一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶C296I突变体及其应用的制作方法

文档序号：12411660阅读：234来源：国知局

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶C296I突变体及其应用。

背景技术：

转座子(transposon)是指在基因组上能从一个位点转移到另一个位点的一段DNA序列。自20世纪40年代美国遗传学家McClintock首先在玉米中发现转座子(Ac/Ds)以来，科学家们发现了多种类型的转座子，它们广泛存在于细菌、酵母和高等动植物中。随着人们在分子水平上对转座子结构和功能认识的不断深化，一些转座子已被改造为基因标签应用于基因分析，并逐渐成为大规模分离基因的重要手段之一。

Mariner-Like转座子(Mariner-Like Elements，MLE)是转座子中一个重要家族，最早是在研究毛里塔尼亚果蝇(Drosophila mauristiana)白眼基因的一个不稳定突变时发现的。此后在其他动物以及植物基因组中也发现了大量MLE转座子的存在。与其它转座子相比较，MLE转座子具有结构简单、异源转座率高、在基因组插入位点接近随机等特点，在开发基因标签，分离基因，研究基因功能上，远远优于其他转座子。

MLE转座子由两端反向重复序列(Terminal Inverted Repeats，TIRs)和编码转座酶的基因组成，转座酶负责催化转座子转座，因此转座酶的活性是影响转座子的转座频率的主要因素。然而自然界分离的MLE转座酶由于在进化过程中“垂直失活”效应积累了或多或少的突变，部分或全部丧失了催化转座能力，成为低活性或非活性的转座酶，严重影响了MLE转座子的应用，因此人工构建高活性的转座酶就显得十分重要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶C296I突变体及其应用，解决了现有自然界分离的MLE转座酶催化活性较低或者不具备催化活性的问题。

本发明提供了一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶C296I突变体，所述的Ppmar1转座酶C296I突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种编码所述Ppmar1转座酶C296I突变体的基因，编码所述Ppmar1转座酶C296I突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带有编码所述Ppmar1转座酶C296I突变体的基因。

本发明还提供了一种工程菌株，所述工程菌株携带有上述重组质粒。

本发明还提供了一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶C296I突变体在构建酵母突变体中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶C296I突变体，具有以下有益效果：

本发明从毛竹中克隆到的活性转座酶，对其进行人工改造之后获得较高活性的MLE转座酶突变体(Ppmar1转座酶C296I突变体)，Ppmar1转座酶C296I突变体催化转座子转座的活性是野生型转座酶的活性的2.67倍，为利用MLE转座子开发基因标签奠定了基础，为后基因组时代大规模分离和标记基因，研究基因的功能提供了新工具。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，如Sambrook等主编的《分子克隆实验指南》中所述条件，或按照试剂盒陈述的步骤进行操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

一、野生型MLE转座酶和去除转座酶的非自主性转座子的获得

步骤1.1，采集新鲜的毛竹叶片(Phyllostachyspubescens，采集于浙江农林大学植物园，北纬N30°15′14.67″东经E119°43′33.47″)，利用CTAB法提取毛竹基因组DNA，根据MLE转座子TIR保守序列设计引物Ppmar1-5-3(Ppmar1-5-3的序列信息见表1)，进行PCR扩增，得到MLE转座子扩增产物。

PCR扩增的体系为20μl，包括0.2μl rTaq Polymerase(5U/μl)，1μl Ppmar1-5-3(10μmol/L)，2μl 10×rTaq Buffer(Mg²⁺plus)，1.6μl dNTP mix(2.5mmol/L)，100ng毛竹基因组DNA，加无菌水补齐20μl。

PCR扩增的反应条件为：预变性94℃5min；变性94℃30s，60℃30s，延伸72℃40s，35个循环；72℃2min，4℃10min。

步骤1.2，扩增出序列后，采用TaKaRa公司pMD^TM 18-T Vector Cloning Kit试剂盒的方法将步骤1.1的MLE转座子扩增产物连接到pMD18-T载体，测序确认后，命名为Ppmar1转座子，Ppmar1转座子全长序列如SEQ ID NO.3所示。

步骤1.3，采用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit试剂盒提取毛竹叶片RNA，通过Invitrogen公司的SuperScript^TM VILO^TM cDNA Synthesis Kit试剂盒将RNA反转录为cDNA，根据Ppmar1转座酶序列设计一对引物PpTpase1-5和PpTpase1-3(PpTpase1-5和PpTpase1-3的序列信息见表1)，进行PCR扩增，回收得到Ppmar1转座酶扩增产物，即为Ppmar1转座酶核苷酸序列。

