一种复合菌群及其在Cr(VI)污染土壤修复中的应用的制作方法

本发明属于环境微生物技术领域，具体地说，涉及一种复合菌群及其在Cr(VI)污染土壤修复中的应用。

背景技术：

在重金属污染中，Cr(VI)因其毒性大、氧化性强以及致癌性高，对人类和动植物的安全造成了非常大的威胁。Cr(VI)主要来自铬渣，全国每年新排放铬渣约60万吨，历年累积堆存铬渣约548万吨。由于Cr(VI)极易溶于水，经雨水淋漓，各种形式污染的Cr(VI)最终会到达水体和土壤。据统计，我国受Cr(VI)严重污染的土壤面积就高达500万平方米，污染土方量约1500万立方。因此，对我国Cr(VI)污染土壤进行合理有效的修复已经迫在眉睫。较之Cr(VI)的高毒性及高迁移性，Cr(III)则毒性低且溶解性低，迁移转化慢，因此修复Cr(VI)污染的一个重要思路就是将Cr(VI)转化为Cr(III)。然而，化学方法还原Cr(VI)往往成本高、能耗大且容易造成二次污染。随着生物技术的发展，很多生物技术在环境治理方面得到了应用，而微生物修复技术以其成本低、处理彻底、无二次污染等受到了广大研究者的青睐。其中微生物还原法利用土著微生物或高效外源微生物，将Cr(VI)还原为Cr(III)，从而达到Cr(VI)污染土壤的修复目的。因此，微生物还原技术被视为Cr(VI)污染土壤修复领域的潜在优势技术，一直是该领域的研究热点。

自从上世纪70年代首次发现微生物能够还原Cr(VI)以来，国内外研究者已经从不同环境中筛选出大量Cr(VI)还原菌株，其中包括Escherichia coli，Shewanella sp.，Pannonibacter sp.，Pseudomonas sp.，Leucobacter sp.，Aspergillus sp.，Bacillus sp.等。单一菌株在修复Cr(VI)土壤时，其生长和Cr(VI)还原活性受多种环境因素影响，诸如pH值、温度、无机盐和其他重金属、以及有机有毒物质等，导致Cr(VI)还原效率不稳定，在一定程度上限制了微生物修复技术的应用。采用合适的菌株构建Cr(VI)还原复合菌群，能有效增强群落刚性，应对其他重金属或有机污染的刺激，适应不同的土壤环境，克服单一菌株还原效率不稳定的局限性，是一种高效的、还原效率稳定的Cr(VI)污染土壤修复方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种复合菌群及其在Cr(VI)污染土壤修复中的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供的一种用于Cr(VI)污染土壤修复的复合菌群，所述复合菌群包含保藏编号为CGMCC No.3052的Pannonibacter phragmitetus BB菌、保藏编号为ATCC No.700550的Shewanella oneidensis MR-1菌和保藏编号为ATCC No.700007的Pseudomonas putida F1菌。

其中，P.phragmitetus BB为申请人前期从铬渣堆场土壤中分离得到，该菌现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.3052，保藏日期2009年5月5日。

上述复合菌群中S.oneidensis MR-1、P.putida F1均购自美国模式培养物集存库(ATCC)。

上述菌株的培养基均为Luria-Bertani培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g溶解于1L去离子水中，121℃高压下蒸汽灭菌20min，用无菌1mol/L NaOH溶液调节pH＝9。

本发明还提供用于Cr(VI)污染土壤修复的复合菌剂，所述复合菌剂由保藏编号为CGMCC No.3052的Pannonibacter phragmitetus BB菌的菌液、保藏编号为ATCC No.700550的Shewanella oneidensis MR-1菌的菌液和保藏编号为ATCC No.700007的Pseudomonas putida F1菌的菌液组成。三种菌液的体积比依次为3-6:3-6:3-6。其中，所述菌液是指在LB培养基中长至对数期的发酵液。

