本申请涉及用于分析靶核酸的方法和试剂盒，并且更具体地涉及使用引物和使用膜检测和分析核酸的方法和试剂盒，所述引物包含(i)与靶核酸互补的结合区和(ii)包含与靶核酸非互补的核苷酸的核酸寡聚体，以及(iii)带有标记的引物，所述膜具有固定于其上的与核酸寡聚体互补结合的探针。
背景技术：
：：分子诊断在各个诊断领域，包括传染病诊断、癌症诊断、遗传疾病诊断和个性化诊断领域，用于检测疾病的基本原因，诸如dna或rna分子。典型的分子诊断技术是用于在短时间内扩增dna的pcr技术(saiki,r.,et.al.primer-directedenzymaticamplificationofdnawithathermostablednapolymerase.science239,487-91.1998)。然而，在一般pcr技术中，应该使用电泳来确认扩增的dna。在所述电泳前，应该进行复杂的操作，其包括制作琼脂糖凝胶和使用etbr等染色dna。由于此原因，电泳不适合在临床实验室中使用。最近使用的实时pcr技术基于荧光，并且因此不需要电泳，但是因为使用昂贵的仪器和昂贵的荧光试剂而具有缺陷(higuchi,r.,et.al.,kineticpcranalysis:real-timemonitoringofdnaamplificationreactions.naturebiotechnology11,1026-1030,1993)。此外，这些技术具有的缺点在于，因为要使用的荧光波长受限，所以实际上难以对五种或更多种样品进行多重pcr。由于这些原因，在实验室中通过使用pcr技术进行便宜的临床测试具有许多困难，并且因此pcr技术主要用于大型医院，诸如大学医院。近年来，已经开发并上市了用于现场诊断(on-sitediagnosis)的genexpert系统和试剂(cepheid)。然而，这些系统和试剂非常昂贵，并且因此几乎不用于一般临床测试(helb,d.,et.al.,rapiddetectionofmycobacteriumtuberculosisandrifampinresistancebyuseofon-demand,near-patienttechnology.j.clin.microbiol.48,229-237,2010)。其他技术包括在pcr后使用膜代替凝胶电泳(核酸侧向流动测定)进行的核酸侧向流动测定(lateralflowassay)(aveyard,j.,et.al.,onestepvisualdetectionofpcrproductswithgoldnanoparticlesandanucleicacidlateralflow(nalf)device.chem.commun.,41,4251-4253,2007)。然而，这种核酸侧向流动测定比凝胶电泳技术更复杂，并且因此不可能用于实验室。此外，因为具有认为应该使用附着于膜的探针的序列以便其可与pcr扩增产物特异性结合的技术局限，所以限制了核酸侧向流动测定的普遍使用。在此技术背景下，本申请的发明人发现，当允许人工合成的pcr引物中的核酸寡聚体与在膜上与核酸寡聚体互补的探针反应而不管扩增产物的类型时，各种pcr产物普遍可使用单一类型的膜鉴别，从而完成本申请。在
背景技术：
：部分公开的信息仅用于增强理解本申请的背景，并且因此可能不含形成本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。技术实现要素：技术问题本申请的发明人认识到上述发生在本领域中的问题，并且本申请的目的是提供用于检测和分析多种靶核酸的通用方法，其可以比常规电泳法更准确和更简单的方式分析由扩增靶核酸而产生的扩增核酸，并且其可同时鉴别多种靶核酸，以及用于所述方法的试剂盒。技术方案为了实现上述目的，本申请提供了用于检测靶核酸的方法，其包括以下步骤：(a)通过使包含靶核酸的样品与引物反应而扩增靶核酸，所述引物包含(i)与靶核酸互补的结合区和(ii)包含与靶核酸非互补的核苷酸的核酸寡聚体，以及(iii)带有标记的引物；(b)使步骤(a)中扩增的产物与膜反应，所述膜具有固定于其上的与所述核酸寡聚体互补的探针；以及(c)确认反应是否由标记显示，以检测所述靶核酸是否会被扩增。本申请还提供了用于检测靶核酸的试剂盒，其包含：(a)引物，其包含(i)与靶核酸互补的结合区和(ii)包含与靶核酸非互补的核苷酸的核酸寡聚体，以及带有标记的引物；和(b)膜，其具有固定于其上的与核酸寡聚体互补结合的探针。附图说明图1显示根据本申请的实施方案的用于检测核酸扩增产物的方法。图2显示根据本申请的实施方案的通过侧向流动测定检测和分析靶核酸的通用技术。图3显示通过根据本申请的实施方案的检测靶核酸扩增产物的方法分析hpv16和hpv18靶核酸扩增产物的结果。具体实施方式除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。通常，以下将描述的本文所使用的命名和实验方法是本领域中众所周知和通常使用的那些。