本发明属于生物化工技术领域，基于参数相关分析调控截短侧耳素发酵产生的过程，从而调高发酵效率。
背景技术：
泰妙菌素是截短侧耳素衍生的半合成抗生素，作为一种目前较新的动物专用抗生素，泰妙菌素的抗菌作用为抑制感受性细菌蛋白质的合成，即它作用于细菌体内的核糖体，干扰了peptidyl-transferaseregion，主要表现为抑菌作用，在高浓度下才有杀菌作用。泰妙菌素在pH8.5～9.0环境中杀菌作用最强。它对许多革兰氏阳性菌及支原体有特效，特别是对金黄色葡萄球菌、链球菌、多种霉形体及某些螺旋体具有较强的作用。泰妙菌素于1978年开始用于防治猪病，可有效预防和治疗猪的地方流行性肺炎(气喘病)、支原体关节炎、放线杆菌胸膜炎、猪腹泻、猪痢疾、螺旋体病、回肠炎、结肠炎、水肿病、呼吸道病等疾病。与其他药物合用，如土霉素、磺胺增效剂及其他磺胺类药物，可以明显拓宽泰妙菌素的抗菌谱，增强它的治疗效果。该产品仅作为兽用药，避免了人畜共用药的危害，有效地减少了人类交叉耐药菌株的产生。该药已在全球被广泛地使用，并被养猪专家推荐为控制猪支原体感染的首选药物。而作为泰妙菌素的前体——截短侧耳素，其发展直接影响到泰妙菌素市场竞争力，因此研究截短侧耳素的高浓度发酵有着重要的意义。
技术实现要素：
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本发明的目的是提供一种方法满足截短侧耳素发酵产生过程中高耗氧的特点。
本发明的另一个目的提供一种方法控制截短侧耳素发酵产生过程中菌丝形态变化情况。
本发明还有一个目的是提供一种碳源提高截短侧耳素发酵效率的方法。
为实现本发明的技术目的，本发明采用以下技术方案：
（1）菌种活化：从甘油冻存管中取少量菌液，在LB平板上划线后放置于37℃下培养12 h。
（2）种子液制备：从LB平板上取单菌落，接种于LB液体培养基，在28℃，200 r/min条件下摇瓶培养88 h，至菌体湿重增加40%左右。
（3）发酵过程：按 20 %接种量接入发酵罐，28 ℃发酵培养，40 h 后温度控制在 25 ℃，继续培养至 157 h 放罐。截短侧耳素菌种发酵过程是一个高耗氧过程，全程控制溶氧DO值20~100%。
截短侧耳素种子培养及发酵工艺如下:
1、菌丝悬液制备：无菌环境挖去少量菌苔，加入生理盐水，用研磨棒研磨，制备细碎均匀的菌丝悬液。
2、稀释涂布：将1制备菌丝悬液稀释后涂布平板，25℃培养。
3、单菌落转斜面：将2培养好的单菌落在无菌环境挑取并研磨成菌丝悬液后涂布至空白斜面，25℃培养。
4、斜面收取：表面全部长满，均匀一致的白色致密的菌层，散布尤不规则的褶皱，背面有淡黄色色素扩散至琼脂中。
5、效价验证：无菌环境挖去4中斜面小块至种子摇瓶培养基。25℃，200rpm培养约6天。无菌环境吸取5ml至发酵培养基，25℃，200rpm培养192、216、240hr分别送测效价。
6、将5高效价种子作为起始菌株，用于发酵上罐。
本发明的有益效果在于：
本发明的技术方案，使得截短侧耳素的发酵酶活效率提高到12000u/ml以上。
具体实施方案
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但不对本发明作任何的限制。
实施例1
泰妙菌素发酵过程中高耗氧过程所引起的各种参数变化
菌种培养方法：由试管斜面采用挖块法接入种子培养基, 置回转式摇床(偏心距10 cm)200 r/min ，28 ℃培养 88 h ，按 20 %接种量接入发酵罐，28 ℃发酵培养，40 h 后温度控制在 25 ℃，继续培养至 157 h 放罐。
实验发现发酵初期（0-10 h），随着菌体生理代谢强度的增加，OUR逐渐增加，DO逐渐下降；随后通过增加通气量（qv）、调控搅拌转速（n），使DO维持在30%-40%，直到52h，OUR达到40.2 mol/(L h)，达到第一个较高耗氧阶段；而在72-85 h由于次级代谢启动引起菌体形态发生变化，KLa增大，在其他条件恒定的情况下DO从45%上升至76%，而OUR有所下降，可能是由菌体本身生理变化引起。随着菌体代谢活力恢复以及截短侧耳素合成的启动，菌体转成豆油作为主要碳源，对氧需求增加，92h开始OUR直线上升，110 h左右达到最大值57.1 mol(L h)。这一阶段截短侧耳素生物合成量成近似直线增加，其与截短侧耳素合成途径关键酶活性高相一致。截短侧耳素发酵的高耗氧特性在这一时期表现最为明显，这是由于截短侧耳素生物合成过程中多步反应需要分子氧的参与。供养不足会导致发酵副产物的大量增加，不仅影响产物的产量，又对截短侧耳素的分离提纯造成了很大的干扰，所以发酵过程中氧的充分供应是确保发酵正常进行的关键。
