一株高产γ‑氨基丁酸的米根霉菌株及其应用的制作方法

本发明涉生物技术领域，具体涉及一株高产γ-氨基丁酸米根霉菌株的筛选方法。

背景技术：

γ-氨基丁酸的别名为氨酪酸或哌啶酸，化学名为4-氨基丁酸，其分子式为nh2ch2ch2ch2cooh，分子量为103.1。γ-氨基丁酸是中枢神经系统中很重要的抑制性神经递质，能促进脑的活化性，健脑益智，抗癫痫，促进睡眠，美容润肤，延缓脑衰老机能，能补充人体抑制性神经递质，具有良好的降血压功效。促进肾机能改善和保护作用。抑制脂肪肝及肥胖症，活化肝功能。每日补充微量的伽玛氨基丁酸有利于心脑血压的缓解，又能促进人体内氨基酸代谢的平衡，调节免疫功能。因此，γ-氨基丁酸成为重要的医药与保健原料。γ-氨基丁酸结构式为：

目前，γ-氨基丁酸的制备方法主要有化学合成法、微生物发酵法、植物富集法等。其中，化学合成方法成本高产率低，且在生产过程中涉及到有毒溶剂，存在化学试剂残留，因此安全方面存在隐患；植物富集法依赖于种植业，收到气候、地域等影响较大，产量不稳定，难以满足日益增长的需要。微生物合成法主要是利用微生物发酵，通过筛选优良、高产且稳定的微生物菌株，发酵生产γ-氨基丁酸，主要包括乳酸菌、酵母菌、曲霉菌、谷氨酸棒状杆菌等。然而，目前通过微生物发酵生产γ-氨基丁酸的产量还较低，主要有以下几个原因：(1)微生物培养成本过高，培养基比较昂贵，发酵设备投资较大；(2)由于γ-氨基丁酸是水溶性，因而从发酵产物中提取γ-氨基丁酸的工艺比较复杂。因此需要筛选新的能够生产γ-氨基丁酸的菌株。

米根霉是一种常见的霉菌，在自然界中分布十分广泛。米根霉在酿造中扮演着十分重要的角色，由于其能产生活性很强的淀粉酶，在酿酒工业上常用作淀粉质原料的糖化菌，我国最早利用根霉糖化淀粉(阿明诺法)生产酒精。米根霉在生长过程中能够产生苹果酸、γ-氨基丁酸、乳酸、柠檬酸、富马酸等多种有机酸，广泛应用于食品、医药、饲料以及环境等领域。因此可以采用根霉来生产γ-氨基丁酸，用于食品与医药行业。

本发明筛选到一株高产γ-氨基丁酸米根霉株，对该菌进行了鉴定，对生产γ-氨基丁酸的培养条件进行了初步研究，为微生物合成γ-氨基丁酸工业化提供了基础。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株高产γ-氨基丁酸的米根霉，并对其进行了分类学鉴定，该菌命名为rhizopusoryzaeq1。对发酵产物γ-氨基丁酸进行了鉴定，为微生物合成γ-氨基丁酸的工业化提供了有益的指导。

为实现上述目的，发明人首次分离纯化到一株能够产生γ-氨基丁酸的新菌株。经过18srdna和生理生化鉴定，该菌株为米根霉(rhizopusoryzae)，命名为米根霉q1(rhizopusoryzaeq1)。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年10月17日，保藏号为cctccm2016565。

菌株的筛选：将采集的酒曲样品稀释至不同的浓度，分别吸取0.1ml不同浓度的菌悬液涂布于筛选培养基上，挑取生长的米根霉单菌落，转接与斜面培养基保藏；

γ-氨基丁酸的鉴定方法：将γ-氨基丁酸标样(购自sigma公司，99％以上)配置成10mg/100ml的溶液。发酵物在50℃条件下烘干后，准确称量2.000g，研磨捣碎，用0.02mol/l盐酸定容到100ml并过滤除去固体物质，取10ml溶液在日立l-8800全自动氨基酸分析仪上进行分析，60℃分析。

菌株的鉴定：提取米根霉q1的基因组dna，然后以该dna样品作为扩增末班，使用真菌18srdna的通用引物进行序列扩增，pcr方法：pcr扩增条件为94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环30次。pcr体系组成：dna模板0.2μl，正向引物1μl，反向引物1μl，dntps溶液5μl，dna聚合酶0.2μl，10×pcr缓冲液2.5μl，去离子水19.1μl。取pcr产物1μl，加5μlloadingbuffer，在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳，dnagreen染色后，在紫外灯下观察电泳条带。用凝胶回收试剂盒纯化pcr扩增产物，送到上海生工生物科技有限公司进行18srdna的测序，将测序结果与ncbi数据库中的已知序列进行比对分析。

米根霉q1为出发菌株，接种到产孢子培养基中，30℃培养2-3天，至孢子成熟；采用无菌水洗下孢子，将孢子数稀释到10⁷个/ml；以1-5％的体积比将孢子悬浮液转接至发酵培养基，在30℃条件下培养5天。

产孢子培养基成分为：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l，自然ph。发酵培养基成分为：糯米30g，谷氨酸0-0.6g，水5-30g，自然ph，121℃下灭菌20分钟。