一方面，本申请涉及用于检测靶核酸的方法，其包括以下步骤：(a)通过使包含靶核酸的样品与引物反应而扩增靶核酸，所述引物包含(i)与靶核酸互补的结合区和(ii)包含与靶核酸非互补的核苷酸的核酸寡聚体，和(iii)带有标记的引物；(b)使步骤(a)中扩增的产物与膜反应，所述膜具有固定于其上的与所述核酸寡聚体互补的探针；以及(c)确认反应是否由标记显示，以检测所述靶核酸是否会被扩增。在分子诊断中最频繁使用的方法基于聚合酶链式反应(pcr)。此方法是用于在几个小时内扩增微量的特定dna的技术，并且与免疫诊断的敏感性相比，其敏感性可急剧增加。然而，一般pcr技术不方便，因为扩增产物应当通过凝胶上的电泳确认。近年来，已经使用基于荧光的实时pcr技术，但是这些技术需要复杂且昂贵的系统和昂贵的pcr试剂，并且因此难以用于一般实验室。因此，本申请提供一种技术，其中，以比常规电泳法更准确和更简单的方式分析由扩增靶核酸(包括pcr)产生的扩增基因。根据本申请的用于检测靶核酸的方法包括(a)合成引物，其包含(i)与靶核酸互补的结合区和(ii)包含与靶核酸非互补的核苷酸的核酸寡聚体，和(iii)带有标记的引物，以及使靶核酸与合成的标记引物反应，从而扩增靶核酸。为了通过pcr扩增靶基因(核酸)，将大约10-40bp、优选大约20-30bp的包含与靶核酸非互补的核苷酸，即不与靶核酸连接的基因的核酸寡聚体，加入至引物，并且使用合成引物扩增靶基因。然后，在膜上固定大约10-40bp，优选大约20-30bp的与核酸寡聚体互补的探针，并且将探针杂交至靶核酸。将大约10-40bp、优选20-30bp的核酸寡聚体加入至用于一般多重pcr检测的引物末端，并且将使用引物获得的扩增产物与膜上的互补探针寡聚体反应，由此可以确定靶核酸是否会被扩增。这使得同时诊断几种疾病成为可能。即，当使用具有几种至几十种不同的寡聚体序列进行多重pcr，然后允许pcr扩增产物和与寡聚体序列互补的探针反应时，几种至几十种扩增产物可使用单一侧向流动膜(lateralflowmembrane)鉴定。因此，因为侧向流动膜通常可以用于各种多重pcr测定，所以可产生来自侧向流动膜的大量结果。这表明各种扩增产物可使用单一侧向流动膜鉴定。即，因为扩增产物可使用相同膜确认而不管pcr扩增产物种类如何，所以可容易实现生产成本降低和质量控制，从而增加产物生产率。分析核酸扩增产物使hpv16和18能够被同时诊断的方法的实施方案在以下实施例1中描述。在此情况下，核酸寡聚体可包含一个或多个选自seqidno:1至3的序列。根据本申请的检测靶核酸的方法包括步骤(b)：使步骤(a)中扩增的产物与其具有固定于其上的与核酸寡聚体互补结合的探针的膜反应。在步骤(b)中，可将步骤(a)的扩增产物注射至膜的侧面，使扩增产物中的核酸寡聚体可与固定在膜上的探针互补杂交，同时扩增产物移动。分析核酸扩增产物使hpv16和18能够被同时诊断的方法的实施方案在以下实施例1中描述。在此情况下，与核酸寡聚体互补结合的探针可包含一个或多个选自seqidno:10至12的序列。在备选的实施方案中，步骤(b)的探针可另外包含用于固定在膜上的核酸寡聚体，并且探针可进一步包含10-40bp具有重复核苷酸序列的寡聚体。分析核酸扩增产物使hpv16和18能够被同时诊断的方法的实施方案在以下实施例1中描述。在此情况下，另外的核酸寡聚体可包含seqidno:13的序列。根据本申请的用于检测靶核酸的方法包括步骤(c)：确认标记是否会生色，从而检测靶核酸是否会被扩增。在一个实施方案中，所述标记可以是生物素、cy5、cy3、fitc、edans(5-(2'-氨基乙基)氨基-1-萘磺酸)、四甲基罗丹明(tmr)、四甲基罗丹明异氰酸酯(tmritc)、x-罗丹明、dig或抗体，但不限于此。此外，可在步骤(c)中加入与引起标记的生色信号的结合剂的反应，以确认生色或荧光信号并检测靶核酸的扩增。在此情况下，所述结合剂可以是链霉亲和素，但不限于此。当使用其上附着生物素的引物进行扩增时，生物素可结合膜上的链霉亲和素。根据珠子附着于链霉亲和素的趋势，可通过在金颗粒的情况下的生色信号确认，或可通过具有各种波长的荧光信号确认靶核酸扩增。依据附着于膜的探针种类，可检测几种至几十种靶核酸。在另一方面，本申请涉及用于检测靶核酸的试剂盒，其包含：(a)引物，其包含(i)与靶核酸互补的结合区和(ii)包含与靶核酸非互补的核苷酸的核酸寡聚体，以及带有标记的引物；和(b)膜，其具有固定于其上的与核酸寡聚体互补结合的探针。试剂盒根据使用目的可进行各种配置，并且其可用于检测或鉴定扩增的靶核酸。根据使用目的，本申请的试剂盒可任选包含用于进行核酸扩增pcr反应的试剂，诸如聚合酶、缓冲液和脱氧核糖核苷酸-5-三磷酸。在一些实施方案中，本申请的试剂盒还可进一步包含各种多核苷酸分子，以及各种缓冲液和试剂。试剂盒中用于特定反应的试剂、缓冲液或反应物的最佳量可由本领域技术人员确定，并且试剂盒可制造为独立的包装或隔室，其如上所述含有步骤(a)的引物和步骤(b)的其具有固定于其上的探针的膜。实施例以下，将参考实施例进一步详细描述本申请。对本领域普通技术人员将显而易见的是，这些实施例仅用于说明目的，并且不被解释为限制本申请的范围。1.设计hpv16和18的同时诊断hpv(人乳头瘤病毒)是一种引起宫颈癌的病毒，并且已经报道了大约100种hpv类型。