PCR扩增的体系为20μl，包括0.2μl rTaq Polymerase(5U/μl)，0.5μl PpTpase1-5(10μmol/L)，0.5μl PpTpase1-3(10μmol/L)，2μl 10×rTaq Buffer(Mg²⁺plus)，1.6μl dNTP mix(2.5mmol/L)，10ng毛竹叶片cDNA，加无菌水补齐20μl。

PCR扩增的反应条件为：预变性94℃5min；变性94℃30s，55℃30s，延伸72℃40s，35个循环；72℃2min，4℃10min。

步骤1.4，采用TaKaRa公司pMD^TM 18-T Vector Cloning Kit试剂盒的方法将步骤1.3的Ppmar1转座酶核苷酸序列连接到pMD18-T载体克隆，测序确认，Ppmar1转座酶核苷酸序列和相应的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

将含有Ppmar1转座子全长序列的pMD18-T载体用BseR I切除Ppmar1中间转座酶的大部分序列。

酶切体系为50μl，包括5μl 10×buffer，1μl BseR I(1U/μl)，1μg质粒(含有Ppmar1全长序列的pMD18-T载体)，加无菌水补齐50μl，37℃温浴6小时。回收质粒大片段，用T₄DNA Ligase将质粒大片段自连接，得到Ppmar1的非自主性转座子pMD18-T-Ppmar1-Tn(Tn表示非自主性转座子)。

其中，自连接的体系为10μl，包括1μl 10×T₄DNA Ligase buffer，1μl T4DNA Ligase(10U/μl),50ng质粒大片段，加无菌水补齐10μl，16℃温浴8小时。

Ppmar1的非自主性转座子的序列如SEQ ID NO.6所示。

二、酵母转座表达载体的构建

步骤2.1，Ppmar1转座酶表达载体的构建

将步骤1.3的Ppmar1转座酶核苷酸序列经Not I和EcoR V双酶切，回收Ppmar1转座酶酶切产物的大片段；将pAG413-gal-ccdB载体经Not I和EcoR V双酶切，回收pAG413-gal-ccdB载体酶切产物的大片段；且Ppmar1转座酶核苷酸序列的双酶切体系、双酶切条件与pAG413-gal-ccdB载体的双酶切体系、双酶切条件均相同；

其中双酶切体系为50μl，包括5μl 10×buffer，1μl Not I(1U/μl),1μl EcoR(1U/μl)，1μg质粒(Ppmar1转座酶核苷酸序列或者pAG413-gal-ccdB载体)，加无菌水补齐50μl，双酶切条件为：37℃温浴6小时。

将Ppmar1转座酶酶切产物的大片段和pAG413-gal-ccdB载体酶切产物的大片段相连接；

连接体系为10μl，包括1μl 10×T4DNA Ligase buffer，1μl T4DNA Ligase(10U/μl),50ng pAG413-gal-ccdB载体酶切产物的大片段，20ng Ppmar1转座酶酶切产物的大片段，加无菌水补齐10μl，16℃温浴8小时。

此时完成了用Ppmar1转座酶核苷酸序列替换pAG413-gal-ccdB质粒中的ccdB核苷酸序列，得到重组质粒pAG413-gal-Tpase(Tpase表示转座酶)；

该重组质粒pAG413-gal-Tpase即为Ppmar1转座酶表达载体，其携带有编码所述Ppmar1转座酶的基因。该表达载体具有His(组氨酸)筛选标记，使导入pAG413-gal-Tpase载体的宿主能够缺乏His的缺失培养基上生长。

步骤2.2，Ppmar1非自主转座子供体载体的构建

以步骤1.4的Ppmar1的非自主性转座子pMD18-T-Ppmar1-Tn为模板，利用Ppmar1-5-3引物扩增Ppmar1的非自主性转座子，进行PCR扩增，得到Ppmar1的非自主性转座子扩增产物。

PCR扩增的体系为20μl，包括0.2μl rTaq Polymerase(5U/μl)，1μl Ppmar1-5-3(10μmol/L)，2μl 10×rTaq Buffer(Mg²⁺plus)，1.6μl dNTP mix(2.5mmol/L)，10ng pMD18-T-Ppmar1-Tn，加无菌水补齐20μl。

