一种小分子量铁皮石斛多糖的制备方法与流程

本发明涉及天然产物有效成分提取技术领域，特别涉及一种小分子量铁皮石斛多糖的制备方法。

背景技术：

铁皮石斛（Dendrobium candidum Wall.ex Lindl）为兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）多年生附生型草本植物，富含石斛多糖、石斛碱、氨基酸、菲类化合物及多种微量元素，是我国传统的名贵中药材。铁皮石斛中多用于保健品行业，最主要的活性成分为石斛多糖，口服具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗氧化及延缓衰老等功效。目前化妆品产业也开始应用铁皮石斛多糖作为化妆品原料，但大多是发挥铁皮石斛多糖具备大分子量（>1000kDa）的持久保湿功效，而对于小分子量石斛多糖（平均分子量小于300kDa）在增强皮肤免疫力方面的功效研究则基本未见文献报道。

皮肤作为生态系统，是微生物菌群赖以生存的栖身之地，每平方厘米约有十亿细菌在皮肤表面互利共生，形成微生态的防护盾。在人体皮肤的表面，存在着益生菌、有害菌，益生菌主要有双歧杆菌，嗜酸乳杆菌等乳酸菌属，有害菌则包括链球菌和金黄色葡球菌等。在皮肤卫生情况良好、正常菌群平衡，益生菌占种群优势，皮肤上的代谢产物（皮脂、汗液）大多被有益菌群利用，促使pH下降和皮肤屏障形成，能够抑制有害菌，皮肤状态正常；但当皮肤菌群紊乱，有害菌处于优势地位时，皮肤pH上升，皮肤屏障功能消失，会导致有害微生物侵蚀皮肤，发生炎症。

朗格汉斯细胞(Langerhans cell，LC)是免疫反应中重要的抗原呈递细胞和单核吞噬细胞，能捕获和处理侵入皮肤的抗原，形成抗原肽-MHC分子复合物，并传递给T细胞，可使特异性T细胞增殖和激活，引发免疫应答。

因此，只要能证明本发明制备的小分子量石斛多糖能促进皮肤表面益生菌的生长，及提高皮肤中朗格汉斯细胞的密度，就能够表征其在提高皮肤免疫力方面的作用。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题，是提供一种平均分子量小于300kDa的小分子量铁皮石斛多糖的制备方法，该方法制备的小分子量铁皮石斛多糖可以促进皮肤益生菌增殖，提高皮肤免疫力。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种小分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

A、菌株活化与扩培：无菌条件下，取适量液体培养基配制菌种浓度为1×10⁵-1×10⁶CFU/mL的菌悬液，所述菌种为燕麦镰刀菌，菌种保藏号CICC 14038 ，然后取0.2-0.5mL菌悬液在PDA固体培养基表面划线，20-30℃温度下培养24-48h；挑取分散较好的单菌落接种至含有液体培养基成分的发酵摇瓶中进行扩培，培养温度20-30℃，摇瓶转速200r/min，供氧培养24-72h，氧浓度0.010-0.030mol/L，得燕麦镰刀菌发酵种子液，该发酵种子液中的燕麦镰刀菌浓度达1×10⁴-1×10⁵ CFU/mL；所述液体培养基为含15.0-30.0g/L蔗糖、5.0-10.0g/L酵母粉的MS液体培养基；

B、铁皮石斛破壁处理：50-52℃条件下，按质量比1:20将铁皮石斛粉末与蒸馏水预先混合后倒入不锈钢容器中，以刮边搅拌15rpm的速度，搅拌6-8h，然后利用高压微射流均质机反复高压均质5-10次，均质压力设90-130MPa，均质温度50-52℃，得铁皮石斛破壁匀浆；

