一步法实时定量荧光PCR检测香石竹斑驳病毒的方法与流程

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本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及香石竹斑驳病毒的定量检测方法。

背景技术：

香石竹(Dianthus caryophyllus L.)是国内栽培面积最大、最为普遍的切花，也是出口创汇最多的一种花卉。但由于受到病毒病的影响，香石竹的产量、质量不断下降，主要表现在植株矮小、畸形、花叶坏死、花朵变小、开裂、花碎色等。并且由于香石竹斑驳病毒可在香石竹中累积，防控非常困难。因此，香石竹斑驳病毒的检测对于防控香石竹斑驳病毒病显得十分重要。目前，国内外香石竹斑驳病毒的检测方法多以蛋白为基础的检测(或血清学试验)方法和以核酸为基础的分子检测方法，分子检测方法较传统检测方法更为快速、灵敏和准确。

实时荧光定量PCR是近年来发展起来的一种实时定量检测特定核酸技术，与普通PCR相比，具有定量准确、快速、灵敏度高、特异性强等特点，目前该项技术已被广泛地应用于生命科学研究的各个领域。从原理上包括两类荧光模式：一类是荧光杂交探针，如Taqman、分子信号等，基于能量共振转移的原理(FRET)；另一类为DNA结合染料，主要为SYBRGreen I。第一种方法特异性好，需合成特异引物和Taqman荧光探针。后一种方法只需合成特异性引物，但该方法易受引物二聚体的影响，特异性低于前一种方法。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种能快速、可靠的检测出香石竹斑驳病毒，并可对所含病毒进行一步法实时定量荧光PCR检测香石竹斑驳病毒的方法。

本发明的的技术方案如下：

1.一组用于一步法实时定量荧光PCR检测香石竹斑驳病毒的特异性引物和探针，所述特异性引物为香石竹斑驳病毒特异性引物，所述香石竹斑驳病毒特异性引物由香石竹斑驳病毒特异性扩增正向引物和香石竹斑驳病毒特异性扩增反向引物组成，所述香石竹斑驳病毒特异性扩增正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，香石竹斑驳病毒特异性扩增反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，所述探针为香石竹斑驳病毒特异性检测Taqman探针，所述香石竹斑驳病毒特异性检测Taqman探针的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，在所述香石竹斑驳病毒特异性检测Taqman探针的5'端标记有FAM报告荧光集团，3'端标记有BHQ淬灭荧光集团。

2.一步法实时定量荧光PCR检测香石竹斑驳病毒的方法，包括以下步骤：

(一)标准品的制备及其标准曲线的建立

(1)提取被香石竹斑驳病毒感染的香石竹组培苗总RNA，将提取的总RNA反转录合成cDNA；

(2)标准品目标基因香石竹斑驳病毒CP基因全长的克隆及测序验证

以步骤(一)(1)反转录合成的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如下：

10×PCR含20mM的Mg²⁺缓冲液5.0μl，5U/μL ExTaq DNA聚合酶0.5μl，2.5μM dNTP 1.0μl，20μM扩增香石竹斑驳病毒CP全长基因正向引物1.5μl，20μM扩增香石竹斑驳病毒CP全长基因反向引物1.5μl；cDNA模板4.0μl，ddH₂O 36.5μl，总体积50.0μl；所述扩增香石竹斑驳病毒CP全长基因正向引物的碱基序列如SEQ ID：1，扩增香石竹斑驳病毒CP全长基因反向引物的碱基序列如SEQ ID：2；

PCR反应的条件：94℃预变性4min后，进行30个循环扩增，每个循环为94℃变性1min，56℃复性1min，72℃延伸1min；30个循环扩增后72℃灭活反应10min；

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物的电泳检测鉴定后选择片段大小为1047bp的片段进行切胶回收，回收的片段于4℃过夜连接T-A克隆载体，通过加入氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序分析，鉴定出DNA片段正向T-A克隆插入载体的阳性重组质粒；将筛选出的阳性重组质粒重新转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落、使用LB液体培养基进行扩繁，离心收集培养的菌体，对菌体进行质粒提取、纯化，对纯化后的阳性重组质粒线性化及脱盐纯化；

纯化后的阳性重组质粒通过SmaI酶切进行线性化处理，具体线性化处理反应步骤如下：

10×buffer 5μL，限制性内切酶SmaI 1μL，阳性重组质粒DNA 2μg，加水至50μl，25℃酶切16h；取1μL反应液电泳，酶切，65℃温育10min中止反应；

将经线性化的阳性重组质粒DNA，进行脱盐纯化，将脱盐纯化的阳性重组质粒DNA用NanoDrop ND-2000核酸蛋白测定仪测定OD260nm/OD 280nm吸光值，测定得到阳性重组质粒DNA浓度；

