一种人类疱疹病毒4型检测试剂盒及检测方法与流程

文档序号:12413198阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种人类疱疹病毒4型检测试剂盒,包括核酸释放剂、含磁珠的核酸提取液和PCR反应液,其特征在于,所述核酸释放剂包括0.1~0.3mg/ml表面活性肽、0.01~0.05mg/ml醋酸氯己定、2~6%氯化钾(w/v)和0.1~2%的亲水石墨烯(w/v);所述含磁珠的核酸提取液包括100~300mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸、100~300mmol/L氯化钠和100~400μg/ml磁珠;所述PCR反应液包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。

2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述核酸释放剂包括0.2mg/ml表面活性肽、0.03mg/ml醋酸氯己定、4.5%氯化钾(w/v)和1.2%的亲水石墨烯(w/v),所述含磁珠的核酸提取液包括200mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸、200mmol/L氯化钠和250μg/ml磁珠。

3.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述用于靶多核苷酸扩增的上游引物序列为5’-TGCAGCTTTGACGATGGAGTAG-3’,下游引物序列为5’-TCACTCCTGCCCTTCCTCAC-3,所述用于靶多核苷酸检测的探针序列为5’-FAM-TTTGCCTCCCTGGTTTCCACCTATG-BHQ1-3’。

4.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述亲水石墨烯由以下步骤制得:

取经过透析处理,已除去残留离子的Hummers法制备的氧化石墨,配制成0.2~0.8mg/ml的水溶液,按氧化石墨:六次甲基四胺为2∶1~1∶2的质量比加入六次甲基四胺,100℃搅拌回流反应8~12h,得到分散均匀的亲水石墨烯分散系。

5.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括内标、核酸洗脱液、磁珠洗涤液、EBV阴性对照、EBV阳性对照、EBV定量参考品、磁珠分散剂和酶混合液。

6.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述磁珠分散剂包括氨基酸0.06~2份、乙酸0.5~2份和羧甲基葡聚糖2~5份。

7.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述核酸洗脱液含有0.8~1.2mol/LTris-HCl、0.1~1.0mol/LEDTA;所述磁珠洗涤液包含0.1~1.0%曲拉通(v/v)、100~300mmol/L氯化钠;所述酶混合液中包含Taq聚合酶和0.5~2U/μl的UNG酶。

8.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述内标的序列为5-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACCTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3。

9.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述PCR反应液还包括用于内标检测的上游引物、下游引物和探针;所述内标上游引物序列为5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAG-3’,所述内标下游引物序列为5’-CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3’,所述内标探针的序列为5’-HEX-TTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAA–BHQl-3’。

10.一种利用如权利要求1~9任一所述的试剂盒检测人类疱疹病毒4型的方法,其特征在于,包括以下步骤:

A)裂解病毒:取四个离心管,分别加入5~10μl核酸释放剂和10~15μl待测样本、5~10μl核酸释放剂和6~10μl EBV阴性对照、5~10μl核酸释放剂和6~10μl EBV阳性对照以及5~10μl核酸释放剂和6~10μl EBV定量参考品,做好标记,充分混合均匀,于室温下放置3~5min,备用;

B)磁珠吸附:往上述4个离心管中均加入含磁珠的核酸提取液和内标,离心,用磁珠分离器进行固液分离,此时离心管壁上的固体含磁珠和核酸,加入磁珠洗涤液,再次离心,用磁珠分离器进行固液分离,此时离心管壁上的固体含磁珠和核酸;

C)核酸洗脱:往上述离心管中加入核酸洗脱液和分散剂,使得磁珠和核酸分开,离心,分离磁珠,保留离心管中的液体;

D)PCR荧光分析:按照待测样本、EBV阴性对照、EBV阳性对照、EBV定量参考品的数量配制PCR反应液,将经步骤C)处理后的待测样本、EBV阴性对照、EBV阳性对照和EBV定量参考品分别与PCR反应液和酶混合液混合后加入到PCR反应板的各孔中,去除气泡后盖好封膜,1000~3000rpm/min离心30s,用于荧光分析。

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