C、 发酵培养：在发酵罐中注入适量液体培养基，称取步骤B所得铁皮石斛破壁匀浆投入发酵罐中，量取铁皮石斛破壁匀浆体积5.0-10.0%的燕麦镰刀菌种子液加入发酵罐中，然后加入KH₂PO₄和Na₂HPO₄缓冲溶液调节发酵罐中的料液pH至5.5-7.0，在25-35℃温度下供氧发酵3-5d，氧浓度控制在0.020-0.040mol/L，发酵完成得发酵液；

D、多糖纯化：发酵完成后降至室温，向发酵罐中加入发酵液质量0.5-1.0%的硅藻土助滤剂及发酵液质量5.0-8.0%的脱色活性炭，静置吸附1h，再以板框压滤机过滤去渣，得滤液，然后将滤液与Sevage试剂按照体积比4.0-6.0:1.0进行混合，充分振荡30min，3000r/min转速离心10min，取上清液；再将上清液与质量浓度为95%的乙醇按质量比1.0:1.0-3.0进行混合，静置12-36h，真空抽滤得沉淀，用质量浓度为80%的乙醇洗涤3次，60℃下真空干燥24h，得小分子量铁皮石斛多糖。

本发明制备的小分子量铁皮石斛多糖含量的测定：参照苯酚-硫酸法；小分子量铁皮石斛多糖的分子量测定：利用Sephadex G-200凝胶排阻层析法；小分子量铁皮石斛多糖结构表征需利用高效液相色谱仪对酸解后多糖进行测定。结果表明：本发明制备的小分子量铁皮石斛多糖得率高于32.50%，平均分子量小于300KDa，其主链均由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖及D-甘露糖组成。

本发明所用燕麦镰刀菌（Fusarium avenaceum）购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC 14038；所用PDA培养基购于杭州百思生物技术有限公司；所用蔗糖（CAS 57-50-1）购于阿拉丁试剂（上海）有限公司，纯度≥99.5%；所用酵母粉（CAS 119-44-8）购于北京鸿润宝顺科技有限公司，纯度≥99.0%；所用MS液体培养基为SIGMA公司生产，牌号M5519；所用铁皮石斛粉末为收购自浙江温州乐清市的2年生铁皮石斛鲜枝，自行清洗、晾干、粉碎至50目-100目；所用高压微射流均质机购于上海鲤跃精密机械贸易有限公司，型号M-110EH；所用发酵罐购于南京润泽生物工程设备有限公司，型号RZY-XGX；所用硅藻土购于嵊州市华力硅藻土制品有限公司，牌号为CD06，SiO₂(%)≥85%；所用脱色活性炭购于湖州森盛活性炭有限公司，牌号为ZL-786，亚甲基兰吸附力12mL/0.1g；所用板框压滤机购于昆山市昆工环保机械有限公司，型号为XAMGZ/30U；所用气浴恒温振荡器购于江苏杰瑞尔电器有限公司，型号SHZ-82；所用离心机购于张家港市宇佼机械有限公司，型号为PSF-1000；所用真空抽滤机购于上海科升仪器有限公司，型号为ZF-30L；真空干燥机购于常州日翔干燥设备有限公司，型号SZG-350。

本发明中制备的小分子量铁皮石斛多糖对青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌及嗜酸乳杆菌的生长增殖有促进作用，以实施例1中制备的产品为例，实验如下：

将活化好的4种菌株分别以1.0%的接种量（浓度为10⁶ CFU/mL）接种于分别添加小分子量铁皮石斛多糖质量分数0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的MRS培养基中，每组3个平行实验，38℃条件下培养24h，利用紫外可见分光光度计测定波长600nm处各培养液的吸光度值（OD600_nm）。所用青春双歧杆菌 (Bifidobacterium adolesentis) 菌种编号CICC 6070，婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium infantis）菌种编号CICC 6069，两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）菌种编号CICC 6071，嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）菌种编号CICC 6096均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心；所用MRS培养基购于青岛海博生物技术有限公司；所用紫外可见分光光度计购于尤尼柯（上海）仪器有限公司，型号UV-2100PC。

