剂受体伴侣蛋白已经表达。Flag-Rho-标记的受体基因与嗅觉规范G-蛋白Golf基因共转染,并且暴露于增加浓度的麝香气味剂吐纳麝香、Vulcanolide和麝香酮中。通过使用基于HTRF的试剂盒(CisBio,cAMP dynamic 2试剂盒,62AM4PEJ)测量胞质溶胶中的cAMP增加来检测气味剂诱导的活性。对于两种多环麝香(吐纳麝香和Vulcanolide),观察到Olfr96受体活性的剂量依赖性增加,但是对于大环麝香、麝香酮则没有观察到(图2)。在使用相同条件的另外的重复实验中,将小鼠Olfr96和相应的人直系同源物OR11A1与麝香多样性集合一式两份地一起进行测试以进行特异性评估。将Lucy-Flag-Rho标记的受体基因与嗅觉规范G-蛋白Golf基因共转染,并暴露于增加浓度的大环麝香气味剂麝香烯酮、麝香酮、环十五烯内酯和环十五内酯;多环麝香气味剂吐纳麝香、Vulcanolide、开司米木麝香、佳乐麝香;脂环麝香气味剂海佛麝香、葵子麝香和罗曼麝香;和硝基麝香气味剂麝香C和麝香X。对于三种多环麝香(吐纳麝香、开司米木麝香和Vulcanolide)和硝基麝香(麝香X),观察到Olfr96受体活性的剂量依赖性增加,但是对于麝香C、佳乐麝香、大环麝香或脂环麝香则没有观察到(图3);对于一种多环麝香(Vulcanolide),观察到OR11A1受体活性的剂量依赖性增加,但是对于大环麝香、脂环麝香或硝基麝香或其他多环麝香则没有观察到(图3)。

实施例3

增强麝香受体激活的化合物的鉴定。

将麝香受体暴露于已知麝香化合物和待评价化合物的二元混合物。测量由化合物提供的“麝香”受体活性的任何增强。这是通过在存在和不存在增强受体活性的特定化合物的情况下进行麝香剂量响应测量来完成的。使用与实施例2中相同的基于细胞的测定法。如果该化合物增强受体活性,则减少在不存在该化合物的情况下达到相当水平的受体活化所需的麝香化合物的浓度。典型地,这是通过剂量响应实验完成的,并且用剂量响应曲线来说明,所述剂量响应曲线例如通过曲线的向左移位和所计算的EC 50值的减小来显示或指示。

再多了解一些
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