本发明涉及一种pf1022a分离纯化的方法。
背景技术：
pf1022a(结构式见式1)是一种不产孢子的半知菌无孢霉菌(roselliniasp.)发酵产生的环缩肽类化合物，对动物低毒、驱虫普广、效果好，是合成新型兽药emodepside(结构式见式2)的关键中间体。目前pf1022a主要通过发酵半知菌无孢霉菌获得。
pf1022a作为生产emodepside的关键中间体，其分离纯化报道较少。pf1022a呈弱极性，可溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂，难溶于水。文献“anewanthelminticcyclodepsipeptide，pf1022”(thejournalofantibiotics，1992，45(5)：692-697)报道了一种pf1022a分离纯化的方法，该方法首先利用乙酸乙酯提取出菌体中的产物，萃取液进行浓缩后用氯仿溶解，然后用硅胶柱进行分离层析，以氯仿和甲醇的混合物作为洗脱剂进行洗脱。但是氯仿具有致癌性，硅胶柱不可重复使用，产物的检测方法繁琐，不利于产业化生产。因此有必要改进pf1022a的分离纯化方法。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中pf1022a提取时溶剂毒性大、硅胶柱不可重复利用以及产物的检测方法繁琐的缺陷，而提供一种pf1022a分离纯化的方法，该方法操作简便、成本低、所用溶剂的毒性较小、大孔树脂可反复使用、产物检测方法简单，收率可达70％，适于工业化生产，所得pf1022a的纯度可达91％以上。
本发明提供了一种pf1022a分离纯化的方法，其包括如下步骤：
(1)从含pf1022a的发酵液中收集菌渣；
(2)将丙酮与所述菌渣混合，进行萃取，过滤，得提取液1，然后浓缩，得提取液2；
(3)将所得提取液2上样大孔树脂，预洗脱除杂后，进行洗脱，收集活性部位，得含pf1022a的洗脱液，并将其浓缩至除去有机溶剂，得含pf1022a的浓缩液；
(4)将含pf1022a的浓缩液用乙酸乙酯萃取后，得有机相和水相，将所得有机相浓缩、结晶即可；
所述大孔树脂为h-60反相吸附树脂和/或hb-60反相吸附树脂。
本发明中，含pf1022a的发酵液为本领域常规，一般由半知菌无孢霉菌经过本领域常规方法发酵获得，常规能够生产pf1022a的菌株均可使用，如半知菌无孢霉菌nbrc-33096(购于日本技术评价研究所生物资源中心)，本领域常规的含pf1022a的发酵液均适用于本发明的方法。
在本发明的一较佳实施例中，所述含pf1022a的发酵液由半知菌无孢霉菌(roselliniasp.)nbrc-33096(购于日本技术评价研究所生物资源中心)发酵培养获得，步骤包括：(1)将所述半知菌无孢霉菌nbrc-33096接种于斜面培养中，在26℃下培养6天；(2)将菌丝进行种子培养，在26℃及摇床转速200rpm下，培养4天；(3)在26℃及摇床转速200rpm下，发酵培养7天后即可；其中，所述斜面培养的培养基包含下述浓度的各组分：马铃薯葡萄糖琼脂40.0g/l和琼脂5.0g/l；所述种子培养的培养基包含下述浓度的各组分：葡萄糖10.0g/l、可溶性淀粉20.0g/l、酵母提取物3.0g/l、聚蛋白胨5g/l、麦芽浸粉6.0g/l、热榨黄豆饼粉2.0g/l和caco32.0g/l，且所述种子培养的培养基的初始ph值为6.0；所述发酵培养的培养基包含下述浓度的各组分：葡萄糖20.0g/l、可溶性淀粉50.0g/l、酵母提取物3.8g/l、麦芽浸粉8.0g/l、热榨黄豆饼粉13.0g/l、caco32.0g/l和nacl1.3g/l，且所述发酵培养的培养基的初始ph值为6.0。