双歧杆菌与嗜酸乳杆菌在不同浓度小分子量铁皮石斛多糖培养液中OD_600nm值列于表1，不同添加量小分子量铁皮石斛多糖对双歧杆菌及嗜酸乳杆菌生长的影响见图1。

表1 双歧杆菌与嗜酸乳杆菌在不同浓度小分子量铁皮石斛多糖培养液中OD_600nm值

由表1、图1可知，随着小分子量铁皮石斛多糖添加量的增加，典型皮肤益生菌青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌及嗜酸乳杆菌的生长均表现为增长的趋势，在添加量为2.0%（质量百分比）时OD_600nm值达到最大，当小分子量铁皮石斛多糖添加量达到2.5%（质量百分比）时，促生长作用有所减弱，这可能是由于多糖浓度较高，引起培养液的渗透压、pH值发生改变及代谢产物的积累限制了益生菌的增殖导致的。实验结果可以表明，在小于2%（质量百分比）的浓度时，小分子量铁皮石斛多糖对益生菌的生长增殖起到很好的促进作用，是一种有效的益生元。

本发明还通过小分子量铁皮石斛多糖对最接近于人类SLE的动物模型—自发性SLE模型雌性小鼠NZBWF1/J表皮朗格汉斯细胞密度的影响来表征其在提高皮肤免疫力方面的作用，以实施例2中制备的产品为例，实验如下：

将12只2月龄NZBWF1/J雌性小鼠分为地塞米松（Dexamethasone）组6只，地塞米松1.0mg/kg每日腹腔内注射；小分子量铁皮石斛多糖组6只，小分子量铁皮石斛多糖50mg/kg每日腹腔内注射，从小鼠2月龄开始连续用药6个月至小鼠8月龄；SPF级C57BL/6纯系雌性小鼠6只，8月龄。

小鼠乙醚全麻下剪取同一部位小鼠耳部，利用解剖显微镜将耳两侧皮肤分开，刮除两侧软骨，放入pH7.2的生物EDTA分离液中，38℃恒温下浸泡2h，显微镜下分离真表皮，表皮固定于4℃丙酮中20min，用PBS磷酸缓冲液冲洗3次，每次3min。分别加入浓度为1:50的抗小鼠Ia抗原OX3、1:200的抗小鼠Ia抗原OX4及小鼠表皮于eppendorf 微型管中，4℃过夜，PBS冲洗，加入生物素化的羊抗鼠IgG血清，38℃孵育2h，PBS冲洗，加ABC（卵白素/生物素/酶）复合物，孵育1h后PBS冲洗。解剖显微镜下，将表皮平铺于玻片，加底物3-氨基-9-乙基卡巴唑（AEC）室温显色干燥后，甘油明胶封片。

在显微镜下观察，出现橘红色星形细胞即为阳性。表皮朗格汉斯细胞密度（LC/mm²）=每视野平均LC数/表皮面积，表皮面积通过测微尺标定的目镜方格测定。各实验组小鼠表皮LC密度数据列于表2。所用自发性SLE模型雌性小鼠NZBWF1/J购于南京大学-南京生物医药研究院；所用SPF级C57BL/6纯系小鼠，雌性，8月龄，购于广东省医学实验动物中心；解剖显微镜购于深圳市博视达光学仪器有限公司，型号BD-60T。

表2 各实验组小鼠表皮LC密度均值表（LC/mm²）

由表2可知，与地塞米松组SLE型小鼠NZBWF1/J相比，小分子量铁皮石斛多糖组SLE型小鼠NZBWF1/J表皮LC密度明显增高，可能是由于小分子量铁皮石斛多糖促进GM-CSF的生成，同时刺激未成熟的粒细胞、巨噬细胞分化成熟，提高机体的免疫功能，地塞米松作为免疫抑制剂广泛应用于人类及动物自身免疫性疾病的治疗与研究；与C57BL/6纯系小鼠相比，小分子量铁皮石斛多糖组SLE型小鼠NZBWF1/J表皮LC密度也有显著增长。

