具有抗菌和促进伤口愈合功能的海藻酸钠‑载银石墨烯复合膜及其应用的制作方法

本发明涉及海藻酸钠复合材料，具体涉及一种同时具有促进伤口愈合功能和抗菌功能的海藻酸钠-载银石墨烯复合膜及其制备方法。

背景技术：

海藻酸钠是一种天然高分子化合物，主要来源于海洋中的褐藻。海藻酸钠是由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸残基两种单元结构通过α-1-4糖苷键构成的一种嵌段共聚物。作为一种多糖类的天然物质，海藻酸钠高分子材料具有良好的生物相容性、吸水性、透氧性、无毒性及成膜性等优良特性。以此为基础，海藻酸钠薄膜与其他高分子混合制备的复合薄膜在抗菌和创伤类伤口敷料的应用引起了研究者的关注，并且一些藻酸盐伤口辅料已得到商业化的应用，如Comfeel PlusTM(康乐保)、SorbsanTM(UDL实验室)、和TegagenTM(3m医疗)等。单一的海藻酸钠薄膜不仅抗菌效果欠佳而且力学性质较差，遇水易吸水膨胀、融化。这些缺点使单一的海藻酸钠膜在抗菌和促进伤口愈合方面的应用受到了限制。因此，一种既具有促进伤口愈合和抗菌功能又具有良好力学性能、方便使用的海藻酸钠复合材料急需开发。

美国《细胞移植》(Cell Transplant，2010年，第19卷，第399-408页)，报道了通过将交联海藻酸与基质细胞衍生因子-1结合制成的可以促进伤口愈合并减少伤口瘢痕形成的海藻酸钠复合敷料。通过这种方法制备的海藻酸钠/基质细胞衍生因子-1复合物虽然可以促进伤口的愈合，但是不具备良好的抗菌功能，不能有效的降低或防止伤口在愈合过程中发生感染的风险。

英国《材料化学杂志》(Journal of Materials Chemistry，2011,第21卷,第4593–4597页)，报道了通过将硝酸银与还原石墨烯-聚苯乙烯硫酸钠复合物混合制备的具有抗菌效果的银/石墨烯抗菌复合材料。这种方法制备的银/石墨烯复合物虽然具有抗菌的作用，但并不具有可以促进伤口愈合的功能。另外，银/石墨烯复合物为液体状复合物，没有被制备成薄膜状，储存及使用的便利性欠佳。

综上所述，现有的一些抗菌或促进伤口愈合的材料，要么只具有抗菌的功能，无法加快伤口的愈合速度，导致伤口愈合缓慢；要么只具有促进伤口愈合的功能，无法有效的抗菌，导致伤口在愈合的过程中出现被感染的风险，不利于伤口的愈合和恢复，不宜于推广应用。

技术实现要素：

本发明为解决上述现有技术所存在的不足之处，提供了具有抗菌和促进伤口愈合功能的海藻酸钠-载银石墨烯复合膜及其制备方法，并将其用于作为创伤伤口敷料，旨在解决现有创伤伤口敷料作用单一、不能够同时兼顾抗菌和促进伤口愈合功能的缺点。

本发明为解决技术问题，采用如下技术方案：

具有抗菌和促进伤口愈合功能的海藻酸钠-载银石墨烯复合膜的制备方法，其特点在于按如下步骤进行：

a、取100～300mg氧化石墨烯片加入到150～300mL蒸馏水中，超声分散后，加入2g聚苯乙烯硫酸钠，搅拌溶解，再加入150～400μL水合肼，加热至100℃回流反应24小时，所得产物经抽滤、冻干后，即获得还原型氧化石墨烯-聚苯乙烯硫酸钠复合物；

b、将步骤a获得的所述还原型氧化石墨烯-聚苯乙烯硫酸钠复合物加入至50～100mL水中，混合均匀，放入至单颈瓶中，加热至60℃，然后将5～10mL浓度为0.02mol/L的硝酸银溶液以0.5mL/h的速度加入单颈瓶中，加完后继续恒温搅拌10h，离心并去除上清液，获得载银石墨烯溶液；

c、将所述载银石墨烯溶液与5～25mL浓度为15～35mg/mL的海藻酸钠溶液混合，震荡、超声，混合均匀后获得海藻酸钠-载银石墨烯混合溶液；

d、通过喷涂组装法将所述海藻酸钠-载银石墨烯混合溶液制备成膜，即获得海藻酸钠-载银石墨烯复合膜。

本发明的海藻酸钠-载银石墨烯复合膜，可以根据需要做成任意形状或尺寸，各原料用量也可等比例放大，例如按照上述条件即可获得厚度为10～40μm、尺寸为1～100cm²的复合膜。