步骤(1)中，所述收集菌渣的操作为本领域常规的预处理操作，较佳地为离心或板框过滤。
步骤(2)中，所述丙酮的体积与所述菌渣的质量比较佳地为2:1，单位为l/g，所述萃取的时间较佳地为2h，所述萃取过程中一般会不断搅拌，使菌体处于悬浮状态，以充分提取细胞内的产物。
步骤(2)中，所述菌渣的萃取次数较佳地为2-3次。
步骤(2)中，所述浓缩为本领域常规操作，一般采用旋转蒸发仪，所述浓缩的温度较佳地为35℃，所述提取液2中丙酮浓度较佳地为40％-50％，更佳地为45％-48％，所述百分比为体积百分比。
步骤(3)中，所述预洗脱采用的预洗脱液一般为有机溶剂水溶液，所述有机溶剂水溶液的浓度较佳地为45％～65％，更佳地为55％～63％，所述百分比为体积百分比。所述有机溶剂水溶液较佳地为甲醇水溶液、乙醇水溶液或丙酮水溶液，更佳地为甲醇水溶液或丙酮水溶液。对于所述h-60反相吸附树脂，所述甲醇水溶液的浓度较佳地为55％～63％，所述百分比为体积百分比。所述乙醇水溶液的浓度较佳地为55％～58％，所述百分比为体积百分比。所述丙酮水溶液的浓度较佳地为53％～63％，所述百分比为体积百分比。对于所述hb-60反相吸附树脂，所述甲醇水溶液的浓度较佳地为48％～63％，所述百分比为体积百分比。所述乙醇水溶液的浓度较佳地为45％～65％，所述百分比为体积百分比。所述丙酮水溶液的浓度较佳地为53％～65％，所述百分比为体积百分比。
步骤(3)中，所述预洗脱所采用的所述有机溶剂水溶液的体积较佳地为2～4cv，所述cv为本领域常规计量术语，全称为树脂柱体积，英文名columnvolume。
步骤(3)中，所述洗脱采用的洗脱液一般为有机溶剂水溶液，所述有机溶剂水溶液的浓度较佳地为50％～75％，更佳地为55％～70％，所述百分比为体积百分比。所述有机溶剂水溶液较佳地为甲醇水溶液、乙醇水溶液或丙酮水溶液，更佳地为甲醇水溶液或丙酮水溶液。对于所述h-60反相吸附树脂，所述甲醇水溶液的浓度较佳地为63％～72％，所述百分比为体积百分比。所述乙醇水溶液的浓度较佳地为63％～75％，所述百分比为体积百分比。所述丙酮水溶液的浓度较佳地为60％～70％，所述百分比为体积百分比。对于所述hb-60反相吸附树脂，所述甲醇水溶液的浓度较佳地为55％～75％，所述百分比为体积百分比。所述乙醇水溶液的浓度较佳地为50％～73％，所述百分比为体积百分比。所述丙酮水溶液的浓度较佳地为60％～70％，所述百分比为体积百分比。
步骤(3)中，所述洗脱所采用的所述有机溶剂水溶液的体积较佳地为2～4cv，所述cv为本领域常规计量术语，全称为树脂柱体积，英文名columnvolume。
步骤(3)中，所述活性部位的收集一般按照本领域常规方法经过hplc检测后收集。所述活性部位的pf1022a的hplc纯度较佳地为≥85％，所述pf1022a的hplc纯度的检测方法可按照本领域常规，即通过高效液相色谱检测确定。所述高效液相色谱的监测条件如下：色谱柱为hypersilc18柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相为乙腈：水＝80:20(体积比)；流速为1ml/min；柱温为30℃；检测波长为220nm；进样量为20μl。
步骤(3)中，所述浓缩的温度较佳地为30～45℃，更佳地为35～40℃，最佳地为35℃。
步骤(4)中，所述乙酸乙酯与所述含pf1022a的浓缩液的体积比较佳地为(0.5～4):1，更佳地为(2～3):1，最佳地为2:1。