(3)标准品目标基因香石竹斑驳病毒CP基因的体外转录

采用体外转录方法对阳性重组质粒DNA进行体外转录，一个标准的体外转录反应为总体积100μl，在室温下，按如下顺序加样制备下列反应体系：

①T7 Transcrition 5×Buffer 20μl；

②25mM ATP，CTP，GTP，UTP各7.5μl；

③线性化的重组质粒DNA 5μg；

④T7 Enzyme Mix 10μl；

⑤DEPC水加至100μl混匀后，37℃恒温反应2～4h，得标准品目标基因CP基因的体外转录总RNA；

(4)标准品目标基因香石竹斑驳病毒CP基因的体外转录总RNA浓度测定及标准品的制备

用NanoDrop ND-2000核酸蛋白测定仪测定标准品目标基因香石竹斑驳病毒CP基因的体外转录总RNA浓度，根据以下公式计算其拷贝数：

拷贝数＝标准品RNA质量浓度×阿氏常数/ssRNA分子量，拷贝数单位是copies/μl，标准品RNA质量浓度单位是ng/μl，其中，阿氏常数为6.02×10²³，ssRNA分子量＝一个碱基对的分子质量×片段长度，一个碱基对分子质量为345道尔顿/碱基；

(5)标准曲线的制作

用EASY dilution对标准品目标基因香石竹斑驳病毒CP基因的体外转录总RNA进行梯度稀释，配制拷贝数为2×10²-2×10⁶copies阳性ssRNA制作标准曲线。

标准品的一步法实时定量荧光PCR检测反应体系为20μl：其中2×RT-PCR Buffer III 10μl，5U/μl Ex Taq HS 0.4μl，RT Enzyme Mix II 0.4μl，香石竹斑驳病毒特异性扩增正向引物0.4μl，香石竹斑驳病毒特异性扩增反向引物0.4μl，香石竹斑驳病毒特异性检测Taqman探针0.8μl，所得标准品稀释后的2×10²-2×10⁶copies阳性ssRNA 2μl，用RNase Free dd H₂O定容至20μl；

所述香石竹斑驳病毒特异性扩增正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，香石竹斑驳病毒特异性扩增反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，所述香石竹斑驳病毒特异性检测Taqman探针的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，在所述香石竹斑驳病毒特异性检测Taqman探针的5'端标记有FAM报告荧光集团，3'端标记有BHQ淬灭荧光集团；

所述标准品的一步法实时定量荧光PCR检测的PCR反应程序为：42℃反转录5min后；40个循环扩增，每个循环扩增为95℃变性10s，95℃10s，60℃30s，稀释浓度均能产生荧光信号，Ct值分别为27.41，24.59，21.22，17.77，14.29；由扩增曲线得到的标准曲线斜率为-3.307，标准曲线Y＝-3.307X+34.285，R²＝0.998；

(二)待测样品的一步法实时定量荧光PCR检测

(1)待测样品为香石竹叶片，提取待测样品总RNA

(2)待测样品总RNA浓度的测定

利用NanoDrop ND-2000核酸蛋白测定仪准确测定样品总RNA浓度；

(3)待测样品的一步法实时定量荧光PCR检测，

所述待测样品的一步法实时定量荧光PCR检测的PCR反应体系除将步骤(一)(5)所述标准品的一步法实时荧光PCR检测PCR反应体系中所述的标准品目标基因香石竹斑驳病毒CP基因的体外转录总RNA 2μl替换为步骤(二)(2)所得的待测样品的总RNA 2μl外，其PCR反应体系中的其余成分及浓度和用量与步骤(一)(5)所述标准品的一步法实时荧光PCR检测的PCR反应体系相同；待测样品的一步法实时定量荧光PCR反应程序与步骤(一)(5)所述标准品的一步法实时荧光PCR检测的PCR反应程序相同，得到待测样品Ct值，根据(一)(5)所得标准曲线进行待测样品拷贝数计算。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1、本发明设计的香石竹斑驳病毒的实时定量PCR检测的引物及Taqman荧光探针，克服了现有分子检测方法操作复杂或检测灵敏度不高、或特异性不强、或重复性不强的缺陷，本发明的特异性强，对的香石竹斑驳病毒检测灵敏度为2×10²-2×10⁶copies/μl，建立了标准品扩增曲线及标准曲线后，只需按常规方法提取待测样品的总RNA，采用本发明的特异性引物和探针，采用本发明的一步法实时定量PCR反应，即能准确判断出待测样品是否感染了香石竹斑驳病毒，及所感染的香石竹斑驳病毒含量。其检查方法操作简便、准确可靠、快速、重复性好。