实验证明，小分子量铁皮石斛多糖可促进皮肤朗格汉斯细胞密度的提高，从而可提升肌肤免疫力，提升肌肤体质。

对照试验：

按照以下步骤制得大分子量铁皮石斛多糖：将铁皮石斛粉末与蒸馏水按质量比1:20投入反应容器中，加热至85℃，浸提3h，完成后抽滤，重复浸提3次，收集滤液，真空干燥浓缩至原有体积的1/5，然后按照滤液：Sevage试剂=6.0:1.0（体积比）混合，充分振荡30min，3000r/min离心10min，取上清液，再按照上清液：95%乙醇=1.0:2.0 (质量比) 加入乙醇，静置24h，真空抽滤机过滤得沉淀，用80%乙醇洗涤3次，60℃真空干燥24h，得大分子量铁皮石斛多糖产品。

所得大分子量铁皮石斛多糖分子量介于730-1180kDa，其主链由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖及D-甘露糖组成。

研究大分子量铁皮石斛多糖对青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌及嗜酸乳杆菌的生长增殖作用，实验方法同上，实验结果见表3。

表3双歧杆菌与嗜酸乳杆菌在不同浓度大分子量铁皮石斛多糖培养液中OD_600nm值

由表3、图2可知，随着大分子量铁皮石斛多糖添加量的增加，典型皮肤益生菌青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌及嗜酸乳杆菌的生长并没有表现出明显的增长趋势，实验结果表明，大分子量石斛多糖(730-1180kDa)对益生菌的生长增殖没有起到明显的促进作用。

通过大分子量铁皮石斛多糖对自发性SLE模型雌性小鼠NZBWF1/J表皮朗格汉斯细胞密度的影响来表征其在皮肤免疫力方面的作用，实验方法同上，实验结果见表4。

表4 各实验组小鼠表皮LC密度均值表（LC/mm²）

由表4可知，与C57BL/6纯系小鼠相比，大分子量铁皮石斛多糖组SLE型小鼠NZBWF1/J表皮LC密度没有明显增长，实验表明，大分子量石斛多糖(730-1180kDa)不能明显促进皮肤朗格汉斯细胞密度的提高，对提升肌肤免疫力几乎不起作用。

综上，经对比试验表明，大分子量石斛多糖在益生菌的生长增殖及皮肤朗格汉斯细胞密度的提高方面均没有明显的促进作用，不能够有效提升肌肤免疫力。

本发明首先利用高压微射流均质法对铁皮石斛粉末进行破壁处理，再利用选自铁皮石斛内生真菌的燕麦镰刀菌来发酵制备小分子量铁皮石斛多糖，其平均分子量小于300KDa。通过对小分子量铁皮石斛多糖在益生菌的生长及小鼠朗格汉斯细胞（(Langerhans cell，LC)）的密度方面的影响进行研究，结果表明小分子量铁皮石斛多糖可有效促进皮肤益生菌的增殖，并可提高皮肤表面朗格汉斯细胞密度，从而提升肌肤免疫力及防御力，维持皮肤健康状态。

本发明提供的小分子量铁皮石斛多糖制备方法，主要利用采用燕麦镰刀菌来发酵，制备小分子铁皮石斛多糖，平均得率高于32.50%。

综上所述，本发明制备的小分子量铁皮石斛多糖平均分子量小于300kDa，可以有效促进皮肤益生菌的增殖，并可提高皮肤表面朗格汉斯细胞密度，从而提升肌肤免疫力及防御力，维持皮肤健康状态。

附图说明

图1 不同添加量小分子量铁皮石斛多糖对双歧杆菌及嗜酸乳杆菌生长的影响；

图2 不同添加量大分子量铁皮石斛多糖对双歧杆菌及嗜酸乳杆菌生长的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步详细说明本发明，但本发明并不仅限于这些实施例。