本发明的海藻酸钠-载银石墨烯复合膜具有仿贝壳层状结构，这种结构可以有效提高其力学性能。

与已有技术相比，本发明有益效果体现在：

1、本发明所提供的海藻酸钠-载银石墨烯复合膜，制备方法简单，且同时具有抗菌(如抗白色念珠菌和抗大肠杆菌)和促进伤口愈合的功能，用于作为创伤伤口敷料，有明显的效果，具有较大的临床应用潜力。

2、本发明所提供的海藻酸钠-载银石墨烯复合膜，具有低毒、无污染、生物相容性好且细胞毒性低的优点，是一种安全性很高的材料；

3、本发明所提供的海藻酸钠-载银石墨烯复合膜，其尺寸、厚度均可调控，实用性强，具有较高的临床和市场应用潜力；

4、本发明所提供的海藻酸钠-载银石墨烯复合膜为层状结构，力学性能良好，具有很高的柔韧性，可弯曲折叠，为其作为具有抗菌和促进伤口愈合的薄膜提供了良好的力学基础。

附图说明

图1本发明实施例1所制备的海藻酸钠-载银石墨烯复合膜的(a)截面扫描电镜图(SEM,Zeiss Supra 40,Germany)、(b)透射电子显微镜图(TEM,Hitachi HT7700)、(c)Mapping能谱和(d)扫描电镜能谱(EDS,X-Max,Oxford)。

图2为本发明实施例1所制备的几种厚度复合膜的(a)截面扫描电镜图以及厚度-密度的关系曲线(b)。

图3为本发明实施例1所制备的几种不同薄膜的(a)XRD图和(b)紫外吸收图谱。

图4为本发明实施例1所制备的几种不同薄膜的截面扫描电镜图。

图5为本发明实施例1所制备的几种不同薄膜的力学性能图。

图6为本发明实施例1所制备的几种不同薄膜的抗大肠杆菌和抗白念珠菌效果图。

图7为本发明实施例1所制备海藻酸钠-载银石墨烯复合膜促进伤口愈合的效果图。

具体实施方式

下述实施例所用氧化石墨烯片按如下步骤制备：

将50mL浓度为98％的H₂SO₄、10g的K₂S₂O₈、10g的P₂O₅的混合溶液加热至70℃，加入30g石墨粉搅拌均匀后得到混合物A；将混合物A冷却至室温后，用蒸馏水抽滤洗涤至其pH值为中性，将洗涤后的产物在空气中干燥后，得到预氧化石墨粉；取15g预氧化石墨粉加入到500mL、0℃的98％的浓H₂SO₄中得到混合溶液B；在搅拌、水浴条件下，在混合溶液B中缓慢加入60g的KMnO₄，加入KMnO₄的过程中保持体系温度在15℃，得到混合溶液C；将混合溶液C升温至40℃，搅拌3h，加入950mL蒸馏水，然后在15分钟内加入3L蒸馏水和50mL的30％的H₂O₂，得到黄色产物D；将黄色产物D中的金属离子用5L体积浓度为10％的HCl过滤洗涤，晾干，即得到氧化石墨烯片。

实施例1

本实施例按如下步骤进行海藻酸钠-载银石墨烯复合膜的制备：

a、取200mg氧化石墨烯片加入到200mL蒸馏水中，超声分散后，加入2g聚苯乙烯硫酸钠，搅拌溶解，再加入200μL水合肼，加热至100℃回流反应24小时，所得产物经抽滤、冻干后，获得还原型氧化石墨烯-聚苯乙烯硫酸钠复合物；

b、将步骤a获得的还原型氧化石墨烯-聚苯乙烯硫酸钠复合物加入至50mL水中，混合均匀，放入至100mL的单颈瓶中，加热至60℃，然后将5mL浓度为0.02mol/L的硝酸银溶液以0.5mL/h的速度通过双注射泵慢慢加入单颈瓶中，加完后继续恒温搅拌10h，离心并去除上清液(为了去除未长到石墨烯片上的硝酸银)，获得载银石墨烯溶液；

