本发明涉及n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯及其衍生物的制备方法。
背景技术：
生物素-亲合素系统(biotin-avidinsystem，bas)，是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。由于它具有生物素与亲合素之间高度亲和力及多级放大效应，并与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合，使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。生物素-亲合素系统已经广泛应用于生物医学实验研究的各个领域，既可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。
生物素广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄(α型)和肝组织(β型)，提取αβ两型的生物活性基本相同，现已可人工合成。生物素在机体内以辅酶形式参与各种羧化酶反应，故又称为辅酶r或维生素h。分子量为244.31，分子中有两个环状结构，其中i环为咪唑酮环，是与亲合素结合的主要部位；ii环为噻唑环，上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的唯一结构。
利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素，以适合与各种生物大分子结合的需要。主要有用于标记蛋白质氨基的生物素n-羟基丁二酰亚胺酯(bnhs)和生物素对硝基酚酯(pbnp)。然而上述两种活化生物素的水溶性均较差，但是被标记的蛋白质等生物大分子通常以水作为最佳溶剂。为了增进生物素标记反应的效率，可以将生物素修饰成水溶性较好的n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯，sulfo-nhs。该活化生物素可以与被标记物在水相中顺利发生均相反应，生成连接有生物素的生物大分子，应用于各种检测以及定位观察等研究领域。
n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯的反应活性较高，容易在制备和储存的过程中变质，至今没有成熟的合成方法被报道。
技术实现要素：
本发明之目的是提供一种原料易得、工艺简单、环境友好，并且适合大量生产的n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯及其衍生物的制备方法，能够避免了产物在后处理过程中变质分解，解决高活性水溶性活化生物素的制备困难问题。
由此，本发明提供一种n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯及其衍生物的制备方法，该方法是使生物素与n-羟基琥珀酰亚胺磺酸或n-羟基琥珀酰亚胺磺酸盐发生反应而得到n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯或其衍生物，化学反应式如下：
在上述反应式中，
该方法包括如下步骤：
步骤一：将生物素与n-羟基琥珀酰亚胺磺酸或n-羟基琥珀酰亚胺磺酸盐加入到第一溶剂中，在缩合剂的作用下发生缩合反应；
步骤二：将步骤一反应后得到的反应液中的所述第一溶剂去除，剩余物用色谱进行分离，并收集含有n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯或其衍生物的分离溶液；
步骤三：去除所述分离溶液中的第二溶剂，得到n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯或其衍生物。
作为优选方式，所述缩合剂为二环己基碳二亚胺、n,n'-二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、氯化亚砜或草酰氯。
作为优选方式，所述第一溶剂为二甲基亚砜或n,n-二甲基甲酰胺。
作为优选方式，步骤三中去除分离溶液中的第二溶剂的方式为冻干、旋转蒸发或其组合。
作为优选方式，步骤二中所述色谱为高效液相色谱或中压制备色谱。
作为优选方式，所述第一溶剂可以与所述第二溶剂相同或不同。
本发明还提供一种n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯及其衍生物的制备方法，该方法是使生物素与n-羟基琥珀酰亚胺磺酸或n-羟基琥珀酰亚胺磺酸盐发生反应而得到n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯或其衍生物，化学反应式如下：
在上述反应式中，
该方法包括如下步骤：
步骤一：将生物素与n-羟基琥珀酰亚胺磺酸或n-羟基琥珀酰亚胺磺酸盐加入到第一溶剂中，在缩合剂的作用下发生缩合反应；
步骤二：将步骤一反应后得到的反应液中加入第三溶剂，搅拌后所述反应液变浑浊；
步骤三：在所述反应液分层后，去除上清液，得到位于下层的n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯或其衍生物。
作为优选方式，所述缩合剂为二环己基碳二亚胺、n,n'-二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、氯化亚砜或草酰氯。
作为优选方式，所述第一溶剂为二甲基亚砜或n,n-二甲基甲酰胺。
作为优选方式，所述第三溶剂为乙醇、甲醇、四氢呋喃、乙醚、乙腈中的一种或多种。
本发明的特点是适合放大生产，原料易得，制备工艺简单，对环境友好，避免了产物在后处理过程中变质分解的技术问题。
具体实施方式
在此记载的实施例为本发明的特定的具体实施方式，用于说明本发明的构思，均是解释性和示例性的，不应解释为对本发明实施方式及本发明范围的限制。除在此记载的实施例外，本领域技术人员还能够基于本申请权利要求书和说明书所公开的内容采用显而易见的其它技术方案，这些技术方案包括对在此记载的实施例做出任何显而易见的替换和修改的技术方案。