步骤(4)中，所述水相较佳地用乙酸乙酯进行萃取，所述乙酸乙酯与所述水相的体积比较佳地为(0.5～4):1，更佳地为(2～3):1，最佳地为2:1。
步骤(4)中，所述结晶可按本领域常规结晶操作，所述结晶的温度较佳地为5～20℃，更佳地为5℃。
本发明中，涉及使用的甲醇、丙酮、乙醇及乙酸乙酯均可回收利用。
在符合本领域常识的基础上，本发明中上述的各技术特征优选可以任意组合的到本发明较佳实例。
本发明所用市场和原料均可市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明pf1022a分离纯化的方法，通过对大孔树脂型号的创造性发现，所得pf1022a的收率可达70％，纯度可达91％以上，且操作简便、成本低、所用溶剂的毒性较小、大孔树脂可反复使用、产物检测方法简单，适于工业化生产。
附图说明
图1为实施例3中58％丙酮水溶液预洗脱流出液色谱图。
图2为实施例3中68％丙酮水溶液洗脱流出液色谱图。
图3为实施例3中pf1022a晶体的色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，pf1022a的高效液相色谱检测条件如下：
色谱柱为hypersilc18柱(4.6mm×150mm，5μm)；
流动相为乙腈：水＝80:20(体积比)；流速为1ml/min；柱温为30℃；检测波长为220nm；进样量为20μl。
下述实施例中，h-60反相吸附树脂和hb-60反相吸附树脂均来源于南京林化研究所。
下述实施例中的百分比，除特殊说明外，均为体积百分比。
制备发酵液
制备pf1022a的发酵液，使用的菌株为半知菌无孢霉菌nbrc-33096，购于日本技术评价研究所生物资源中心。
具体发酵培养条件为：
1、斜面培养：将nbrc-33096接种于斜面培养中，26℃培养6天，菌丝生长丰满、外观呈白色。
培养基(g/l)：马铃薯葡萄糖琼脂培养基40.0，琼脂5.0，其中马铃薯葡萄糖琼脂培养基购自上海源聚生物科技有限公司。
2、种子培养：26℃培养4天，摇床转速200rpm
培养基(g/l)：葡萄糖10.0，可溶性淀粉20.0，酵母提取物3.0，聚蛋白胨5，麦芽浸粉6.0，热榨黄豆饼粉2.0，caco32.0，用3mol/l的盐酸溶液调培养基的初始ph值至6.0。
3、发酵培养：26℃培养7天，摇床转速200rpm
培养基(g/l)：葡萄糖20.0，可溶性淀粉50.0，酵母提取物3.8，麦芽浸粉8.0，热榨黄豆饼粉13.0，caco32.0，nacl1.3，用3mol/l的盐酸溶液调培养基的初始ph值至6.0。
制备提取液
将发酵得到的含pf1022a的发酵液经离心过滤后，收集菌渣；
将丙酮与菌渣混合，丙酮的的体积与菌渣的质量比为2:1，单位为l/g，混匀后，在500rpm转速下，萃取2h，过滤，得滤液1和滤饼；
将丙酮与所得滤饼混合，丙酮的的体积与滤饼的质量比为2:1，单位为l/g，混匀后，在500rpm的转速下，萃取2h，过滤，得滤液2；
合并滤液1和滤液2，得提取液1。
制备pf10222a晶体
实施例1-4
将所得提取液1置于旋转蒸发仪上进行浓缩，浓缩温度35℃，然后进行上样，流速为0.2cv，其中cv为本领域常规计量术语，全称为树脂柱体积，英文名columnvolume。选用h-60反相吸附树脂对浓缩液进行吸附，吸附后先用较低浓度丙酮水溶液进行预洗除杂，再用较高浓度丙酮水溶液洗脱pf1022a，收集纯度大于85％的pf1022a(hplc检测)，得洗脱液。洗脱液真空浓缩，浓缩温度35℃，再加入2倍体积的乙酸乙酯萃取2次，有机相真空浓缩，于5℃结晶过滤，获得pf10222a晶体产物。
