本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种人类疱疹病毒4型检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
：人类疱疹病毒第四型即EB病毒(EBV)，EBV是一种普遍存在于人体的疱疹类病毒，人一旦感染后，就可能终身携带。EBV感染主要会引起儿童传染性单核细胞增多症及与许多肿瘤的发生有密切关系，严重威胁着人类特别是儿童的健康，因而一直倍受关注。目前，血液中EB病毒DNA检测主要采用聚合酶链式反应(PCR)技术。荧光定量PCR又称实时定量PCR，是近年开发出来的全新PCR技术，可以全程、动态、不间断地光学监控被荧光标记的PCR反应，以此来评价被检测标本中的DNA含量，能反映PCR扩增动力学变化，实现实时定量检测，具有快速、准确、不易被污染等优点。如中国专利申请CN103866046A公开了一种人疱疹病毒EBV和VZV检测试剂盒，由定量PCR反应液、EBV标准品、VZV标准品、EBV阳性对照品、VZV阳性对照品、阴性对照品、说明书和盒体组成。该发明试剂盒采用实时荧光定量PCR技术和双色荧光探针，能一步法检测人疱疹病毒EBV和VZV，实现了EBV和VZV感染的同步诊断，对阳性病毒能实时准确定量，可满足临床早期、准确诊断EBV和VZV感染的迫切需要，为EBV和VZV感染的及时针对性治疗提供依据。运用PCR技术检测EB病毒DNA主要包括EB病毒核酸的提取和核酸的PCR扩增，但是该试剂盒并未涉及EB病毒核酸提取方面，而在实际运用中，除PCR本身外，核酸提取效率和抗干扰能力对PCR准确检测EB病毒核酸含量有很大影响。目前，国内临床上主要采用直接煮沸法、酚-氯仿抽提法对血浆或血清样本中的EB病毒核酸进行提取，直接煮沸法提取过程较复杂，且在处理样本时经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，同时直接加热法提取的核酸模板中含有较多的杂质，这些存在的杂质会干扰检测的进行，如蛋白质、肝素等，所以往往需要将核酸提取液进一步纯化，纯化工序冗长且往往达不到预期效果。而国外临床上主要采用DNA提取试剂盒来提取EB病毒核酸，其提取效果较好，但是由于价格昂贵，难以在国内应用。针对上述问题，中国专利申请CN103060473A公开了一种疱疹类病毒EBV检测试剂盒，其包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷0.01～0.5mM/L，氯化钾20～300mM/L，十二烷基磺酸钠0.01～2％和乙醇0.05～1％。该核酸释放剂提取核酸时采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸，无需加热即可完成DNA的释放和提取。虽然用核酸释放剂提取核酸具有快速、简便等优点，但是核酸样品含杂质较多，且整体的提取效率不高，影响了试剂盒的检测准确度。因此，有必要在此基础上改进，进而提供一种能够对样本中的EBV准确定量的试剂盒。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种人类疱疹病毒4型检测试剂盒及检测方法，以解决以上缺陷。本发明提供了一种人类疱疹病毒4型检测试剂盒，包括核酸释放剂、含磁珠的核酸提取液和PCR反应液，所述核酸释放剂包括0.1～0.3mg/ml表面活性肽、0.01～0.05mg/ml醋酸氯己定、2～6％氯化钾(w/v)和0.1～2％的亲水石墨烯(w/v)；所述含磁珠的核酸提取液包括100～300mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸、100～300mmol/L氯化钠和100～400μg/ml磁珠；所述PCR反应液包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。进一步地，所述核酸释放剂包括0.2mg/ml表面活性肽、0.03mg/ml醋酸氯己定、4.5％氯化钾(w/v)和1.2％的亲水石墨烯(w/v)，所述含磁珠的核酸提取液包括200mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸、200mmol/L氯化钠和250μg/ml磁珠。