2、本发明建立的一种新的一步法实时定量荧光PCR检测香石竹斑驳病毒的方法技术平台，不仅对香石竹斑驳病毒的新检测方法的发展具有重要的理论意义，而且对提升香石竹斑驳病毒病原检测水平，防止香石竹斑驳病毒危险病原微生物传入我国具有重要的实践意义和应用前景。

3、本发明方法适合于口岸检验检疫，农业生产、植物保护、科研单位等部门使用，具有广泛的应用前景和科研价值。

序列表中SEQ ID NO：1所示的是扩增香石竹斑驳病毒CP全长基因正向引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：2所示的是扩增香石竹斑驳病毒CP全长基因反向引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：3所示的是香石竹斑驳病毒特异性扩增正向引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：4所示的是香石竹斑驳病毒特异性扩增反向引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：5所示的是香石竹斑驳病毒特异性检测Taqman探针的碱基序列，在所述香石竹斑驳病毒特异性检测Taqman探针的5'端标记有FAM报告荧光集团，3'端标记有BHQ淬灭荧光集团。

附图说明

图1是标准品香石竹斑驳病毒CP基因克隆及RNA凝胶电泳图。图1中，图A是标准品香石竹斑驳病毒CP基因质粒载体，图B是标准品香石竹斑驳病毒CP基因质粒载体线性酶切凝胶电泳图，图C是标准品香石竹斑驳病毒CP基因RNA体外合成凝胶电泳图，图D是标准品香石竹斑驳病毒CP基因体外合成RNA纯化凝胶电泳图。

图2是用本发明一步法实时定量荧光荧光PCR方法检测标准品香石竹斑驳病毒CP基因体外转录RNA的标准曲线扩增图，图2中横坐标是循环数，纵坐标是相对荧光强度，曲线从左至右香石竹斑驳病毒CP基因体外转录RNA拷贝数依次为：2×10⁶copy/μl，2×10⁵copy/μl，2×10⁴copy/μl，2×10³copy/μl，2×10²copy/μl。

图3是用本发明一步法实时定量荧光荧光PCR方法检测标准品香石竹斑驳病毒CP基因体外转录RNA的标准曲线。图3中横坐标是拷贝数浓度copy/μl，纵坐标是Ct值，标准曲线斜率为-3.307，标准曲线Y＝-3.307X+34.285，R²＝0.998。

图4是用本发明一步法实时定量荧光荧光PCR方法检测待测样品的扩增曲线，图4中横坐标是循环数，纵坐标是相对荧光强度，1和2表示样品Y-1扩增曲线，3和4表示样品Y-2扩增曲线。

图5是用本发明一步法实时定量荧光荧光PCR方法检测待测样品Y-1和Y-2的Ct值所对应的浓度。图5中横坐标是拷贝数浓度copy/μl，纵坐标是Ct值。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明，实施例中无特殊说明的为常规方法。实施例所用的各试剂及载体均可从商业渠道购买。

实施例1

(一)标准品的制备及其标准曲线的建立

(1)PCR引物设计

从NCBI中搜索目前已登录的香石竹斑驳病毒CP基因的序列，GenBank登录号为HQ660513，应用引物设计软件，设计扩增香石竹斑驳病毒CP基因全长引物，特异性引物和Taqman探针。引物设计时注意扩增片段长短及引物自身和引物间二聚体的问题。

所设计的扩增香石竹斑驳病毒CP全长基因正向引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

所设计的扩增香石竹斑驳病毒CP全长基因反向引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

所设计的香石竹斑驳病毒特异性扩增正向引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

所设计的香石竹斑驳病毒特异性扩增反向引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

所设计的香石竹斑驳病毒特异性检测Taqman探针的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，在所述香石竹斑驳病毒特异性检测Taqman探针的5'端标记有FAM报告荧光集团，3'端标记有BHQ淬灭荧光集团。

以上设计的扩增香石竹斑驳病毒CP全长基因正向引物、扩增香石竹斑驳病毒CP全长基因反向引物、香石竹斑驳病毒特异性扩增正向引物、香石竹斑驳病毒特异性扩增反向引物和香石竹斑驳病毒特异性检测Taqman探针由上海捷瑞生物工程有限公司公司合成。

(2)标准品总RNA提取

所述标准品即香石竹斑驳病毒标准品。

①经血清反应检测后确定被感染香石竹斑驳病毒的香石竹叶片样品提取总RNA，血清检测方法参照孔宝华等发表论文：题目香石竹斑驳病毒的鉴定和RT-PCR检测，植物保护2002(28)5-8。将100mg被感染香石竹斑驳病毒的香石竹叶片在液氮研磨后至于2ml离心管中，随即加入1ml Trizol，匀浆于冰上放置10min；