PCR扩增的反应条件为:预变性94℃5min；变性94℃30s，60℃30s，延伸72℃40s，35个循环；72℃2min，4℃10min。

同时，将载体pWL89a用Xho Ⅰ酶切(酶切位点位于ADE2基因内)，回收载体pWL89a骨架。酶切体系为50μl，包括5μl 10×buffer，1μl Xho Ⅰ(1U/μl),1μg载体pWL89a，加无菌水补齐50μl，37℃温浴6小时。

然后用In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit(TaKaRa公司，日本)将Ppmar1的非自主性转座子扩增产物插入到载体pWL89a骨架的ADE2基因中，导致报告基因ADE2插入失活，得到pWL89a-Tn重组质粒，即为Ppmar1非自主转座子供体载体。若转座子发生转座从ADE2基因上离开，那么ADE2基因阅读框得到回复。该载体具有URA3筛选标记，使导入pWL89a-Tn的宿主能够在缺乏Ura(尿素)的缺失培养基上生长。

三、Ppmar1转座酶C296I突变体的获得

将Ppmar1转座酶核苷酸序列与其他植物MLE转座酶的核苷酸序列进行同源性比对，选取Ppmar1转座酶核苷酸序列296位置上的半胱氨酸开展突变，计划将其突变为异亮氨酸(C296I)。

步骤3.1，根据QuikChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司，美国)试剂盒说明书，设计定点突变引物C296I-F和C296I-R(C296I-F和C296I-R的序列信息见表1)，按照QuikChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit试剂盒方法，以步骤2.1的重组质粒pAG413-gal-Tpase为模板，利用PfuTurbo^TM DNA polymerase重新合成含有Ppmar1转座酶C296I突变体的质粒DNA；

步骤3.2，然后在合成的质粒DNA中加入2μL的Dpn I限制性内切酶，于37℃条件下反应5min，将原始模板序列彻底降解。将新合成的质粒DNA测序确认后得到Ppmar1转座酶C296I突变体；

Ppmar1转座酶C296I突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述Ppmar1转座酶C296I突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

四、转座酶活性的检测

实验组是将步骤3.1的含有Ppmar1转座酶C296I突变体的质粒DNA和步骤2.2的pWL89a-Tn重组质粒，用PEG/LiAc法共同转化到酵母中，用His/Ura双缺固体培养基上进行选择培养。用半乳糖诱导转座酶表达，促使非自主转座子发生转座。

以野生型Ppmar1转座酶为对照组，步骤2.1的带有野生型的Ppmar1转座酶的重组质粒pAG413-gal-Tpase和步骤2.2的pWL89a-Tn重组质粒，用PEG/LiAc法共同转化到酵母中，用His/Ura双缺固体培养基上进行选择培养。用半乳糖诱导转座酶表达，促使非自主转座子发生转座。

实验组和对照组的经诱导培养的酵母用缺失His/Ura/Ade固体培养基上进行选择培养，计算培养基上长出的酵母菌斑。如果转座发生，pWL89a-Tn重组质粒上的ADE2基因就能表达，因此阳性酵母株能够在缺乏腺嘌呤的培养基上生长。

以野生型Ppmar1转座酶为对照，比较转化有Ppmar1转座酶C296I突变体的酵母菌落数目，筛选出较高活性的转座酶突变株，结果如表2所示。

由表2可知，野生型Ppmar1转座酶的阳性酵母菌落数量明显小于Ppmar1转座酶C296I突变体，且Ppmar1转座酶C296I突变体催化转座能力提高到原来的267％。这个高活性人工改造的Ppmar1转座酶C296I突变体将为利用Ppmar1转座子开发基因标签奠定了重要基础。

表1本发明应用的引物序列

表2不同转座酶诱导的阳性酵母菌落数量和催化活性

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 浙江农林大学

<120> 一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶C296I突变体及其应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 499

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Asp Pro Ile Asp Ser Gly Phe Asp Leu Asn Val Arg Leu Glu