实施例1：

A、菌株活化与扩培：无菌条件下，用无菌滴管吸取适量液体培养基滴入装有铁皮石斛内生真菌燕麦镰刀菌冻干粉的菌种管内配制成菌种浓度为1×10⁶ CFU/mL的菌悬液，然后取0.2mL菌悬液在PDA固体培养基表面划线，25℃条件下培养48h，挑取分散较好的单菌落接种至含有液体培养基成分的发酵摇瓶中进行扩培，25℃，200r/min条件下供氧培养48h，氧浓度0.030mol/L，制得发酵种子液，其中燕麦镰刀菌浓度为1×10⁵ CFU/mL，所用液体培养基为含蔗糖30.0g/L，酵母粉8.0g/L的MS液体培养基；

B、铁皮石斛破壁处理：50℃条件下，将3kg铁皮石斛粉末与60L蒸馏水预先混合后倒入不锈钢容器中，以刮边搅拌15rpm的速度，搅拌6h，然后利用高压微射流均质机，压力设为90MPa，温度为50℃，反复高压均质8次，获得铁皮石斛破壁匀浆；

C、 发酵培养：将步骤B中所得铁皮石斛破壁匀浆投入发酵罐中，按匀浆体积7.0%的接种量接种入燕麦镰刀菌种子液，发酵罐中液体培养基成分同步骤A，并加入KH₂PO₄和Na₂HPO₄缓冲溶液调节料液pH=7.0，在温度35℃下供氧发酵3d，氧浓度0.040mol/L；

D、多糖纯化：发酵完成后降至室温，向发酵罐中加入发酵液质量0.5%的硅藻土助滤剂及发酵液质量7.0%的脱色活性炭，静置吸附1h，再以板框压滤机过滤去渣，得滤液；然后按照滤液：Sevage试剂=4.0:1.0（体积比）混合，充分振荡30min，3000r/min离心10min，取上清液，再按照上清液：95%乙醇=1.0: 2.0 (质量比) 加入乙醇，静置24h，真空抽滤机过滤得沉淀，用80%乙醇洗涤3次，60℃真空干燥24h，得小分子量铁皮石斛多糖产物1005.6g。

本实施例制备的小分子量铁皮石斛多糖得率为33.52%，平均分子量221.60kDa，其主链由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖及D-甘露糖组成，摩尔比为3.112 : 2.013 : 1.561: 1.034 : 2.487。

实施例2：

A、菌株活化与扩培：无菌条件下，用无菌滴管吸取适量液体培养基滴入装有铁皮石斛内生真菌燕麦镰刀菌冻干粉的菌种管内配制成菌种浓度为8.5×10⁵CFU/mL的菌悬液，然后取0.4mL菌悬液在PDA固体培养基表面划线，20℃条件下培养36h，挑取分散较好的单菌落接种至含有液体培养基成分的发酵摇瓶中进行扩培，20℃，200r/min条件下供氧培养72h，氧浓度0.010mol/L，制得发酵种子液，其中燕麦镰刀菌浓度为6.5×10⁴CFU/mL，所用液体培养基为含蔗糖18.0g/L，酵母粉10.0g/L的MS液体培养基；

B、铁皮石斛破壁处理： 52℃条件下，将3kg铁皮石斛粉末与60L蒸馏水预先混合后倒入不锈钢容器中，以刮边搅拌15rpm的速度，搅拌8h，然后利用高压微射流均质机，压力设为130MPa，温度为52℃，反复高压均质10次，获得铁皮石斛破壁匀浆；

C、 发酵培养：将步骤B中所得铁皮石斛破壁匀浆投入发酵罐中，按匀浆体积10.0%的接种量接种入燕麦镰刀菌种子液，发酵罐中液体培养基成分同步骤A，并加入KH₂PO₄和Na₂HPO₄缓冲溶液调节料液pH=5.5，在温度25℃下供氧发酵5d，氧浓度0.030mol/L；