需要值得说明的是，本发明先用核酸释放剂释放核酸，然后通过磁珠吸附核酸，从而达到对核酸的高提取。其中，本发明中核酸释放剂的溶剂可以是无菌水或TE缓冲液。本发明核酸释放剂中亲水石墨烯与样本中的杂质如蛋白质、脂质等具有强亲和力，能够与蛋白质、脂质等杂质结合，使得蛋白质等杂质没有多余的结合位点与磁珠结合，从而提高了核酸的提取率，进而提高了试剂盒的检测准确度。另一方面，亲水石墨烯对核酸具有强保护作用。本发明核酸释放剂与现有技术中直接煮沸法的检测结果具有高度的一致性，利用本发明核酸释放剂提取核酸加热即可使核酸快速释放出来。再利用磁珠捕捉核酸，经过磁分离清洗后即得核酸样品，由于亲水石墨烯吸附了绝大部分的杂质，经磁分离后清洗得到的核酸样品杂质含量较少，其无需再纯化，节省了程序，降低了生产成本。进一步地，本发明所述用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物、探针、内标、用于内标检测的上游引物、下游引物和探针均引用自中国专利申请CN103060473A一种疱疹类病毒EBV检测试剂盒，其中，用于靶多核苷酸扩增的上游引物序列为5’-TGCAGCTTTGACGATGGAGTAG-3’，下游引物序列为5’-TCACTCCTGCCCTTCCTCAC-3，探针序列为5’-FAM-TTTGCCTCCCTGGTTTCCACCTATG-BHQ1-3’，所述内标的序列为5-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACCTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3，所述PCR反应液还包括用于内标检测的上游引物、下游引物和探针；所述内标上游引物序列为5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAG-3’，所述内标下游引物序列为5’-CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3’，所述内标探针的序列为5’-HEX-TTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAA–BHQl-3’。进一步地，所述亲水石墨烯由以下步骤制得：取经过透析处理，已除去残留离子的Hummers法制备的氧化石墨，配制成0.2～0.8mg/ml的水溶液，按氧化石墨：六次甲基四胺为2∶1～1∶2的质量比加入六次甲基四胺，100℃搅拌回流反应8～12h，得到分散均匀的亲水石墨烯分散系。进一步地，所述试剂盒终还包括内标、核酸洗脱液、磁珠洗涤液、EBV阴性对照、EBV阳性对照、EBV定量参考品、磁珠分散剂和酶混合液。进一步地，所述磁珠分散剂包括氨基酸0.06～2份、乙酸0.5～2份和羧甲基葡聚糖2～5份。虽然利用核酸释放剂和磁珠吸附能够较好的吸附核酸，但是，在后期核酸洗脱过程中，由于磁珠黏附在离心管壁上，增加了洗脱程序的难度，需要反复多次进行洗脱，反复的洗脱一方面增加了工序，另一方面容易使核酸丢失，从而影响了试剂盒的准确度。于是，发明人发现了一种磁珠分散剂，其可以分散磁珠，且其不会降低免疫反应。值得说明的是，分散剂可以以任何浓度加入，只要他们以这样的浓度加入，可以发挥前面所述的效果即可。具体地说，当分散剂加入到样本中时，按照0.01～5μg/μl的浓度加入，优选是0.6～2μg/μl。其中，分散剂包括氨基酸0.06～2份、乙酸0.5～2份和羧甲基葡聚糖2～5份。更优选地，所述分散剂包括氨基酸0.15份、乙酸0.8份和羧甲基葡聚糖3.5份。优选地，所述氨基酸选自甘氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸中的一种。更优选地，氨基酸选自甘氨酸。进一步地，所述核酸洗脱液含有0.8～1.2mol/LTris-HCl、0.1～1.0mol/LEDTA；所述磁珠洗涤液包含0.1～1.0％曲拉通(v/v)、100～300mmol/L氯化钠；所述酶混合液中包含Taq聚合酶和0.5～2U/μl的UNG酶。