本发明方法的优点：

(1)米根霉生长周期较短，仅需要3-5天即可产生高浓度的γ-氨基丁酸，比目前已知的微生物菌种产量都高，这一过程决定了生产工艺将较短，并且不容易被其他微生物污染。

(2)本发明中采用的米根霉，所需的发酵培养基组成比较简单，仅需要大米即可，不需要额外添加特殊的物质，因此在工业上应用比较便利。

(3)米根霉生长能力较强，仅需要2天即可将菌丝体长满培养基，然后分泌出淀粉酶等分解培养基中的营养物质，能够快速并充分地利用培养基中的营养物质，只需要一般的发酵车间即可生产，易于推广。生物材料样品的保藏信息：

保藏的生物材料样品：米根霉q1(rhizopusoryzaeq1)；

保藏单位：中国典型培养物保藏中心(简称：cctcc)；

保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心(邮编：430072)；

保藏日期：2016年10月17日；

保藏登记号：cctccm2016565。

附图说明

图1是米根霉q1孢子囊和假根的显微形态图。

图2是γ-氨基丁酸与其他20种氨基酸标准物的氨基酸图谱，图中共有21个峰信号，由左向右依次为：牛磺酸(tau)，天冬氨酸(asp)，苏氨酸(thr)，丝氨酸(ser)，谷氨酸(glu)，甘氨酸(gly)，丙氨酸(ala)，半胱氨酸(cys)，缬氨酸(val)，甲硫氨酸(met)，异亮氨酸(ile)，亮氨酸(leu)，酪氨酸(tyr)，苯丙氨酸(phe)，γ-氨基丁酸(gaba)，鸟氨酸(orn)，赖氨酸(lys)，氨(nh3)，组氨酸(his)，色氨酸(trp)，精氨酸(arg)；21个信号峰的出峰时间依次为2.19分钟，4.95分钟，5.64分钟，6.21分钟，7.09分钟，10.17分钟，11.29分钟，12.60分钟，13.19分钟，14.45分钟，16.79分钟，17.99分钟，19.37分钟，20.57分钟，21.56分钟，22.39分钟，23.00分钟，23.85分钟，25.08分钟，28.17分钟，29.27分钟。

图3是米根霉q1发酵产物中γ-氨基丁酸的氨基酸图谱，图中出峰时间为21.56分钟的信号峰代表γ-氨基丁酸。

具体实施方式

实施例1：高产γ-氨基丁酸菌种的筛选

本实施例在湖北地区的酒厂等处采集酒曲，进行米根霉q1(rhizopusoryzaeq1)的筛选。方法如下：

米根霉的筛选：将采集的酒曲样品用无菌水稀释至不同的浓度，分别吸取0.1ml不同浓度的菌悬液涂布于筛选培养基上，在30℃条件下培养2-3天后，根据菌落形态挑取生长出来的米根霉单菌落。在筛选培养基上反复多次划线培养，获得纯菌株(图1)。筛选培养基成分为(g/l)：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l，自然ph。121℃灭菌20min。

高产γ-氨基丁酸的米根霉筛选：将所有米根霉株以5％的接种量接种于装有30g发酵培养基的250ml三角瓶中，在30℃条件下培养5天。然后发酵物在50℃条件下烘干后，准确称量2.000g，研磨捣碎，用0.02mol/l盐酸定容到100ml并过滤除去固体物质，取10ml溶液在日立l-8800全自动氨基酸分析仪上进行分析。将γ-氨基丁酸产量最高的米根霉命名为q1。

实施例2：γ-氨基丁酸的检测

将实施例1中米根霉q1菌株的发酵物，在50℃条件下烘干后，用研磨器将固体物研磨成粉状，然后用分析天平称量2.000g，用盐酸溶液(0.02mol/l)溶解并定容到100ml。用滤纸过滤除去不溶物后，用移液管吸取10ml溶液在全自动氨基酸分析仪上进行分析。根据γ-氨基丁酸标准物的出峰时间一致性，来确定样品中的γ-氨基丁酸。通过γ-氨基丁酸的标准曲线来计算γ-氨基丁酸的浓度。

实施例3：米根霉q1所产γ-氨基丁酸的检测

将实施例1中筛选得到的米根霉q1菌株，在产孢子培养基培养2-3天，用无菌水将孢子洗下来，并稀释到10⁷个/ml。以5％的接种量将孢子液接种到发酵培养基中，在30℃条件下静置培养5天。将发酵物在50℃条件下烘干后，准确称量2.000g并研磨成粉，用0.02mol/l盐酸定容到100ml，取10ml过滤除去固体后的溶液，进行γ-氨基丁酸含量分析。根据出峰的保留时间与峰面积计算，米根霉q1的发酵产物中γ-氨基丁酸含量为0.31mg/g(图3)。所用产孢子培养基成分为：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l，自然ph。所用发酵培养基成分为：浸泡过夜滤干的糯米30g，ph自然，于121℃下灭菌20min。

实施例4：不同谷氨酸添加量条件下米根霉q1产γ-氨基丁酸的研究

将实施例1中筛选所得的米根霉q1接种到产孢子培养基(马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l，自然ph)上，在30℃条件下培养2-3天后，用无菌水冲洗菌落表面获得孢子悬液，然后将孢子浓度稀释到10⁷个/ml。以5％的体积比将孢子悬浮液分别接种到不含谷氨酸的发酵培养基与含有0.5％谷氨酸含量的发酵培养基中，在30℃条件下静置培养5天。通过日立l-8800全自动氨基酸分析仪分析γ-氨基丁酸的含量。米根霉q1在无谷氨酸的发酵培养基中培养5天后，γ-氨基丁酸的含量为0.31mg/g；在含有0.5％谷氨酸的发酵培养基中培养5天后，γ-氨基丁酸的含量为1.08mg/g。