D、多糖纯化：发酵完成后降至室温，向发酵罐中加入发酵液质量0.8%的硅藻土助滤剂及发酵液质量8.0%脱色活性炭，静置吸附1h，再以板框压滤机过滤去渣，得滤液；然后按照滤液：Sevage试剂=5.0:1.0（体积比）混合，充分振荡30min，3000r/min离心10min，取上清液，再按照上清液：95%乙醇=1.0: 3.0 (质量比) 加入乙醇，静置36h，真空抽滤机过滤得沉淀，用80%乙醇洗涤3次，60℃真空干燥24h，得小分子量铁皮石斛多糖产物1035.6g。

本实施例制备的小分子量铁皮石斛多糖得率为34.52%，平均分子量1.5kDa，其主链由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖及D-甘露糖组成，摩尔比为2.452 : 1.025 : 2.231: 3.154 : 1.562。

实施例3：

A、菌株活化与扩培：无菌条件下，用无菌滴管吸取适量液体培养基滴入装有铁皮石斛内生真菌燕麦镰刀菌冻干粉的菌种管内配制成菌种浓度为1×10⁵CFU/mL的菌悬液，然后取0.5mL菌悬液在PDA固体培养基表面划线，30℃条件下培养24h，挑取分散较好的单菌落接种至含有液体培养基成分的发酵摇瓶中进行扩培，30℃，200r/min条件下供氧培养24h，氧浓度0.020mol/L，制得发酵种子液，其中燕麦镰刀菌浓度为1×10⁴CFU/mL，所用液体培养基为含蔗糖15.0g/L，酵母粉10.0g/L的MS液体培养基；

B、铁皮石斛破壁处理：51℃条件下，将3kg铁皮石斛粉末与60L蒸馏水预先混合后倒入不锈钢容器中，以刮边搅拌15rpm的速度，搅拌6.5h，然后利用高压微射流均质机，压力设为100MPa，温度为51℃，反复高压均质5次，获得铁皮石斛破壁匀浆；

C、 发酵培养：将步骤B中所得铁皮石斛破壁匀浆投入发酵罐中，按匀浆体积5.0%的接种量接种入燕麦镰刀菌种子液，发酵罐中液体培养基成分同步骤A，并加入KH₂PO₄和Na₂HPO₄缓冲溶液调节料液pH=6.0，在温度30℃下供氧发酵4d，氧浓度0.020mol/L；

D、多糖纯化：发酵完成后降至室温，向发酵罐中加入发酵液质量0.7%的硅藻土助滤剂及发酵液质量5.0%脱色活性炭，静置吸附1h，再以板框压滤机过滤去渣，得滤液；然后按照滤液：Sevage试剂=6.0:1.0（体积比）混合，充分振荡30min，3000r/min离心10min，取上清液，再按照上清液：95%乙醇=1.0:1.0 (质量比) 加入乙醇，静置24h，真空抽滤机过滤得沉淀，用80%乙醇洗涤3次，60℃真空干燥24h，得小分子量铁皮石斛多糖产物975.0g。

本实施例制备的小分子量铁皮石斛多糖得率为32.50%，平均分子量110.50kDa，其主链由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖及D-甘露糖组成，摩尔比为1.547: 1.751: 2.323: 2.872: 1.310。

实施例4：

A、菌株活化与扩培：无菌条件下，用无菌滴管吸取适量液体培养基滴入装有铁皮石斛内生真菌燕麦镰刀菌冻干粉的菌种管内配制成菌种浓度为4.2×10⁵CFU/mL的菌悬液，然后取0.3mL菌悬液在PDA固体培养基表面划线，28℃条件下培养24h，挑取分散较好的单菌落接种至含有液体培养基成分的发酵摇瓶中进行扩培，28℃，200r/min条件下供氧培养30h，氧浓度0.020mol/L，制得发酵种子液，其中燕麦镰刀菌浓度为3×10⁴CFU/mL，所用液体培养基为含蔗糖18.0g/L，酵母粉5.0g/L的MS液体培养基；