在这些hpv类型中，已知hpv16和hpv18属于高风险组，并且与宫颈癌密切相关(walboomers,j.,et.al.,humanpapillomavirusisanecessarycauseofinvasivecervicalcancerworldwide.thejournalofpathology189,12-19,1999)。为了同时诊断hpv16和hpv18，使用对hpv16和hpv18具有特异性的基因，并且使用存在于所有人类细胞中的β-球蛋白基因作为对照，并且同时扩增三种基因。用于pcr的引物序列示于下表1。各引物由用于扩增各基因的区和探针可结合的区组成。表1此外，附着于侧向流动膜并且与pcr扩增产物反应的探针序列示于下表2。为了促进各引物结合区与膜的结合，各探针序列包含10-30个寡胸腺嘧啶。表22.电泳结果与侧向流动膜检测结果之间的比较进行多重pcr，然后在1.5％琼脂糖凝胶上电泳10μl的pcr产物30分钟，并且分析结果。与此同时，使10μl的pcr产物在侧向流动膜上反应15分钟，并且分析结果。图3显示电泳结果与侧向流动膜检测结果之间的比较。如图3可见，两种测定方法显示相同的结果。工业实用性如上所述，在根据本申请的用于检测靶核酸的方法和用于检测靶核酸的试剂盒中，与人工合成的引物互补的探针被固定在膜上，使得可检测靶核酸的扩增产物，而不管其序列如何，这表明各种扩增产物可使用单一膜鉴定。与其中引物和探针之间一对一反应的常规技术不同，根据本申请的方法和试剂盒可普遍用于各种扩增产物。因此，通用膜可代替应该分别用于各靶核酸的膜使用。这表明通用膜可以增加的生产率生产。尽管已经参考具体特征详细描述了本申请，对本领域技术人员将显而易见的是，说明书仅针对优选的实施方案，并不限制本申请的范围。因此，本申请的实质范围将通过所附权利要求及其等同物来定义。文本文件参见所附序列表。序列表<110>和平基因生物有限公司朴荣石<120>用于检测靶核酸的方法和试剂盒<130>pf-b1954<140>pct/kr2016/005194<141>2016-05-17<150>10-2015-0071945<151>2015-05-22<160>13<170>patentinversion3.5<210>1<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>引物的探针结合区<400>1cgaggacgacgaggactcccaccag25<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>引物的探针结合区<400>2cgaggtaggcacgcagctccaccag25<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>引物的探针结合区<400>3cgaggtaccctggctgctgcaccag25<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>靶互补结合区<400>4tcgatgtatgtcttgttgcag21<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>5aggttacaatattgtaatgggc22<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>靶互补结合区<400>6aacatagctgggcactatag20<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>7catacacaacattgtgtgacg21<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>靶互补结合区<400>8gaagagccaaggacaggtac20<210>9<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>9tggtctccttaaacctgtcttg22<210>10<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>探针的引物结合区<400>10cgaggacgacgaggactcccaccag25<210>11<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>探针的引物结合区<400>11cgaggtaggcacgcagctccaccag25<210>12<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>探针的引物结合区<400>12cgaggtaccctggctgctgcaccag25<210>13<211>15<212>dna<213>人工序列<220><223>用于固定在膜上的探针的寡聚体<400>13ttttttttttttttt15当前第1页12当前第1页12