1 5 10 15

Glu Asp Asp Asp Gly Asn Leu Pro Phe Asp Leu Asn Glu Pro Ile Leu

20 25 30

Glu Asp His Asn Asn Gly Ile Asp Leu Asn Leu Pro Leu Asp Glu Phe

35 40 45

Gly Ala Val Asp Phe Asp Tyr Val Gln Asn Leu Ala Glu Gln Asp Val

50 55 60

Glu Ala Pro Val Gln Val His Pro Pro Lys His Asp Tyr Pro Glu His

65 70 75 80

Val Arg Lys Leu Val Tyr Gln Ala Leu Leu Met Arg Ser Lys Asn Gly

85 90 95

Lys Leu Gly Asn His Asp Thr Thr Ile Val Ser Ser Gln Phe Gly Val

100 105 110

Lys Ile Arg Ser Val Gln Arg Ile Trp Lys Gln Gly Lys Asn Gln Leu

115 120 125

Ala Gln Asn Ile Pro Val Val Val Ala Asn Leu Lys Lys Gly Arg Ser

130 135 140

Gly Arg Lys Ala Thr Pro Leu Asp Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ile Pro

145 150 155 160

Leu Lys Gln Arg Met Thr Ile Glu Asp Val Ser Ser Arg Leu Gly Ile

165 170 175

Ser Lys Ser Arg Ile Gln Arg Tyr Leu Lys Lys Gly Leu Leu Arg Arg

180 185 190

His Ser Ser Ser Ile Lys Pro Tyr Leu Thr Asp Ala Asn Lys Lys Thr

195 200 205

Arg Leu Lys Trp Cys Ile Asp Met Ile Glu Gln Gly Leu Val Asp Asp

210 215 220

Pro Lys Phe Arg Asp Leu Phe Asp Phe Val Phe Ile Asp Glu Lys Trp

225 230 235 240

Phe Asn Leu Ser Gln Lys Ser Glu Arg Tyr Tyr Leu Leu Pro Asp Glu

245 250 255

Asp Glu Pro His Arg Thr Cys Lys Asn Lys Asn Tyr Ile Pro Arg Ile

260 265 270

Met Phe Leu Cys Val Cys Ala Arg Pro Arg Phe Arg Asn Gly Glu Cys

275 280 285

Val Phe Asp Gly Lys Ile Gly Ile Phe Pro Leu Val Thr Phe Glu Gln

290 295 300

Ala Ile Arg Gly Ser Gln Asn Arg Leu Arg Gly Glu Gln Val Ile Lys

305 310 315 320

Pro Ile Gln Ser Ile Asn Arg Glu Val Ile Arg Asp Phe Met Ile Asn

325 330 335

Arg Val Leu Pro Ala Ile Arg Ala Lys Trp Pro Arg Glu Asp Val His

340 345 350

Lys Pro Ile Phe Ile Gln Gln Asp Asn Val Pro Ser His Leu Lys Val

355 360 365

Asp Asp Pro Gln Phe Arg Glu Val Ala Lys Gln Asp Gly Phe Asp Ile

370 375 380

Arg Leu Ile Cys Gln Pro Pro Asn Ser Pro Asp Phe Asn Ile Leu Asp

385 390 395 400

Leu Gly Phe Phe Arg Ala Ile Gln Ala Ile Gln Tyr Lys Lys Asp Ala

405 410 415

Lys Thr Leu Lys Asp Leu Ile Pro Ala Val Gln Gln Ala Phe Leu Glu

420 425 430

Tyr Ser Pro Trp Lys Ala Asn Arg Ile Phe Val Thr Leu Gln Thr Val

435 440 445

Leu Lys Glu Ala Met Lys Ile Lys Gly Cys Asn Lys Ile Lys Ile Pro

450 455 460

His Ile Gln Lys Gln Arg Leu Glu Arg Glu Asp Arg Leu Pro Leu Gln

465 470 475 480

Ile Pro Cys Glu Ala Ser Leu Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ser Leu Pro

485 490 495

Ala Ala Asn

<210> 2

<211> 1500

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggctgacc caatagattc tggcttcgat ctgaacgttc ggttagaaga agatgatgac 60