c、将载银石墨烯溶液与5mL浓度为20mg/mL的海藻酸钠溶液混合，震荡、超声，混合均匀后获得海藻酸钠-载银石墨烯混合溶液；

d、以玻璃片为基底，通过喷涂组装法将海藻酸钠-载银石墨烯混合溶液制备成膜，即获得海藻酸钠-载银石墨烯复合膜。

图1本实施例所制备的海藻酸钠-载银石墨烯复合膜的(a)截面扫描电镜图(SEM,Zeiss Supra 40,Germany)、(b)透射电子显微镜图(TEM,Hitachi HT7700)、(c)Mapping能谱和(d)扫描电镜能谱(EDS,X-Max,Oxford)。可以看出海藻酸钠-载银石墨烯复合膜为层状结构，包含碳、钠、银三种特征元素，且在海藻酸钠-载银石墨烯复合膜的原始溶液中银颗粒分布均匀，银颗粒尺寸在10nm左右。

通过对喷涂组装法的简单调控，可以将海藻酸钠-载银石墨烯混合溶液制备成不同厚度的复合膜，图2(a)为本实施例所制备的几种厚度复合膜的截面扫描电镜图(SEM,Zeiss Supra 40,Germany)，可以看出复合膜厚度的可调控性。通过分析，所获得的复合膜厚度与喷涂在基底上的海藻酸钠-载银石墨烯混合溶液中海藻酸钠-载银石墨烯的单位面积质量呈线性关系，如图2(b)所示。

为对比不同薄膜的性能，本实施例按如下方式制作如下几种薄膜：

海藻酸钠膜的制备方法：将2g的海藻酸钠加入到100mL的去离子水中，然后搅拌、超声，直至海藻酸钠彻底溶于去离子水中(海藻酸钠溶液的浓度为20mg/mL)。以玻璃片为基底，通过喷涂组装法将海藻酸钠溶液制备成膜，即获得海藻酸钠膜。

海藻酸钠-石墨烯复合膜的制备方法：将制备的海藻酸钠溶液与石墨烯溶液混合后(海藻酸钠与石墨烯的质量比为4：1)，震荡、超声，直至石墨烯溶液与海藻酸钠溶液混合均匀。然后将二者的混合物通过喷涂组装的方法制备成海藻酸钠-石墨烯复合膜。

海藻酸钠-银复合膜的制备方法：将制备的海藻酸钠溶液与纳米银颗粒水溶液混合(海藻酸钠与纳米银颗粒的质量比为12.5：1)后震荡、超声，直至纳米银颗粒溶液与海藻酸钠溶液混合均匀。然后将二者的混合物通过喷涂组装的方法制备成海藻酸钠-银复合膜。

图3(a)为四种薄膜的XRD图，可以看出：只有海藻酸钠-载银石墨烯复合膜即在2theta＝38.2°和2theta＝44.3°时出现了银的特征峰，又在2theta＝20°时出现了石墨烯的特征峰。证明了本实施例制备的海藻酸钠-载银石墨烯复合膜含有银和石墨烯的成分。

如图3(b)所示，利用紫外可见分光光度计对海藻酸钠-载银石墨烯复合膜和海藻酸钠-石墨烯复合膜进行分析，可以看出海藻酸钠-载银石墨烯复合膜在波长等于446nm处有明显的银的吸收峰，而作为对照的海藻酸钠-石墨烯复合膜则没有此峰。进一步证明了海藻酸钠-载银石墨烯复合膜含有银的成分。

图4为四种薄膜的SEM图((a)为海藻酸钠膜，(b)为海藻酸钠-银复合膜，(c)为海藻酸钠-石墨烯复合膜，(d)为海藻酸钠-载银石墨烯复合膜)，可以看出：四种膜中，海藻酸钠膜和海藻酸钠-银膜没有掺入石墨烯，所以其截面没有层状结构；而海藻酸钠-石墨烯膜和海藻酸钠-载银石墨烯膜因掺入石墨烯而使截面形成层状结构。纳米级石墨烯片的掺入而形成的有序层状结构增强了膜的力学性能。

如图5所示，将制备的4种膜进行力学性质的测试，可以看出，含有石墨烯成分的两种膜(海藻酸钠-载银石墨烯复合膜和海藻酸钠-石墨烯复合膜)的拉伸应力分别为161.2±4.6Mpa和146±6.0MPa；而不含石墨烯成分的两种膜的拉伸应力(海藻酸钠膜和海藻酸钠—银复合膜)分别只有57.0±5.0MPa和65.0±4.9MPa。说明了石墨烯成分的加入提高了膜的拉伸应力。海藻酸钠膜的拉伸应变数值为6.5％，海藻酸钠-载银石墨烯复合膜、海藻酸钠-石墨烯复合膜、海藻酸钠-银复合膜的拉伸应变数值分别为5.2％、5.7％、6.3％，说明了石墨烯成分的加入没有对膜的拉伸应变造成显著的降低。