②加入200μl氯仿、剧烈震荡30s，放于冰上15min，4℃，12000r/min，离心10min；

③取上清液至另一2ml离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻摇匀，放置于-20℃冰箱20min；

④4℃12000r/min离心15min，弃上清，加入75％v/v乙醇洗涤，轻轻混匀；4℃12000/min离心10min，用枪头吸干乙醇，干燥30min，所得沉淀溶解在25μl DEPC水中即得标准品总RNA。

(3)反转录合成cDNA

cDNA合成反应体系20μl：

取上述步骤(一)(2)所得的标准品总RNA 2.0μg，50μM随机六聚体引物1μl，5×RT Buffer 4μl，10mM dNTP 1μl，RNase Inhibior 0.5μl，RNase 1μl，DEPC H₂O补至20μl，反应条件为42℃水浴1h，获得cDNA。

(4)标准品目标基因香石竹斑驳病毒CP基因全长的克隆及测序验证

以上述实施例1步骤(一)(3)合成的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如下：

10×PCR含20mM的Mg²⁺缓冲液5.0μl，5U/μl ExTaq DNA聚合酶0.5μl，2.5μM dNTP 1.0μl；20μM扩增香石竹斑驳病毒CP全长基因正向引物1.5μl，20μM扩增香石竹斑驳病毒CP全长基因反向引物1.5μl，实施例1步骤(一)(3)所得的cDNA模板4.0μl，ddH₂O 36.5μl，总体积50.0μl；所述扩增香石竹斑驳病毒CP全长基因正向引物的碱基序列如SEQ ID：1所示，扩增香石竹斑驳病毒CP全长基因反向引物的碱基序列如SEQ ID：2所示；PCR反应的条件：94℃预变性4min后，进行30个循环扩增，每个循环为94℃变性1min，56℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环扩增后72℃灭活反应10min。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物的电泳检测鉴定后选择片段大小为1047bp的片段进行切胶回收。回收的PCR产物于4℃过夜连接pGEM-T Easy载体，通过加入氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆，对筛选出的阳性克隆进行PCR检测，并对阳性克隆送上海捷瑞生物工程有限公司进行测序，对测序所得序列经Blast比对，鉴定出DNA片段正向插入pGEM-T Easy载体的重组阳性质粒。因此，验证了所设计引物SEQ：NO.1和SEQ：NO.2可以扩增得到香石竹斑驳病毒CP基因全长基因片段。

(5)阳性重组质粒的线性化处理

将最终筛选的阳性重组质粒重新转化大肠杆菌JM110感受态细胞，挑取单菌落，使用LB液体培养基进行扩繁。离心收集大量培养的菌体，利用质粒大量快速提取试剂盒对菌液进行质粒抽提重组阳性质粒进行线性化处理：

阳性重组质粒通过SmaI酶切进行线性化处理，具体方法步骤如下：10×T buffer 5μl，SmaI 1μl，阳性重组质粒DNA 2μg，加水至50μl，25℃酶切16h，取1ul反应液电泳检测，65℃温育10min中止反应。

将经线性化处理的阳性重组质粒DNA用PCR试剂盒提供方法纯化。

将纯化后的阳性重组质粒DNA用NanoDrop ND-2000核酸蛋白测定仪测定OD260nm/OD 280nm吸光值，测定得到阳性重组质粒DNA浓度。

(6)标准品目标基因香石竹斑驳病毒CP基因的体外转录

采用Promega公司的RiboMAX Large ScaleRNA Produciton Systems-T7试剂盒进行体外转录，一个标准的体外转录反应为100μl

在室温下，按如下顺序加样制备下列反应体系：

①T7 Transcription 5×Buffer 20μl；

②25mM ATP7.5μl，25mM CTP7.5μl，25mM GTP7.5μl和25mM UTP 7.5μl；

③线性化的重组质粒5μg；

④T7 Enzyme Mix 10μl；

⑤DEPC水至100μl混匀后，37℃恒温反应4h，得标准品目标基因香石竹斑驳病毒CP基因的体外转录总RNA。

(7)标准品目标基因香石竹斑驳病毒CP基因的体外转录总RNA浓度测定及香石竹斑驳病毒标准品溶液配制

用NanoDrop ND-2000核酸蛋白测定仪准确测定香石竹斑驳病毒标准品目标基因香石竹斑驳病毒CP基因的体外转录总RNA浓度，根据以下公式计算其拷贝数：拷贝数＝标准品RNA质量浓度×阿氏常数/ssRNA分子量，拷贝数单位是copies/μl，标准品RNA质量浓度单位是ng/μl其中，阿氏常数为6.02×10²³，ssRNA分子量＝一个碱基对的分子质量×片段长度，一个碱基对的分子质量为345道尔顿/碱基。