其中，UNG酶的功能是降解含有dU的PCR产物，利用UNG酶和PCR反应液中的dUTP可以起到预防PCR产物污染的作用，从而防止样本检测假阳性。相应地，本发明还提供了一种利用上述的试剂盒检测人类疱疹病毒4型的方法，包括以下步骤：A)裂解病毒：取四个离心管，分别加入5～10μl核酸释放剂和10～15μl待测样本、5～10μl核酸释放剂和6～10μlEBV阴性对照、5～10μl核酸释放剂和6～10μlEBV阳性对照以及5～10μl核酸释放剂和6～10μlEBV定量参考品，做好标记，充分混合均匀，于室温下放置3～5min，备用；B)磁珠吸附：往上述4个离心管中均加入含磁珠的核酸提取液和内标，离心，用磁珠分离器进行固液分离，此时离心管壁上的固体含磁珠和核酸，加入磁珠洗涤液，再次离心，用磁珠分离器进行固液分离，此时离心管壁上的固体含磁珠和核酸；C)核酸洗脱：往上述离心管中加入核酸洗脱液和分散剂，使得磁珠和核酸分开，离心，分离磁珠，保留离心管中的液体；D)PCR荧光分析：按照待测样本、EBV阴性对照、EBV阳性对照、EBV定量参考品的数量配制PCR反应液，将经步骤C)处理后的待测样本、EBV阴性对照、EBV阳性对照和EBV定量参考品分别与PCR反应液和酶混合液混合后加入到PCR反应板的各孔中，去除气泡后盖好封膜，1000～3000rpm/min离心30s，用于荧光分析。与现有技术相比，本发明试剂盒具有以下优势：1)本发明试剂盒具有操作简单，检测灵敏度、准确度高，特异性好，检测范围宽的优点，为临床诊断EBV感染提供了可靠的实验依据。2)本发明试剂盒中核酸释放剂能够迅速破坏EBV病毒颗粒外壳蛋白结构，释放EBV核酸，进一步通过磁珠捕捉核酸，两者结合使核酸提取率明显提高，提取过程变得简单、耗时短，且后续无需再进行纯化，降低了生产成本，取得了积极的效果。具体实施方式：以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。本发明表面活性肽购自Sigma公司。实施例1、一种人类疱疹病毒4型检测试剂盒本发明实施例1包括以下组分：①核酸释放剂：在无菌水中加入表面活性肽使终浓度达到0.2mg/ml、加入醋酸氯己定使终浓度达到0.03mg/ml、加入氯化钾使终浓度达到4.5％(w/v)以及加入亲水石墨烯使终浓度达到1.2％的(w/v)。亲水石墨烯的制备方法：取经过透析处理，已除去残留离子的Hummers法制备的氧化石墨，配制成0.5mg/ml的水溶液，按氧化石墨：六次甲基四胺为2∶1的质量比加入六次甲基四胺，100℃搅拌回流反应12h，得到分散均匀的亲水石墨烯分散系。②含磁珠的核酸提取液：200mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸、200mmol/L氯化钠和250μg/ml磁珠，用无菌水定容至1L。③内标：为插入pUC18T载体的一段长为100碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，浓度为2.00E+05copies/ml，100碱基对的序列为：5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3’。④PCR反应液：包括10×PCR反应缓冲液5μl，0.2mmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸，0.3μmol/L用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物，0.3μmol/L用于靶多核苷酸检测的探针，0.3μmol/L用于内标片段扩增的上下游引物，0.1μmol/L用于检测内标的探针为。