实施例2
截短侧耳素发酵过程菌丝形态变化一般规律
菌形采集与处理:菌形的采集由 OLYM PUS-CX31 显像系统配合软件 Intervideo-windvr3 共同完成;菌形参数通过软件 Image Pro Plus 5.1 (Media Cybernetics，Silver Spring，MD，USA)手工或自动获得。
为了对菌丝形态变化与细胞代谢特性之间有一个定量的分析，对截短侧耳素的菌丝从菌丝直径和长度两个方面进行了定量分析，以研究截短侧耳素菌种在截短侧耳素高低产批次中的差异。菌丝直径为主干菌丝宽度，长度则为主干菌丝两端沿菌丝方向的中轴距离。接种后高低产批次均以细长光滑型菌丝为主，菌丝平均直径稍有差别，15 h后高产批次就超过地产批次，而低产批次50 h内几乎无变化，维持在2.0 um左右，高产批次则增加到3.2 um；整个过程两次批次菌丝平均直径都在增加，而70 h后高产批次菌丝平均直径增加速度快于地产批次。
在菌丝平均长度方面，高产批次在31 h前较低产批次长，前期两者平均长度均减小，主要与搅拌剪切等环境条件有关。31-70 h两批次的平均长度均减少而高产批次的减少速度明显快于地产批次，在这个阶段的后期，高低产批次的菌丝平均直径分别达到了3.8 um、3.3 um，菌丝均高度膨胀，高产批次更为明显。结合菌丝平均直径变化分析认为在31-70 h内两次批次菌丝平均长度的变化快慢与两者菌丝的膨胀程度相关，膨胀程度越高越有利于其断裂。70 h后两批次平均菌丝长度都没有太大变化，均在其70 h水平附近波动。在截短侧耳素的产量方面，两批次在菌丝形态转化为高度膨胀之前没有差别，而70 h后产素速率不同，高产批次明显高于低产批次。
截短侧耳素生产能力的差异一方面与截短侧耳素菌种的形态分化相关，另一方面与截短侧耳素发酵的耗氧特性更加密切相关，截短侧耳素菌种形态变化是其生理状态改变的结果，由于菌丝形态变化引起发酵流变特性的变化，给截短侧耳素生产中的溶氧水平控制带来了极大的影响。使相关参数变化，如：发酵初期菌丝不断生长并开始膨胀、同时也有菌丝伸长，发酵液的黏度增大，使KLa在其他条件稳定的情况下不断降低，发酵初期升高至最高随后不断下降，造成DO下降。随后通过调节搅拌转速和空气流量使DO得以维持，52 h左右已经出现部分高度膨胀菌丝，76-92 h大量膨胀菌丝断裂为节孢子、发酵液流变特性在表观上表现为KLa迅速增加与表观菌量的增加，使得DO上升；可以看出发酵过程中，前期发酵液中溶氧水平的降低是菌体生长好氧以及菌体形态变化的综合结果，而发酵后期如何能够使菌体较早膨胀断裂形成节孢子又是发酵过程中确保溶氧和细胞生理代谢的重要保证。
实施例3
发酵过程中不同碳源对细胞代谢特性的影响
在发酵 80 h开始补加豆油，发酵 95 h RQ下降至0.64，进入豆油利用阶段，RQ波动较平稳。发酵95 h后豆油才被充分利用，与菌体脂肪酶活性的形成过程以及葡萄糖对脂肪酶的阻遏相关，因而在基质转换初期（70 h左右），脂肪酶活力不足致使豆油利用速率不能满足菌体需要，造成代谢参数OUR，CER下降，随着脂肪酶活力的提高，豆油充分利用，OUR，CER在90 h再次上升，110 h达到最高值，而后维持在此范围内，截短侧耳素的生物合成大大改善。
发酵中期豆油的补加参数变化对截短侧耳素生产的影响，该时间段内补加豆油的速率为1 mL/(L h)，此时间段内菌体代谢旺盛，每经过一小段时间间隔后OUR，CER都有明显的下降，表现为一个个向下的峰谷，并伴随着DO的迅速上升，RQ值的上升，表明此时有碳源基质限制情况。加豆油后短时间内菌体不受碳源限制，OUR，CER回升到原有水平左右。补加豆油后DO明显下降，一方面是由于菌体耗氧增强；另一方面，此过程伴随着KLa值下降，说明消泡剂引起a值（气液接触比表面积）下降。所以发酵中后期豆油既为菌体提供碳源又有消泡剂功能。
发酵后期豆油的作用与参数变化相关，进入后期菌体的代谢强度下降，补加豆油的速率前阶段降低至0.5 mL/(L h)，发酵液由于菌丝活力下降引起自溶，导致产生大量气泡，可观察到添加豆油后OUR，CER及RQ基本无变化，而造成DO，KLa大幅度下降，说明添加豆油仅起消泡作用，而不被菌体利用，原因是随着发酵过程的不断进行菌体代谢活力逐渐下降，产生脂肪酶的能力减弱。与中期相比，后期菌体自溶，发酵液变稀，DO与KLa在补豆油前后波动幅度很大。