P.phragmitetus BB、S.oneidensis MR-1和P.putida F1三种菌液的体积比可依次为1:1:1、2:1:1、1:2:1、1:1:2。优选1:2:1。

本发明还提供所述复合菌群或所述复合菌剂在制备Cr(VI)污染土壤修复剂中的应用。

本发明还提供所述复合菌群或所述复合菌剂在Cr(VI)污染土壤修复中的应用。

所述应用是将在LB液体培养基中长至对数期的各菌液按比例加入到含LB液体培养基的灭菌土壤中，用NaOH溶液调pH至9，在30±2℃150±10rpm条件下培养至少2天。

其中，灭菌土壤所含Cr(VI)浓度为30～200mg/L。

前述的应用，菌液总添加量为所述LB液体培养基体积的12％。

在本发明的一个具体实施方式中，利用所述复合菌群修复Cr(VI)污染土壤的方法如下：

(1)将P.phragmitetus BB、S.oneidensis MR-1、P.putida F1从平板上挑取单菌落到20mL LB液体培养基中，待OD₆₀₀达0.9转接到100mL LB培养基(pH＝9)进行扩大培养，待各扩大培养基的OD₆₀₀达0.9，收获菌液；

(2)将含Cr(VI)浓度为30～200mg/L的污染土壤过10目筛，灭菌，将10g灭菌土壤加至60mL灭菌的LB液体培养基中，再将各菌液按LB液体培养基体积3～6％的量加入到上述含LB液体培养基的灭菌土壤中，用1mol/L NaOH溶液调pH至9；

(3)30℃150rpm培养2天后，离心收集上清液，测定上清液中残留的Cr(VI)浓度。

本发明具有以下优点：

(一)较高的Cr(VI)去除率。

(二)复合菌群对污染土壤的理化性质变化有较强的适应性。

(三)本发明所采用的复合菌群对高浓度Cr(VI)有极强的耐受能力，菌群能够直接、高效地处理高浓度Cr(VI)污染土壤，克服了单一菌群修复效率不稳定以及Cr(VI)耐受能力有限的局限。

(四)本方法具有操作简单，还原效率高、效果稳定，抗冲击力好，成本低等优点。

附图说明

图1为本发明实施例1中pH对P.phragmitetus BB、S.oneidensis MR-1、P.putida F1的生长情况影响；其中，a为P.phragmitetus BB，b为S.oneidensis MR-1，c为P.putida F1。

图2为本发明实施例1中pH对P.phragmitetus BB、S.oneidensis MR-1、P.putida F1及复合菌群Cr(VI)还原能力的影响；其中，a为P.phragmitetus BB，b为S.oneidensis MR-1，c为P.putida F1，d为1:1:1复合菌群。

图3为本发明实施例2中不同接种配比对复合菌群还原Cr(VI)能力的影响。

图4为本发明实施例3中最优条件下复合菌群对土壤的修复效果图；其中，a为低污染土壤的修复效果，b为高污染土壤修复效果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1菌株还原Cr(VI)最优pH值的确定

将P.phragmitetus BB、S.oneidensis MR-1、P.putida F1纯培养到菌液浊度OD₆₀₀＝0.9。

分别按照12％的接种量分别接种到含200mg/L Cr(VI)的LB培养基中形成单一菌株处理组，再按照总接种量12％(P.phragmitetus BB 4％、S.oneidensis MR-1 4％、P.putida F1 4％)的体积比1:1:1接种形成复合菌群处理组。

单一菌株处理组和复合菌群处理组均在不同pH值(pH＝6、7、8、9、10)下对含Cr(VI)污染废水进行修复，30℃150rpm培养7天，观察菌株的生长情况并测定废水中残留Cr(VI)的浓度，确定各菌株及复合菌群修复Cr(VI)的最优pH值。