其中，所述10×PCR反应缓冲液为包括pH7.5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、30mmol/L氯化镁溶液、500mmol/L氯化钾溶液、0.2％的曲拉通溶液和10％的甲酰胺溶液；所述脱氧核糖核苷三磷酸包括dATP、dCTP、dUTP和dGTP；所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针是源于EB病毒核酸的保守区域的引物和探针，其碱基序列分别为：上游引物：5’-TGCAGCTTTGACGATGGAGTAG-3’；下游引物：5’-TCACTCCTGCCCTTCCTCAC-3’；探针：5’-FAM-TTTGCCTCCCTGGTTTCCACCTATG-BHQ1-3’；所述的用于检测内标的引物探针序列分别为：上游引物：5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAG-3’，下游引物：5’-CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3’，探针：5’-HEX-TTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAA-BHQl-3’。⑤磁珠分散剂：含氨基酸0.15份、乙酸0.8份和羧甲基葡聚糖3.5份。⑥核酸洗脱液：含有1.2mol/LTris-HCl、0.5mol/LEDTA的无菌水。⑦磁珠洗涤液：包含0.5％曲拉通(v/v)、200mmol/L氯化钠的无菌水。⑧酶混合液：包含Taq聚合酶和0.5～2U/μl的UNG酶。⑨EBV阴性对照：为阴性血清。⑩EBV阳性对照：为阴性血清稀释的B958细胞的培养的上清液，浓度为4.00E+05copies/ml。EBV定量参考品：将浓度为4.00E+08copies/ml标准品按照10倍倍比稀释至4.00E+01copies/ml，稀释八个梯度，并以此八个标准品作为EBV定量参考品。实施例2、用实施例1所述试剂盒检测EBV的方法一、制备待测样本制备血清样本：选用新抽取的静脉血，常温放置25～35min后，于2000rpm/min离心2～4min，吸取上清，并移至干净的EP管中待用。二、核酸提取A)裂解病毒：取四个离心管，分别加入6μl核酸释放剂和12μl步骤一)中制备的待测样本、6μl核酸释放剂和8μlEBV阴性对照、6μl核酸释放剂和8μlEBV阳性对照以及6μl核酸释放剂和8μlEBV定量参考品，做好标记，充分混合均匀，于室温下放置3min，备用；B)磁珠吸附：往上述4个离心管中均加入100μl含磁珠的核酸提取液和4μl内标，离心，用磁珠分离器进行固液分离，此时离心管壁上的固体含磁珠和核酸，加入100μl磁珠洗涤液，再次离心，用磁珠分离器进行固液分离，此时离心管壁上的固体含磁珠和核酸；C)核酸洗脱：往上述离心管中加入50μl核酸洗脱液和25μg分散剂，使得磁珠和核酸分开，离心，分离磁珠，保留离心管中的液体；D)PCR荧光分析：按照待测样本、EBV阴性对照、EBV阳性对照、EBV定量参考品的数量配制PCR反应液，将经步骤C)处理后的待测样本、EBV阴性对照、EBV阳性对照和EBV定量参考品分别与PCR反应液和酶混合液加入到PCR反应板的各孔中，去除气泡后盖好封膜，1000～3000rpm/min离心30s，用于荧光分析。三、荧光PCR反应与结果分析首先将上述PCR反应管放入扩增仪样品槽内，按对应顺序设置定量参考品浓度；选择FAM通道检测EBV；选择HEX或VIX通道检测内标；参比荧光设置为none，荧光定量PCR反应条件如下表1所示。表1荧光定量PCR反应条件结果分析：反应结束后，利用仪器自带的软件进行自动分析，扩增曲线与阈值线的交点为Ct值，软件根据样本的Ct值的大小，通过八个浓度梯度的定量参考品绘制标准曲线，可以自动求得样本的定量检测结果。只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始载量。如果测定Ct值≤39(Ct值＞0)且待测样本的扩增曲线呈S型，可以判断EBV-DNA阳性；如果无Ct值显示，待测样本扩增曲线平直，且内标检测为阳性(Ct值≤39)，可以判断EBV-DNA阴性；如果测定待测样本Ct值＞39，同时内标检测为阳性(Ct值≤39)，可以判断为低于检测下限；如果内标Ct值＞39或内标显示无Ct值，则判断该待测样本的检测结果无效。试验例一、本发明试剂盒与中国专利申请CN103060473A试剂盒性能比较1.1准确度测试取本发明实施例1所述试剂盒和对照组(中国专利申请CN103060473A试剂盒)分别对标准品1和标准品2进行测定，其中标准品1中浓度为4.00E+08copies/ml，标准品2中浓度为4.00E+01copies/ml标准品，每个试剂盒重复测定三次，测定结果如表2和表3所示。表2本发明试剂盒对标准品1的测定结果组别第1次(copies/ml)第2次(copies/ml)第3次(copies/ml)平均值(copies/ml)偏差(％)实施例14.05E+084.08E+083.97E+084.03E+080.75％对照组4.22E+084.08E+084.56E+084.28E+087％表3本发明试剂盒对标准品2的测定结果组别第1次(copies/ml)第2次(copies/ml)第3次(copies/ml)平均值(copies/ml)偏差(％)实施例14.02E+014.01E+014.20E+014.07E+011.75％对照组4.24E+014.08E+014.32E+014.21E+015.25％由表2和表3可知，本发明试剂盒与对照组相比，具有更高的准确度，对标准品1和标准品2的检测偏差较小。1.2精密度测试取本发明实施例1所述试剂盒和对照组(中国专利申请CN103060473A试剂盒)对同一待测样本进行多次反复测定，对所得的结果进行标准偏差SD和变异系数CV计算。结果显示，本发明试剂盒具有更高的精密度，其批内变异系数为3.82％，批间变异系数为5.68％，对照组批内变异系数为8.53％，批间变异系数为23.42％。1.3特异性测试1.3.1特异性：用本发明实施例1以及对照组(中国专利申请CN103060473A试剂盒)所述试剂盒分别检测健康献血员血清206份，检测结果如表4所示。表4检测结果由表4可知，用本发明实施例1所述试剂盒检测健康血清206例，检出阳性0例，阳性率为0％，结果差异无显著性，试剂盒的特异性为100％。值得说明的是，用对照组所述试剂盒检测健康血清206例，检出阳性8例，阳性率为2.9％，这说明，与对照组相比，本发明试剂盒具有更好的特异性。试验例二、不同核酸核酸释放剂对血清EBV核酸提取的影响1.1试验试剂盒：除核酸释放剂的组成不同外，设置4种试剂盒，分别是：试剂盒①(核酸释放剂为含表面活性肽0.2mg/ml、醋酸氯己定0.03mg/ml、氯化钾4.5％(w/v)、亲水石墨烯1.2％的(w/v)的无菌水)、试剂盒②(所述核酸释放剂为含表面活性肽0.2mg/ml、氯化钾4.5％(w/v)和亲水石墨烯1.2％的(w/v的无菌水)、试剂盒③(所述核酸释放剂为含表面活性肽0.2mg/ml、醋酸氯己定0.03mg/ml、氯化钾4.5％(w/v)的无菌水)以及试剂盒④(中国专利申请CN103060473A所述核酸释放剂，含莎梵婷0.1mM/L，氯化钾100mM/L，十二烷基磺酸钠0.1和乙醇0.1％的TE缓冲液)。1.2检测：利用上述4种试剂盒按照本发明实施例2所述方法对5例EBV阳性血清(标记为A、BC、D、E)进行核酸提取和检测，4种试剂盒对5例EBV阳性血清定量检测结果如表5所示。表54种试剂盒对5例EBV阳性血清的定量检测结果结果分析：由表5可知，与中国专利CN103060473A所述核酸释放剂相比，含有本发明核酸释放剂的试剂盒能够更准确的定量；另外，改变了本发明核酸释放剂的组成，其对试剂盒的定量结果影响较大，加入醋酸氯己定和亲水石墨烯更有利于试剂盒的准确定量。试验例三、不同分散剂组成对磁珠聚集现象的影响除分散剂组成不同外，设置4种试剂盒，利用各试剂盒按照实施例2所述检测方法对血清样本进行检测，目测磁珠在离心管上的黏附和聚集现象，记录结果如表6。表6不同分散剂组成对磁珠聚集现象的影响分散剂组成磁珠粒在离心管上黏附磁珠的聚集氨基酸0.15份、乙酸0.8份和羧甲基葡聚糖3.5份没有没有不含分散剂存在存在氨基酸0.15份和乙酸0.8份存在存在氨基酸0.2份和羧甲基葡聚糖3.5份存在没有由上表可知，当存在分散剂时，磁珠没有出现在反应容器内壁上黏附和相互聚集现象，后续无需重复洗脱，节省了操作工序和成本。当不加入分散剂时，磁珠在离心管的内壁上有非常严重的黏附现象，且磁珠之间相互聚集，后续洗脱过程中无法顺利的进行，需要进行多次重复洗脱。值得说明的是，即使是改变分散剂的组成或者改变各组分的用量也会引起磁珠的聚集，如当去掉羧甲基葡聚糖时，磁珠有明显的黏附和聚集现象，当去掉乙酸时，容易使得磁珠在离心管内壁上黏附。当前第1页1 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