本发明的n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯及其衍生物的制备方法是使生物素与n-羟基琥珀酰亚胺磺酸或n-羟基琥珀酰亚胺磺酸盐发生反应而得到n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯或其衍生物，化学反应式如下：
在上述反应式中，
作为第一实施例，本发明的方法可以包括如下步骤：
步骤一：将生物素与n-羟基琥珀酰亚胺磺酸或n-羟基琥珀酰亚胺磺酸盐加入到第一溶剂中，在缩合剂的作用下发生缩合反应；
步骤二：将步骤一反应后得到的反应液中的所述第一溶剂去除，剩余物用色谱进行分离，并收集含有n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯或其衍生物的分离溶液；
步骤三：去除所述分离溶液中的第二溶剂，得到n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯或其衍生物。
需要说明的是，所述缩合剂可以为二环己基碳二亚胺、n,n'-二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、氯化亚砜或草酰氯。
所述第一溶剂可以为二甲基亚砜或n,n-二甲基甲酰胺。
作为本实施例的进一步实施方式，步骤三中去除分离溶液中的第二溶剂的方式可以为冻干、旋转蒸发或其组合。
作为本实施例的进一步实施方式，步骤二中所述色谱可以为高效液相色谱或中压制备色谱。
请注意，在本发明中，所述第一溶剂与所述第二溶剂可以是同一种溶剂，也可以不同的溶剂，本领域技术人员可以根据生产的实际需要来确定。
作为第二实施例，本发明的方法可以包括如下步骤：
步骤一：将生物素与n-羟基琥珀酰亚胺磺酸或n-羟基琥珀酰亚胺磺酸盐加入到第一溶剂中，在缩合剂的作用下发生缩合反应；
步骤二：将步骤一反应后得到的反应液中加入第三溶剂，搅拌后所述反应液变浑浊；
步骤三：在所述反应液分层后，去除上清液，得到位于下层的n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯或其衍生物。
与第一实施例一样，在第二实施例中所述缩合剂也可以为二环己基碳二亚胺、n,n'-二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、氯化亚砜或草酰氯。
所述第一溶剂也可以为二甲基亚砜或n,n-二甲基甲酰胺。
作为本实施例的进一步实施方式，所述第三溶剂可以为乙醇、甲醇、四氢呋喃、乙醚中的一种或多种。
为了更清楚地理解本发明，下面还相应于上述第一和第二实施例说明具有更具体限定的示例一和示例二，当然这些具体示例是用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。
在下面的示例一和示例二中，所制备的产品是n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯钠盐，其属于n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯的衍生物。
示例一
n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯钠盐的制备，化学反应式为：
步骤一：冰水浴的条件下，将生物素(244.3mg，1mmol)、dcc(412mg，2.0mmol)和n-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠(217.1mg，1.0mmol)加入到dmf(20ml)中，在冰水浴中搅拌1小时；然后，升温到室温，在室温下搅拌24小时。
步骤二：用蒸发仪将步骤一反应液中dmf去除，剩余物通过制备型高效液相色谱进行分离，其中，洗脱剂为乙腈和水的混合体系，分离后得到含有产物n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯钠盐的乙腈、水混合溶液。
步骤三：将步骤二得到的混合溶液通过减压旋蒸去除乙腈，再通过冻干去除水分，最终得到产物n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯钠盐的固体粉末210mg，收率47％，ms:443。
示例二
n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯钠盐的制备，化学反应式为：
步骤一：冰水浴的条件下，将生物素(244.3mg，1mmol)、edc(383mg，2.0mmol)和n-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠(217.1mg，1.0mmol)加入到dmso(20ml)中，在冰水浴中搅拌1小时；然后，升温到室温，在室温下搅拌24小时。
步骤二：向步骤一反应液中加入四氢呋喃，搅拌后反应液变浑浊。
步骤三：将步骤二中的浑浊反应液通过离心分离，去除上清液；再向下层粘稠物中加入四氢呋喃，搅拌离心，去除上清液；所得到的粗产物通过中压制备色谱分离，所得到的产品溶液通过减压旋蒸和冻干得到n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯钠盐固体粉末181mg，收率40％，ms:443。
以上对本发明的n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯及其衍生物的制备方法的实施方式进行了说明。对于本发明的n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯及其衍生物的制备方法的具体特征可以根据上述披露的特征的作用进行具体改进，这些改进均是本领域技术人员能够实现的。而且，上述披露的各技术特征并不限于已披露的与其它特征的组合，本领域技术人员还可根据本发明之目的进行各技术特征之间的其它组合，以实现本发明之目的为准。