B、铁皮石斛破壁处理：50℃条件下，将3kg铁皮石斛粉末与60L蒸馏水预先混合后倒入不锈钢容器中，以刮边搅拌15rpm的速度，搅拌6.5h，然后利用高压微射流均质机，压力设为110MPa，温度为50℃，反复高压均质7次，获得铁皮石斛破壁匀浆；

C、 发酵培养：将步骤B中所得铁皮石斛破壁匀浆投入发酵罐中，按匀浆体积8.5 %的接种量接种入燕麦镰刀菌种子液，发酵罐中液体培养基成分同步骤A，并加入KH₂PO₄和Na₂HPO₄缓冲溶液调节料液pH=6.8，在温度28℃下供氧发酵4d，氧浓度0.030mol/L；

D、多糖纯化：发酵完成后降至室温，向发酵罐中加入发酵液质量0.6%的硅藻土助滤剂及发酵液质量6.5%脱色活性炭，静置吸附1h，再以板框压滤机过滤去渣，得滤液；然后按照滤液：Sevage试剂=4.5:1.0（体积比）混合，充分振荡30min，3000r/min离心10min，取上清液，再按照上清液：95%乙醇=1.0:2.0 (质量比) 加入乙醇，静置12h，真空抽滤机过滤得沉淀，用80%乙醇洗涤3次，60℃真空干燥24h，得小分子量铁皮石斛多糖产物988.5g。

本实施例制备的小分子量铁皮石斛多糖得率为32.95%，平均分子量300kDa，其主链由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖及D-甘露糖组成，摩尔比为3.005 : 2.645 : 1.006: 2.336 : 1.496。

实施例5：

A、菌株活化与扩培：无菌条件下，用无菌滴管吸取适量液体培养基滴入装有铁皮石斛内生真菌燕麦镰刀菌冻干粉的菌种管内配制成菌种浓度为7.8×10⁵CFU/mL的菌悬液，然后取0.25mL菌悬液在PDA固体培养基表面划线，23℃条件下培养30h，挑取分散较好的单菌落接种至含有液体培养基成分的发酵摇瓶中进行扩培，23℃，200r/min条件下供氧培养72h，氧浓度0.030mol/L，制得发酵种子液，其中燕麦镰刀菌浓度为5.3×10⁴CFU/mL，所用液体培养基为含蔗糖28.0g/L，酵母粉6.0g/L的MS液体培养基；

B、铁皮石斛破壁处理：52℃条件下，将3kg铁皮石斛粉末与60L蒸馏水预先混合后倒入不锈钢容器中，以刮边搅拌15rpm的速度，搅拌6-8h，然后利用高压微射流均质机，压力设为120MPa，温度为52℃，反复高压均质8次，获得铁皮石斛破壁匀浆；

C、 发酵培养：将步骤B中所得铁皮石斛破壁匀浆投入发酵罐中，按匀浆体积9.0%的接种量接种入燕麦镰刀菌种子液，发酵罐中液体培养基成分同步骤A，并加入KH₂PO₄和Na₂HPO₄缓冲溶液调节料液pH=6.0，在温度28℃下供氧发酵4d，氧浓度0.035mol/L；

D、多糖纯化：发酵完成后降至室温，向发酵罐中加入发酵液质量1.0%的硅藻土助滤剂及发酵液质量7.5%脱色活性炭，静置吸附1h，再以板框压滤机过滤去渣，得滤液；然后按照滤液：Sevage试剂=5.5:1.0（体积比）混合，充分振荡30min，3000r/min离心10min，取上清液，再按照上清液：95%乙醇=1.0:2.5 (质量比) 加入乙醇，静置30h，真空抽滤机过滤得沉淀，用80%乙醇洗涤3次，60℃真空干燥24h，得小分子量铁皮石斛多糖产物1026.0g。

本实施例制备的小分子量铁皮石斛多糖得率为34.20%，重均分子量98.74kDa，其主链由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖及D-甘露糖组成，摩尔比为1.894 : 2.620 : 3.128: 1.772: 2.315。