不同pH值下菌株的生长情况以及Cr(VI)还原情况如图1和图2所示，可知无论是单一菌株还是复合菌群，最优pH均为9。

实施例2复合菌群最优接种配比的确定

复合菌群采用不同的接种配比(P.phragmitetus BB、S.oneidensis MR-1、P.putida F1按1:1:1、2:1:1、1:2:1、1:1:2的体积比)总接种量12％，对含200mg/L Cr(VI)污染废水进行修复，30℃150rpm培养2天，测定废水中残留的Cr(VI)的浓度，确定复合菌群修复Cr(VI)的最优接种配比。不同接种配比下的Cr(VI)还原情况如图3所示，可知P.phragmitetus BB、S.oneidensis MR-1、P.putida F1为1:2:1时修复效果最佳。

实施例1和2中所述接种量是指相对于废水体积的菌液接种量。

实施例3最优条件下的土壤修复实验

采用最优条件(pH＝9、P.phragmitetus BB、S.oneidensis MR-1、P.putida F1按1:2:1的体积比)下复合菌群对不同来源、理化性质不同的Cr(VI)污染土壤(低污染土壤(含30mg/L Cr(VI))和中污染土壤(含200mg/L Cr(VI)))进行处理，具体方法如下：

(1)将P.phragmitetus BB、S.oneidensis MR-1、P.putida F1从平板上挑取单菌落到20mL LB液体培养基中，待OD₆₀₀达0.9接种到100mL LB培养基扩大培养，待各扩大培养基中OD₆₀₀达0.9，按1:2:1的体积比收获菌液。

(2)将Cr(VI)污染土壤过10目筛，称取10g土壤，分别设立三组实验：对照组：10g灭菌土壤+60mL灭菌的LB培养基(空白对照)；实验组1：10g灭菌土壤+60mL灭菌的LB培养基+12％接种的S.oneidensis MR-1；实验组2：10g灭菌土壤+60mL灭菌的LB培养基+12％接种的P.phragmitetus BB；实验组3：10g灭菌土壤+60mL灭菌的LB培养基+12％接种的P.putida F1；实验组4：10g不灭菌土壤+60mL灭菌的LB培养基+12％接种的复合菌群(原位微生物和复合菌群共同作用)；实验组5：10g灭菌土壤+60mL灭菌的LB培养基+12％接种的复合菌群(复合菌群单独作用)，用1mol/L NaOH调节pH值为9。

(3)30℃150rpm培养2天，离心收集上清液。

测定对照组和实验组上清液中残留的Cr(VI)浓度。结果见图4。从图4可以看出，2天后复合菌群可以将污染土壤中可溶性的Cr(VI)全部转变成Cr(III)，实现土壤的高效修复。

与单一菌株对Cr(VI)污染土壤修复实验进行比较，复合菌群还原效率稳定，且几乎完全还原，针对不同污染物浓度和污染来源的土壤均能进行高效修复。P.phragmitetus BB、S.oneidensis MR-1、P.putida F1从不同的原生环境中分离得到，对环境的适应能力不同，P.phragmitetus BB分离自铬渣堆场，对Cr(VI)有较高的耐受性，在碱性pH下更能有效地修复Cr(VI)，S.oneidensis MR-1和P.putida F1具有广谱的环境适应性，可以在修复的不同阶段发挥作用，或应对不同性质土壤时，可先后发挥作用，并通过自身代谢改良土壤微环境，为其他还原菌群发挥功能提供帮助。而且，S.oneidensis MR-1对其他重金属如Fe(III)、U(V)等均存在一定的耐受性和还原作用，P.phragmitetus BB具有一定的芳香族化合物降解能力，P.putida F1则能降解三氯乙烯、苯酚、甲苯等有机污染物，三者配合可以应对不同种类污染物的合并污染情况。另外，P.phragmitetus BB为好氧菌，S.oneidensis MR-1和P.putida F1为兼性菌，可以协同治理不同深度、不同氧气环境的Cr(VI)污染土壤。因此，由这三种具有不同特性的菌株构建而成的复合菌群是复杂土壤修复的有效途径。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。