为测试4种膜的抗菌性能，将四种膜剪成直径约为1公分大小的圆形，并分别与浓度为1×10⁶的大肠杆菌和白念珠菌在温度为37℃培养基中共培养24小时，然后观察并拍照，如图6所示。可以看出：经过24小时的共培养，海藻酸钠-载银石墨烯复合膜对大肠杆菌和白念珠菌都有抗菌效果。海藻酸钠-石墨烯复合膜和海藻酸钠膜则基本上对两种菌的生长无抑制作用。海藻酸钠-银复合膜虽然对两种菌的生长都有抑制效果，但是膜的力学性质较海藻酸钠-载银石墨烯复合膜较差，发生了吸水溶胀的现象。

为测试4海藻酸钠-载银石墨烯复合膜的促进伤口愈合功能，将成年雄性SD大鼠麻醉后剔除背部毛发，使用无菌手术剪在背部左右两侧各剪出直径约为1.2cm的圆形创口，其中，背部左侧伤口作为对照组，不作任何处理。右侧伤口贴上与伤口大小基本相同的海藻酸钠-载银石墨烯复合膜作为试验组，并分别于第一天、第三天、第五天和第七天进行观察并拍照记录，如图7所示。可以看出，实验组的皮肤创口在第7天时出现了明显的愈合迹象，而相比之下，对照组的皮肤创口在7天后没有明显的愈合迹象。这说明了海藻酸钠-载银石墨烯复合膜具有促进创口愈合的功能。

因此，本发明的海藻酸钠-载银石墨烯复合膜，同时具备抗菌和促进伤口愈合功能的功能，具有很大的临床运用潜力。

实施例2

本实施例按如下步骤制备海藻酸钠-载银石墨烯复合膜：

a、取300mg氧化石墨烯片加入到200mL蒸馏水中，超声分散后，加入2g聚苯乙烯硫酸钠，搅拌溶解，再加入200μL水合肼，加热至100℃回流反应24小时，所得产物经抽滤、冻干后，即获得还原型氧化石墨烯-聚苯乙烯硫酸钠复合物；

b、将步骤a获得的还原型氧化石墨烯-聚苯乙烯硫酸钠复合物加入至100mL水中，混合均匀，放入至250mL的单颈瓶中，加热至60℃，然后将10mL浓度为0.02mol/L的硝酸银溶液以0.5mL/h的速度通过双注射泵慢慢加入单颈瓶中，加完后继续恒温搅拌10h，离心并去除上清液，获得载银石墨烯溶液；

c、将载银石墨烯溶液与10mL浓度为25mg/mL的海藻酸钠溶液混合，震荡、超声，混合均匀后获得海藻酸钠-载银石墨烯混合溶液；

d、以玻璃片为基底，通过喷涂组装法将海藻酸钠-载银石墨烯混合溶液制备成膜，即获得海藻酸钠-载银石墨烯复合膜。

经X射线衍射(Philips X'Pert PRO SUPER X-ray diffractometer)和扫描电镜能谱(EDS,X-Max,Oxford)证明，本实施例所制备的海藻酸钠-载银石墨烯复合膜含有碳、钠、银三种特征元素。经过抗菌实验和大鼠皮肤创伤愈合实验表明本实施例所制备的海藻酸钠-载银石墨烯复合膜具有良好的抗菌功能和良好的促进大鼠皮肤伤口愈合的功能。

实施例3

本实施例按如下步骤制备海藻酸钠-载银石墨烯复合膜：

a、取200mg氧化石墨烯片加入到300mL蒸馏水中，超声分散后，加入2g聚苯乙烯硫酸钠，搅拌溶解，再加入400μL水合肼，加热至100℃回流反应24小时，所得产物经抽滤、冻干后，即获得还原型氧化石墨烯-聚苯乙烯硫酸钠复合物；

b、将步骤a获得的还原型氧化石墨烯-聚苯乙烯硫酸钠复合物加入至100mL水中，混合均匀，放入至250mL的单颈瓶中，加热至60℃，然后将10mL浓度为0.02mol/L的硝酸银溶液以0.5mL/h的速度通过双注射泵慢慢加入单颈瓶中，加完后继续恒温搅拌10h，离心并去除上清液，获得载银石墨烯溶液；