ggcaatcttc cctttgatct caacgagcca atattggaag atcacaacaa tggaattgat 120

ttgaacttgc cattagatga gtttggtgcc gtcgacttcg actatgtaca aaacctcgct 180

gaacaagatg ttgaggctcc cgttcaagta caccctccga agcatgacta tcctgaacat 240

gttagaaaac tagtgtacca agcattgttg atgagaagca agaatgggaa actaggcaat 300

catgatacaa caattgtttc cagtcaattt ggagtaaaga ttcgatcagt tcagcgcata 360

tggaagcaag gtaaaaacca acttgctcaa aacattccgg tcgtggttgc taatctaaag 420

aaaggtagaa gtggccgtaa agcaacccct cttgatttgg aacaattgcg caacattcct 480

ctcaagcaaa gaatgaccat agaagatgtg tctagtagac ttggtattag caaatctagg 540

atacaaaggt atttgaaaaa gggtttgctt aggcgccact ctagtagcat aaaaccttac 600

ctcaccgatg ctaacaagaa gactaggttg aagtggtgca ttgacatgat tgagcaaggt 660

ttggttgatg atccaaagtt cagggatttg tttgactttg tgtttattga tgagaagtgg 720

ttctacctct ctcaaaaatc cgagagatac tacttgctac ccgacgaaga tgaaccacat 780

cgcacttgca agaacaagaa ttacatccct aggatcatgt ttttgtgtgt ttgtgctcgg 840

ccaagattta gaaatggaga atgtgtgttt gatggcaaaa taggtatttt tccactagtc 900

acttttgaac aagctattag aggaagccaa aaccgtcttc gtggagaaca agtaatcaag 960

ccaattcaat caattaatag ggaagtgata agagatttca tgataaatag agtgttgcct 1020

gcaattagag caaagtggcc aagagaagat gtacacaagc caattttcat acaacaagat 1080

aatgttccat ctcatttaaa ggtggatgat cctcagtttc gtgaggttgc taagcaagat 1140

gggtttgaca ttaggctcat atgtcaacca cccaattctc cagattttaa cattctagat 1200

ttgggttttt ttcgagctat tcaagcaatt caatacaaga aagatgctaa gacattgaaa 1260

gatctaattc cagcagtcca acaggcattt ttggagtact ctccatggaa agcaaatagg 1320

atatttgtga cactacaaac tgttttgaag gaagcaatga agataaaagg ttgcaacaaa 1380

atcaaaattc ctcacatcca gaaacaaaga cttgagagag aagataggct gccattgcaa 1440

atcccttgtg aagcttcctt gctagccgaa gcacttgcaa gccttcctgc agctaattag 1500

<210> 3

<211> 3435

<212> DNA

<213> 毛竹基因组

<400> 3

tactccctcc atacccgaaa ttcctgacgt ttaggacatg attgtggtaa ccaaggagtg 60

attaattagg ggttagtttt ccatctttgc ccctaataaa tatggttacg ggtgctcttt 120

gtacgagaaa gtaaaccagc tcgactggct agcgcgcgga ggcctcagtc ctgtggtgcg 180

cgttcgatac ctcgcggacg caggtttttt tcttgttgct gtttattcat ttttgcatgg 240

cactgtttag gcaacgcacg tcgcgcgcgc ttagccgctg cgggcgttag ttttcgagtg 300

gatttgggcc tggcgcacgg aggaggttgc atggctgccc gaaaatttcg ttgcatgcac 360

tggattttca aaattttgtc ctcgcgctgt ggaggctcgt ttgaggccgc gttttttttc 420

atctggcgcg ctggaaggcc gacgtttgga gtgctcgttg cttgttctat ttaaacgcct 480

ggaaccttcc ttgttgtctt cctatgccgg actcctgtac tatggctgac ccaatagatt 540

ctggcttcga tctgaacgtt cggttagaag aagatgatga cggcaatctt ccctttgatc 600

tcaacgagcc aatattggaa gatcacaaca atggtaagca aaaacgtcaa attagtttct 660

cagtttctcg tttccttttt tctttactga gcttgtcgtt tcctttttcg ataggaattg 720

atttgaactt gccattagat gagtttggtg ctgtcgactt cgactatgta caaaacctcg 780

ctggtaagca tggctagtat tatgaattcg cttgtttttt tatttccttt tgctggaaca 840

tgccgtgaat aatagtatta tgaactcgct tgttttttat ttccttttac tagaacatgt 900

gcttgtttta ttcctatagc tagatcatga cgtcaatact ttttacgatg aatatgctcg 960

ttacagtata gctagaacat gccgtgacta catagtagta tgaatatgct tgttttattt 1020