图1为实施例3中58％丙酮水溶液预洗脱流出液色谱图。峰1～7为杂质。峰1的保留时间为1.091min，峰2的保留时间为1.758min，峰3的保留时间为2.382min，峰4的保留时间为3.086min，峰5的保留时间为3.973min，峰6的保留时间为4.749min，峰7的保留时间为4.847min。
图2为实施例3中68％丙酮水溶液洗脱流出液色谱图。峰8～9为杂质，峰10为pf1022a。峰8的保留时间为1.748min，峰9的保留时间为2.471min，峰10的保留时间为7.578min。
图3为实施例3中pf1022a晶体的色谱图。峰11为pf1022a。峰11的保留时间为7.589min。
实施例5-8
将得提取液1置于旋转蒸发仪上进行浓缩，浓缩温度35℃，然后进行上样，流速为0.2cv，选用h-60反相吸附树脂对浓缩液进行吸附，吸附后先用较低浓度甲醇水溶液进行预洗除杂，再用较高浓度甲醇水溶液洗脱pf1022a，收集纯度大于85％的pf1022a(hplc检测)，得洗脱液。洗脱液真空浓缩，浓缩温度35℃，再加入2倍体积的乙酸乙酯萃取2次，有机相真空浓缩，于5℃结晶过滤，获得pf10222a晶体产物。
实施例9-12
将得提取液1置于旋转蒸发仪上进行浓缩，浓缩温度35℃，然后进行上样，流速为0.2cv，选用h-60反相吸附树脂对浓缩液进行吸附后先用较低浓度乙醇水溶液进行预洗除杂，再用较高浓度乙醇水溶液洗脱pf1022a，收集纯度大于85％的pf1022a(hplc检测)，得洗脱液。洗脱液真空浓缩，浓缩温度35℃，再加入2倍体积的乙酸乙酯萃取2次，有机相真空浓缩，于5℃结晶过滤，获得pf10222a晶体产物。
实施例13-16
将得提取液1置于旋转蒸发仪上进行浓缩，浓缩温度35℃，然后进行上样，流速为0.2cv选用hb-60反相吸附树脂对浓缩液进行吸附，吸附后先用较低浓度丙酮水溶液进行预洗除杂，再用较高浓度丙酮水溶液洗脱pf1022a，收集纯度大于85％的pf1022a(hplc检测)，得洗脱液。洗脱液真空浓缩，浓缩温度35℃，再加入2倍体积的乙酸乙酯萃取2次，有机相真空浓缩，于5℃结晶过滤，获得pf10222a晶体产物。
实施例17-20
将得提取液1置于旋转蒸发仪上进行浓缩，浓缩温度35℃，然后进行上样，选用hb-60反相吸附树脂对浓缩液进行吸附，吸附后先用较低浓度甲醇水溶液进行预洗除杂，再用较高浓度甲醇水溶液洗脱pf1022a，收集纯度大于85％的pf1022a(hplc检测)，得洗脱液。洗脱液真空浓缩，浓缩温度35℃，再加入2倍体积的乙酸乙酯萃取2次，有机相真空浓缩，于5℃结晶过滤，获得pf10222a晶体产物。
实施例21-24
将得提取液1置于旋转蒸发仪上进行浓缩，浓缩温度35℃，然后进行上样，流速为0.2cv，选用hb-60反相吸附树脂对浓缩液进行吸附，吸附后先用较低浓度乙醇水溶液进行预洗除杂，再用较高浓度乙醇水溶液洗脱pf1022a，收集纯度大于85％的pf1022a(hplc检测)，得洗脱液。洗脱液真空浓缩，浓缩温度35℃，再加入2倍体积的乙酸乙酯萃取2次，有机相真空浓缩，于5℃结晶过滤，获得pf10222a晶体产物。
对比例1
将得提取液1置于旋转蒸发仪上进行浓缩，浓缩温度35℃，浓缩至丙酮含量在40～50％之间，然后进行上样，流速为0.2cv，其中cv为本领域常规计量术语，全称为树脂柱体积，英文名columnvolume。选用常用hp-20大孔树脂或者xab-16大孔树脂对浓缩液进行吸附。
在流出液中检测到了pf1022a，说明该树脂不能够吸附产物，不适于pf1022a的层析分离。