c、将载银石墨烯溶液与15mL浓度为30mg/mL的海藻酸钠溶液混合，震荡、超声，混合均匀后获得海藻酸钠-载银石墨烯混合溶液；

d、以玻璃片为基底，通过喷涂组装法将海藻酸钠-载银石墨烯混合溶液制备成膜，即获得海藻酸钠-载银石墨烯复合膜。

经X射线衍射(Philips X'Pert PRO SUPER X-ray diffractometer)和扫描电镜能谱(EDS,X-Max,Oxford)证明，本实施例所制备的海藻酸钠-载银石墨烯复合膜含有碳、钠、银三种特征元素。经过抗菌实验和大鼠皮肤创伤愈合实验表明本实施例所制备的海藻酸钠-载银石墨烯复合膜具有良好的抗菌功能和良好的促进大鼠皮肤伤口愈合的功能。

实施例4

本实施例按如下步骤制备海藻酸钠-载银石墨烯复合膜：

a、取100mg氧化石墨烯片加入到150mL蒸馏水中，超声分散后，加入2g聚苯乙烯硫酸钠，搅拌溶解，再加入150μL水合肼，加热至100℃回流反应24小时，所得产物经抽滤、冻干后，即获得还原型氧化石墨烯-聚苯乙烯硫酸钠复合物；

b、将步骤a获得的还原型氧化石墨烯-聚苯乙烯硫酸钠复合物加入至100mL水中，混合均匀，放入至150mL的单颈瓶中，加热至60℃，然后将10mL浓度为0.02mol/L的硝酸银溶液以0.5mL/h的速度通过双注射泵慢慢加入单颈瓶中，加完后继续恒温搅拌10h，离心并去除上清液，获得载银石墨烯溶液；

c、将载银石墨烯溶液与15mL浓度为30mg/mL的海藻酸钠溶液混合，震荡、超声，混合均匀后获得海藻酸钠-载银石墨烯混合溶液；

d、以玻璃片为基底，通过喷涂组装法将海藻酸钠-载银石墨烯混合溶液制备成膜，即获得海藻酸钠-载银石墨烯复合膜。

经X射线衍射(Philips X'Pert PRO SUPER X-ray diffractometer)和扫描电镜能谱(EDS,X-Max,Oxford)证明，本实施例所制备的海藻酸钠-载银石墨烯复合膜含有碳、钠、银三种特征元素。经过抗菌实验和大鼠皮肤创伤愈合实验表明本实施例所制备的海藻酸钠-载银石墨烯复合膜具有良好的抗菌功能和良好的促进大鼠皮肤伤口愈合的功能。

实施例5

本实施例按如下步骤制备海藻酸钠-载银石墨烯复合膜：

a、取100mg氧化石墨烯片加入到200mL蒸馏水中，超声分散后，加入2g聚苯乙烯硫酸钠，搅拌溶解，再加入400μL水合肼，加热至100℃回流反应24小时，所得产物经抽滤、冻干后，即获得还原型氧化石墨烯-聚苯乙烯硫酸钠复合物；

b、将步骤a获得的还原型氧化石墨烯-聚苯乙烯硫酸钠复合物加入至100mL水中，混合均匀，放入至250mL的单颈瓶中，加热至60℃，然后将10mL浓度为0.02mol/L的硝酸银溶液以0.5mL/h的速度通过双注射泵慢慢加入单颈瓶中，加完后继续恒温搅拌10h，离心并去除上清液，获得载银石墨烯溶液；

c、将载银石墨烯溶液与5mL浓度为15mg/mL的海藻酸钠溶液混合，震荡、超声，混合均匀后获得海藻酸钠-载银石墨烯混合溶液；

d、以玻璃片为基底，通过喷涂组装法将海藻酸钠-载银石墨烯混合溶液制备成膜，即获得海藻酸钠-载银石墨烯复合膜。

经X射线衍射(Philips X'Pert PRO SUPER X-ray diffractometer)和扫描电镜能谱(EDS,X-Max,Oxford)证明，本实施例所制备的海藻酸钠-载银石墨烯复合膜含有碳、钠、银三种特征元素。经过抗菌实验和大鼠皮肤创伤愈合实验表明本实施例所制备的海藻酸钠-载银石墨烯复合膜具有良好的抗菌功能和良好的促进大鼠皮肤伤口愈合的功能。

以上所述仅为本发明的示例性实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。