ctataactat aacatgccgt gagtatattt agatcatgcc gtgagtacta agtactatta 1080

aaatgcttgt tttttatttc cttttgctag aacaagatgt tgaggctccc gttcaagtac 1140

accctccgaa gcatgactat cctgaacatg ttagaaaact agtgtaccaa gcattgttga 1200

tgagaagcaa gaatgggaaa ctaggcaatc atgatacaac aattgtttcc agtcaatttg 1260

gagtaaagat tcgatcagtt cagcgcatat ggaagcaagg taaaaaccaa cttgctcaaa 1320

acattccggt cgtggttgct aatctaaaga aaggtagaag tggccgtaaa gcaacccctc 1380

ttgatttgga acaattgcgc aacattcctc tcaagcaaag aatgaccata gaagatgtgt 1440

ctagtagact tggtattagc aaatctagga tacaaaggta tttgaaaaag ggtttgctta 1500

ggcgccactc tagtagcata aaaccttacc tcaccgatgc taacaagaag actaggttga 1560

agtggtgcat tgacatgatt gagcaaggtt tggttgatga tccaaagttc agggatttgt 1620

ttgactttgt gtttattgat gagaagtggt tctacctctc tcaaaaatcc gagagatact 1680

acttgctacc cgacgaagat gaaccacatc gcacttgcaa gaacaagaat tacatcccta 1740

ggatcatgtt tttgtgtgtt tgtgctcggc caagatttag aaatggagaa tgtgtgtttg 1800

atggcaaaat aggttgtttt ccactagtca cttttgaaca agctattaga ggaagccaaa 1860

accgtcttcg tggagaacaa gtaatcaagc caattcaatc aatcaatagg gaagtgataa 1920

gagatttcat gataaataga gtgttgcctg caattagagc aaagtggcca agagaagatg 1980

tacacaagcc aattttcata caacaagata atgctccatc tcatttaaag gtggatgatc 2040

ctcagttttg tgaggttgct aagcaagatg ggtttgacat taggctcata tgtcaaccac 2100

ccaattctcc agattttaac attctagatt tgggtttttt tcgagctatt caagcaattc 2160

aatacaagaa agatgctaag acattgaaag atctaattcc agcagtccaa caggtaaatg 2220

atcatccatt acagtgttta aattgatctt gaacaaataa tataatcact gatcttgaac 2280

atgttttgta ggcatttttg gagtactctc catggaaagc aaataggata tttgtgacac 2340

tacaaactgt tttgaaggaa gcaatgaaga taaaaggttg caacaaaatc aaaattcctc 2400

acatccagaa acaaagactt gagagagaag ataggctgcc attgcaaatc ccttgtgaag 2460

cttccttgct agccgaagca cttgcaagcc ttcctgcggc taattagaag atgcaagcat 2520

gttactcttt tgcagcagca agcatgtaag aagacgcgag catgttagta gcaaactatg 2580

aacaaactag tttatgcatg tagtagtatg ttagcttgtg caccttagtc atctcgtccc 2640

aaccgcttga taacatgctc aggaagaagt attgtgtcac catccatttc aagtttctcc 2700

acatcaggaa tgtagacctc acaatcaaac ttttccatgt catcgagcca cttcgctgtc 2760

atgtcgtagt cttcatgtaa aaggccacaa cgggcacaca tgcgagcttc gcggcgagct 2820

tggtagcagg cttctccgaa gacgccgccg gcgtggaacg taacacagcg aggacacaga 2880

gactcgacgg agtcgggatc gacggtgtcg ggcaccatct cgagggagtc tgcaaccatg 2940

tcgacggagt ccggcagctc ctcgacggag tccggcacca tgtcgacggt gtccggcagc 3000

tcctcgacgg agtctggcac ctcctgcggc gccatgtcca cggtgtccag cgacgctatg 3060

gagcccgacg agatgtcctg cacggcgacg tccagcgccg caacggactc cgtcgtttcc 3120

atctgatccg acgaggcatc gacgtcctgc gacgagcgtg gcggcgagag cacggcgagc 3180

gggcaggcga gcgggcaggc gagcgagcca ttcgcgcgag cgatgaatgc gagctgctgt 3240

accaggcgca cacacgcgca atcaatgcgg gcgagtaacg atgcgagcat gcgcggcgga 3300

agcgcaacag acgggcagca gcgcatggcc aggggcaaac gcgtgaaaag aagaccacgc 3360

gaggccacaa cgtcagcttt tgcgcaaacg ggcacttcgc ctagaacgtc aggaatttcg 3420

ggtatggagg gagta 3435

<210> 4

<211> 1500

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4