(8)标准曲线的制作

用EASY dilution进行梯度稀释，配制拷贝数为2×10²-2×10⁶copies阳性ssRNA溶液；将稀释后的ssRNA溶液采用大连宝生物公司一步法实时定量荧光检测试剂盒进行。PCR反应体系为20μl：其中2×One Step RT-PCR Buffer III 10μl，5U/μl TaKaRa Ex Taq HS 0.4μl，Prime Script RT Enzyme Mix II 0.4μl，香石竹斑驳病毒特异性扩增正向引物0.4μl，香石竹斑驳病毒特异性扩增反向引物0.4μl，香石竹斑驳病毒特异性检测Taqman探针0.8μl，步骤(一(7)所得标准品目标基因CP基因的体外转录总ssRNA 2μl，用RNase Free dd H₂O定容至20μl。

所述标准品的一步法实时定量荧光PCR检测的PCR反应程序为：42℃反转录5min；40个循环扩增，每个循环扩增为95℃变性10s，95℃10s，60℃30s；结果表明稀释浓度均能产生荧光信号Ct值分别为27.41，24.59，21.22，17.77，14.29，由扩增曲线得到的标准曲线斜率为-3.307见扩增曲线图2，标准曲线Y＝-3.307X+34.285，R²＝0.998，标准曲线见图3。

(二)待测样品的一步法实时定量荧光PCR检测

(1)待测样品为香石竹叶片分别编号为Y-1，Y-2，待测样品总RNA提取与实施例1步骤(一)(2)相同，每个待测样品的具体操作如下：

①将100mg待测香石竹叶片液氮研磨后至于2ml离心管中，随即加入1ml Trizol，匀浆于冰上放置10min；

②加入200μl氯仿。剧烈震荡30s，放于冰上15min，4℃，12000r/min，离心10min；

③取上清液至另一2ml离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻摇匀，放置于-20℃冰箱2h；

④4℃12000r/min离心15min，弃上清，加入75％v/v乙醇洗涤，轻轻混匀；4℃12000/min离心10min，用枪头吸干乙醇，干燥30min，所得沉淀溶解在25μl DEPC水中即得待测样品总RNA。

(2)待测样品总RNA浓度的测定

利用NanoDrop ND-2000核酸蛋白测定仪准确测定待测样品总RNA浓度。

(3)待测样品的一步法实时定量荧光PCR检测

每个待测样品按如下PCR反应体系和PCR反应程序进行：所述待测样品的一步法实时定量荧光PCR检测的PCR反应体系除将步骤(一)(8)所述PCR反应体系中的步骤(一(7)所得标准品目标基因CP基因的体外转录总ssRNA 2μl替换为步骤(二)(2)经总RNA浓度测定合格的待测样品的总RNA 2μl外，其PCR反应体系中的其余成分及浓度和用量均与步骤(一)(8)所述的PCR反应体系相同；其PCR反应体系具体如下：

待测样品的一步法实时定量荧光PCR检测的PCR反应体系具体如下：PCR反应体系为20μl：其中2×One Step RT-PCR Buffer III 10μL，5U/μl TaKaRa Ex Taq HS 0.4μl，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.4μl，香石竹斑驳病毒特异性扩增正向引物0.4μl，香石竹斑驳病毒特异性扩增反向引物0.4μl，香石竹斑驳病毒特异性检测Taqman探针0.8μl，步骤(二)(2)经总RNA浓度测定合格的待测样品总RNA 2μl，用RNase Free dd H₂O定容至20μl。

所述待测样品的一步法实时定量荧光PCR检测的PCR反应程序与步骤(一)(8)所述标准品的一步法实时定量荧光PCR反应程序相同，其具体PCR反应程序为：42℃反转录5min后；40个循环扩增，每个循环扩增为95℃变性10s，95℃10s，60℃30s，上机得到待测样品Ct值，2个待测样品Y-1，Y-2的Ct值是22.80，22.09，其扩增曲线见图4，其2个待测样品检测结果见标准曲线图5，根据标准曲线得到样品Y-1拷贝数为2.31×10³copies/μl，样品Y-2拷贝数为2.46×10³copies/μl。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省农业科学院花卉研究所

<120> 一步法实时定量荧光PCR检测香石竹斑驳病毒的方法

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<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA