本发明属于有机小分子探针的合成技术领域，具体涉及一种新型甲基环丙烯合成子的合成方法及采用该合成子合成得到的甲基环丙烯核苷衍生物。
背景技术：
细胞是组成生命体的基本单位。细胞的主要生命活动通过核酸(DNA、RNA)进行调控，因而观察细胞内核酸的变化可分析细胞的增殖、分化、衰老和凋亡的状况，进一步可研究整个生物体的代谢。生物正交反应探针是近年发展的一种新的研究工具，生物正交反应探针的原理是利用生物正交反应将生物体内的生化小分子和荧光染料共价连接起来，从而实现生命体内生化小分子的可视化。成功用于活细胞核酸检测的生物正交反应有叠氮和乙炔的环加成反应(反应式a：不需要铜离子催化的SPAAC反应；反应式b：需要铜离子催化的CuAAC反应)以及乙烯和四嗪的逆电子需求Diels-Alder反应(反应式c：IEDDA反应)，目前已被成功应用于标记活细胞和动物的细胞蛋白、多核苷酸、脂质和聚糖。
烯与S-四嗪的生物正交反应和叠氮与炔的生物正交反应相比，环丙烯与S-四嗪的生物正交反应具有反应速度快的优点，其二级反应动力学常数k2为13M-1s-1，远高于叠氮/炔的反应速率(<1M-1s-1)。而环丙烯同时具有叠氮基或者炔基所具有的尺寸小、生理条件下稳定的优点，可以说是一个性能非常优良的标记物。目前，环丙烯在糖代谢和蛋白质标记方面已有较多的应用：(1)在糖代谢标记方面，唾液酸环丙烯衍生物的前体─糖胺的环丙烯衍生物也能成功的用于糖代谢标记。例如：Devaraj课题组(Cole C.M 1.,Yang J 1.,Seckute J.,Devaraj N.K.ChemBioChem,2013,14,205–208.)合成的甘露糖胺的环丙烯酰胺衍生物可通过唾液酸生物合成途径进行代谢标记(见反应式d)；康斯坦茨大学的Wittmann课题组(A.K.,Buβkamp H.,Niederwieser A.,Schart V.F.,Marx A.,Wittmann V.BioconjugateChem.2014,25,147-154.)和加州大学欧文分校的Prescher课题组(Patterson,D.M.,Jones,K.A.,Prescher J.A.,Mol.BioSyst.,2014,10,1693-1697.)合成的甘露糖胺、葡糖糖胺和半乳糖胺的环丙烯氨基甲酸酯衍生物均能通过唾液酸生物合成途径进行代谢。
(2)在蛋白质标记方面，剑桥大学的Chin课题组(Sachdeva A.,Wang K.H.,Elliott T.,Chin J.W.,J.Am.Chem.Soc.2014,136,7785-7788.)将赖氨酸环丙烯衍生物用于动物特定组织和特定发育阶段中蛋白组标记和蛋白质鉴定(见反应式e)；新加坡国立大学的Yao课题组(Li Z.Q.,Wang D.Y.,Li L.,Pan S.J.,Na Z.K.,Tan C.Y.J,Yao S.Q.,J.Am.Chem.Soc.2014,136,9990-9998.)将含有环丙烯的光交联链化合物用于活细胞成像及基于配体受体之间亲合力的蛋白质标记(见反应式f)。
相对于在糖和蛋白质标记方面的成功，环丙烯在核酸标记方面的研究显得滞后，目前尚未见环丙烯核苷化合物用于活细胞核酸标记的报道。
上述环丙烯核苷化合物合成困难，特别对一些结构复杂的分子，经典的合成方法要用到价格昂贵的重氮乙酸乙酯和3-甲基硅基丙炔为原料，同时重氮乙酸乙酯在大量使用的时候也存在安全隐患，容易发生爆炸。因为这是小分子烯烃化合物，在官能团转化的过程中极其不稳定，沸点极低，较难合成。因此，发展一种简单易操作同时能够实现克级制备的环丙烯合成子具有非常重要的意义。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种新型的甲基环丙烯合成子，以及该合成子的合成方法和采用该合成子合成得到的甲基环丙烯核苷衍生物。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：该甲基环丙烯合成子的结构式如下所示：
上述甲基环丙烯合成子的合成方法由下述步骤组成：
1、以二氯甲烷为溶剂、氯铬酸吡啶鎓(PCC)为氧化剂，将式1所示的2-溴-2-甲基-3-三甲基硅基-环丙烷基甲醇在常温下氧化，得到化合物2。
2、以二氯甲烷为溶剂，先使四溴化碳和三苯基膦形成二溴亚甲基磷叶立德，然后加入化合物2，在0℃下进行亲核加成反应，得到化合物3。
3、以乙醚为溶剂，在惰性气体保护下，将化合物3、正丁基锂在-78℃下进行消除反应，得到甲基环丙烯合成子，具体合成路线如下：
上述步骤1中，所述的2-溴-2-甲基-3-三甲基硅基-环丙烷基甲醇根据公开号为CN105884689A、发明名称为“一种甲基环丙烯探针的合成方法”公开的方法合成。
上述步骤1中，优选2-溴-2-甲基-3-三甲基硅基-环丙烷基甲醇与氯铬酸吡啶鎓的摩尔比为1:1.5～2.5。
上述步骤2中，优选化合物2与四溴化碳、三苯基膦的摩尔比为1:2～2.5:4～5。
上述步骤3中，优选化合物3与正丁基锂的摩尔比为1:2～3。
采用本发明甲基环丙烯合成子合成的甲基环丙烯核苷衍生物，其分别为式I所示的甲基环丙烯脱氧尿嘧啶核苷和式II所示的甲基环丙烯脱氧腺嘌呤核苷：
本发明以2-溴-2-甲基-3-三甲基硅基-环丙烷基甲醇为原料，经过氧化反应得到醛基化合物后，再经过Corey-Fuchs反应，与四溴化碳和三苯基膦反应，得到二溴烯烃，然后再和正丁基锂反应即可得到目标分子——甲基环丙烯合成子。合成路线短，反应操作简单，能够实现克级制备，具有良好的应用前景。
本发明的甲基环丙烯合成子极其稳定，通过Sonogashira反应分别与5-碘尿嘧啶脱氧核苷和7-碘腺嘌呤脱氧核苷偶联，然后氢化还原炔基，用四丁基氟化铵脱除硅基和溴就可以得到甲基环丙烯脱氧核苷这两个化合物，由于环丙烯体积小且在生理条件下能够稳定存在，这意味着将其标记到核酸上不会影响核酸聚合酶对该非天然核酸的识别，同时该甲基环丙烯核苷能够与被四嗪淬灭的荧光染料发生逆电子的狄尔斯阿尔德反应，另外，由于环丙烯与S-四嗪的反应速度很快，在标记结束后很短时间内即可看到荧光，因此，这类甲基环丙烯核苷化合物可望用于活细胞核酸的标记。所以说该合成子可以运用到更多结构复杂的分子上来形成有用的生化小分子，最终用于活细胞的标记。
本发明合成子的合成方法与以往文献报道的甲基环丙烯的合成方法最大不同 之处在于该方法是先构建甲基环丙烷的骨架相当于甲基环丙烯的等价物，同时又比甲基环丙烯稳定，它可以在剧烈条件(高温、强氧化剂、强还原剂)下发生反应而不会破坏其结构，结构上的不同是该合成子是发生碳碳键的偶联。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围并不仅限于这些实施例。
实施例1
1、将1.8g(7.6mmol)2-溴-2-甲基-3-三甲基硅基-环丙烷基甲醇、3.3g(15.2mmol)氯铬酸吡啶鎓加入25mL二氯甲烷中，常温搅拌4小时，用硅藻土过滤、二氯甲烷洗脱，减压浓缩后，用柱色谱纯化，得到黄色液体化合物2，其产率为79％，结构表征数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)9.48(d,J＝4.3,1H),2.46-2.43(dd,J＝8.6,4.3Hz,1H),1.98(s,3H),0.92(d,J＝8.6Hz,1H),0.16(s,9H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ(ppm)198.49,42.35,41.21,27.69,25.67,-1.24。
2、在氮气保护下，将3.9g(12mmol)四溴化碳溶解于4mL干燥的二氯甲烷中，冷却到0℃，加入6.2g(24mmol)三苯基膦，搅拌10分钟，形成二溴亚甲基磷叶立德，然后加入1.4g(6mmol)化合物2，在0℃下继续搅拌反应30分钟，减压浓缩，用柱层色谱纯化，得到淡黄色液体化合物3，其产率为89％，结构表征数据为：1H NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm)6.07(d,J＝8.3Hz,1H),2.24-2.21(t,J＝8.5Hz,1H),1.86(s,3H),0.16(s,9H),0.08(d,J＝8.7Hz,1H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ(ppm)136.36,89.89,40.99,35.13,28.89,25.51,-1.06。
3、在氮气保护下，将1.6g(4mmol)化合物3溶解于100mL干燥的乙醚中，冷却到-78℃，滴加3.6mL(8mmol)正丁基锂，并在-78℃搅拌1小时，用饱和氯化铵水溶液淬灭反应后，用乙醚萃取(3×100mL)，有机相经饱和NaCl水溶液洗涤、无水硫酸钠干燥、过滤、减压浓缩后，用柱层色谱纯化，得到淡黄色液体化合物——甲基环丙烯合成子，其产率为91％，结构表征数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)2.02(d,J＝2.1Hz,1H),1.94(s,3H),1.90-1.88(dd,J＝8.6,2.1Hz,1H),0.18(d,J＝8.6Hz,1H),0.15(s,9H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ(ppm)82.89,68.23,40.11,29.07,26.08,20.69,-1.17。
实施例2
采用实施例1的甲基环丙烯合成子合成甲基环丙烯脱氧尿嘧啶核苷，具体合成方法如下：
1、在氮气保护下，将98mg(0.42mmol)甲基环丙烯合成子、100mg(0.28mmol)5-碘-2'-脱氧尿苷、10.7mg(0.06mmol)碘化亚铜、0.12mL(0.84mmol)三乙胺、32mg(0.03mmol)四(三苯基磷)钯溶解于6mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，在常温下加热搅拌30分钟后，用饱和氯化铵水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取(3×100mL)，有机相经水洗涤(3次)、无水硫酸钠干燥、过滤、减压浓缩后，柱色谱纯化，得到黄色固体化合物4，其产率为79％，结构表征数据为：1H NMR(400MHz,MeOD)δ(ppm)8.29(s,1H),6.26-6.22(t,J＝6.5Hz,1H),4.41-4.39(dd,J＝6.5,3.2Hz,1H),3.94-3.92(m,1H),3.84-3.80(dd,J＝12.0,3.0Hz,1H),3.76-3.72(dd,J＝12.0,3.4Hz,1H),2.31-2.18(m,2H),2.10(d,J＝8.5Hz,1H),1.96(s,3H),0.38-0.35(dd,J＝8.5,2.2Hz,1H),0.17(s,9H)；13C NMR(100MHz,MeOD)δ(ppm)164.31,150.96,144.57,100.42,92.96,88.89,86.75,72.48,71.68,62.27,42.13,41.51,29.57,27.50,22.73,-1.31。
2、将100mg(0.22mmol)化合物4溶解于8mL乙醇中，加入10mg钯碳，通入氢气，常温搅拌2小时，用硅藻土过滤、乙酸乙酯洗脱、柱色谱纯化，得到淡黄色固体化合物5，其产率为85％，结构表征数据为：1H NMR(600MHz,MeOD)δ(ppm)7.91-7.88(m,1H),6.31-6.27(dt,J＝10.4,6.6Hz,1H),4.44-4.41(dt,J＝9.5,3.9Hz,1H),3.96-3.90(m,1H),3.83-3.79(dd,J＝4.9,3.3Hz,1H),3.76-3.73(dd,J＝3.4,1.3Hz,1H),2.46-2.40(m,2H),2.27-2.25(td,J＝6.4,3.5Hz,2H),1.79(d,J＝29.2Hz,3H), 1.56-1.52(m,1H),1.43-1.39(dd,J＝15.9,7.1Hz,1H),0.93-0.89(dd,J＝18.2,6.6Hz,1H),0.10(s,9H),-0.33-(-0.37)(dd,J＝19.0,9.0Hz,1H)；13C NMR(150MHz,MeOD)δ(ppm)165.70,152.06,138.42,114.91,88.70,86.32,71.97,62.55,41.16,33.35,30.08,27.88,27.78,27.61,23.16,-0.97。
3、在氮气保护下，将85mg(0.18mmol)化合物5溶解于6mL干燥的四氢呋喃中，滴加0.35mL(0.36mmol)四丁基氟化铵，常温搅拌6小时，柱色谱纯化，得到淡黄色固体化合物，即式I所示的甲基环丙烯脱氧尿嘧啶核苷，其产率为75％，结构表征数据为：1H NMR(400MHz,MeOD)δ(ppm)7.83(s,1H),6.70(d,J＝3.1Hz,1H),6.30(t,J＝6.7Hz,1H),4.42-4.39(dt,J＝6.5,3.5Hz,1H),3.93-3.91(q,J＝3.2Hz,1H),3.84-3.67(m,2H),2.34-2.19(m,4H),2.08(s,3H),1.50(d,J＝4.1Hz,1H),1.41(d,J＝4.9Hz,1H),0.90(d,J＝6.5Hz,1H)；13C NMR(100MHz,MeOD)δ(ppm)165.83,152.09,137.98,124.76,115.91,105.82,88.68,86.14,72.12,62.63,41.11,35.82,26.58,18.74,11.54。
上述甲基环丙烯脱氧尿嘧啶核苷与四嗪探针按照摩尔比为10:1在DMF溶液中进行反应，反应速度快，能够实现体外标记。
实施例3
实施例1的甲基环丙烯合成子合成甲基环丙烯脱氧腺嘌呤核苷，具体合成方法如下：
1、在氮气保护下，将46mg(0.2mmol)甲基环丙烯合成子、50mg(0.13mmol)脱氧腺嘌呤核苷、4.6mg(0.026mmol)碘化亚铜、0.054mL(0.39mmol)三乙胺、15mg(0.013mmol)四(三苯基磷)钯溶解于2mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，在常温下加热搅拌30分钟后，用饱和氯化铵水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取(3×100mL)，有机相经水洗涤(3次)、无水硫酸钠干燥、过滤、减压浓缩后，用柱层色谱纯化，得到黄色固体化合物6，其产率为82％，结构表征数据为：1H NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm)8.18(s,1H),7.14(s,1H),6.19-6.17(dd,J＝9.5,3.7Hz,1H),5.88(s,2H),4.72(d,J＝4.9Hz,1H),4.16(s,1H),3.91(d,J＝12.5Hz,1H),3.77(d,J＝12.1Hz,1H),3.0-2.95(m,1H),2.25-2.23(dd,J＝13.3,8.0Hz,1H),2.11(d,J＝2.5Hz,1H),1.97(s,3H),0.26(d,J＝8.4Hz,1H),0.17(s,9H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ(ppm)158.82,153.04,148.99,129.18,106.08,96.40,92.36,90.23,90.01,74.04,73.75,64.31,41.78,41.57,30.31,28.05,22.58,-0.18。
2、将45mg(0.09mmol)化合物6溶解于2mL乙醇中，加入4.5mg钯碳，通入氢气，常温搅拌4小时，用硅藻土过滤、乙酸乙酯洗脱、柱色谱纯化，得到淡黄色固体化合物7，其产率为87％，结构表征数据为：1H NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm)8.18(s,1H),6.79(d,J＝8.5Hz,1H),6.22-6.18(m,1H),4.74(d,J＝4.7Hz,1H),4.16(s,1H),3.94(d,J＝12.5Hz,1H),3.77(d,J＝12.5Hz,1H),3.08-3.03(m,1H),2.90(t,J＝6.9Hz,2H),2.26-2.21(m,2H),1.92-1.81(m,1H),1.72(d,J＝54.3Hz,3H),1.64-1.56(m,1H),1.47-1.41(m,1H),1.28-1.22(m,1H),0.10(s,9H),-0.41-(-0.44)(m,1H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ(ppm)158.54,151.96,150.39,123.41,114.67,105.74,90.23,89.87,74.36,64.51,43.15,,41.39,32.91,32.42,28.55,27.62,23.62,0.09。
3、在氮气保护下，将42mg(0.09mmol)化合物7溶解于3mL干燥的四氢呋喃中，滴加0.18mL(0.18mmol)四丁基氟化铵，常温搅拌8小时，柱色谱纯化，得到淡黄色固体化合物，即式II所示的甲基环丙烯脱氧腺嘌呤核苷，其产率为72％，结构表征数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.17(s,1H),6.72(s,1H),6.65(s,1H),6.18-6.16(dd,J＝9.4,5.6Hz,1H),4.75(d,J＝4.9Hz,1H),4.16(s,1H),3.95(d,J＝12.5Hz,1H),3.77(d,J＝12.5Hz,1H),3.11-3.07(m,1H),2.68-2.65(t,J＝7.8Hz,2H),2.21-2.19(dd,J＝13.3,7.9Hz,1H),2.06(d,J＝9.4Hz,3H),1.73-1.68(m,1H),1.62-1.58(m,1H),1.50-1.49(m,1H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ(ppm)158.63,151.82,150.22, 124.70,124.66,123.08,115.91,106.01,90.37,89.90,74.63,64.60,41.34,37.94,26.71,19.10,12.76。