本发明属于生物制品制备技术领域，具体涉及一种半乳甘露低聚糖的制备方法。
背景技术：
瓜尔豆(Cyamops tetragonooba(L.)Taub.)为印度、巴基斯坦等地广泛种植的热带豆科草本植物。瓜尔豆胶(Guar gum)，由瓜尔豆的种子去皮去胚芽后的胚乳部分，干燥粉碎后加水，进行加压水解后用20％的乙醇沉淀，离心分离后干燥粉碎而得，其黏度为天然胶体中黏度最高者，是目前国际上最廉价且应用广泛的亲水胶体之一。其主要化学成分是半乳糖甘露聚糖，主链为(1→4)-β-D-甘露糖单位，侧链是单个的α-D-半乳糖以(1→6)键与主链相联，半乳糖与甘露糖之比为1：1.8，约为1：2。瓜尔胶具有很好的水溶性和增稠性，但原粉往往具有下述的缺点：溶解速度慢，不能快速溶胀和水合；粘度不易控；热稳定性差等。这些缺点使瓜尔胶在食品及医药领域应用受到很大限制，较高的黏性使其不易进入肠道，难以发挥膳食纤维的作用，因此需要改变其理化特性，使其被更加广泛应用。
功能性低聚糖是由单糖通过糖苷键聚合而成的化合物，其制备方法多种多样，并含有多种生理功能。近年来，国内外对瓜尔豆胶制备半乳甘露低聚糖(GMOS)的关注度日益提高，在活体小鼠试验中GMOS的生理功能未发生大的改变，且未发现安全性问题。GMOS黏性更低，更容易在肠道中发挥作用，代谢产物甘露糖和半乳糖能够被微生物摄取，促进有益菌发酵，进而降解肠道内的废物并促进排出体外。除以上功能特点外，GMOS还具有防治高血脂、抗氧化、增强免疫功能等作用。近年来，随着人们对健康及肠道功能的关注度不断提高，GMOS作为一种较优秀的新型低聚糖，也将越来越受到人们关注。
目前降解瓜尔豆胶的方法主要分为化学降解法及酶降解法。氧化降解法是化学降解法中常用的一种降低胶体黏度的方法，但是化学试剂很容易造成残留，同时反应较为剧烈不容易控制。酶法反应条件温和，但是底物浓度过高造成反应体系黏度过高、反应时间缓慢、酶解不彻底，而较低的底物浓度在工业化生产中会造成时间及资源的浪费。
技术实现要素：
本发明的内容是提供一种过氧化氢与β-甘露聚糖酶复合降解瓜尔豆胶，并制备具有润肠通便功能的半乳甘露低聚糖的方法。该方法的优点是将氧化降解与酶解技术整合在一起，反应时间短，条件温和可控制，产物得率高，直接得到特定分子量的功能性半乳甘露低聚糖，工艺适合规模化生产。
本发明涉及一种过氧化氢与β-甘露聚糖酶复合降解瓜尔豆胶制备半乳甘露低聚糖的方法，其生产过程如下：
1)过氧化氢降解：将抗坏血酸和食品级过氧化氢溶解于水中，再加入瓜尔豆胶进行降解；待降解的黏度为80-200mPas时，加入过氧化氢酶除去残留过氧化氢，
所述的抗坏血酸在水溶液中的终浓度为0.5-4mmol/L、食品级过氧化氢的终浓度为10-40mmol/L；
所述的除去残留的过氧化氢，酶添加量3000-8000U/L降解体系，pH6.0-8.0，温度40-60℃，时间10-25min；
2)酶解：使用酸性β-甘露聚糖酶进行酶解，酶活力40000-50000U/g，酶添加量为100-200U/g瓜尔豆胶底物，酶解温度40-60℃，盐酸调节pH 2.0-4.0，作用时间1-2h；
3)离心絮凝：将步骤2)制备的酶解液离心，除去酶解残渣；上清液浓缩后按照3-5倍体积倍数添加乙醇，沉降除去大分子糖类物质；
4)喷雾干燥：醇沉上清液悬蒸浓缩至固形物含量≧20％后，按照固形物含量15-25％添加麦芽糊精进行喷雾干燥，完成制备。
其中喷雾干燥进口温度150-190℃，出口温度80-120℃，流速9-15mL/min，得到分子量小于10000Da GMOS干粉。
本发明通过控制食品级过氧化氢添加量，在避免反应过于剧烈的情况下，能够使瓜尔豆胶底物浓度迅速降低，从而节省后续酶解时间，使酶解产物更为均匀。过氧化氢酶的使用可消除反应体系中残留过氧化氢，符合国家食品级过氧化氢作为加工助剂的使用标准。本发明采用氧化降解与酶解复配的技术，极大提高了反应底物浓度，克服了瓜尔豆胶高黏度对酶解反应的限制，用环保、经济的工艺手段生产溶解性良好的具有润肠通便功能的GMOS固体粉末。具有反应时间短、能耗低、操作方便、成本低的优点，产物均匀且得率高，适合大规模工业化生产。产品纯度较高，造粒后颗粒溶解性良好，可用作具有润肠通便功效的新型原料和助剂。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1
1、将1mmol抗坏血酸、30mmol食品级过氧化氢溶解于1L水中，溶解均匀后加入200g瓜尔豆胶，40℃下反应釜反应15min，转速40-60r/min。
2、按照3000U/L向反应液中添加过氧化氢酶，40℃反应15min。
3、反应结束后，可参照GB-T 23499-2016，用钛盐比色法测定反应体系中是否残留过氧化氢。
4、用盐酸将反应液调节pH至2.5，按照200U/g瓜尔豆胶底物的量加入酸性β-甘露聚糖酶进行酶解，50℃反应1h。
5、将酶解液煮沸灭酶，然后用离心机4800rpm离心20min，去除不溶性酶解残渣。
6、上清液悬蒸浓缩至400mL，按照上清液3倍体积加入1200mL 95％乙醇，此时出现少量白色糖沉淀，4800rpm离心20min除去大分子糖类物质。
7、醇沉上清液悬蒸浓缩至350mL后测固形物含量，按照固形物含量20％添加麦芽糊精，溶解均匀后进行喷雾干燥即得半乳甘露低聚糖，其中喷雾干燥进口温度165-170℃，出口温度80-90℃，流速9-12mL/min。产物均为分子量低于10000Da的半乳甘露低聚糖，产物的得率可达到85％左右。
8、利用湿法造粒机，95％乙醇湿法造粒，造粒后60℃烘2-3h至恒重，过40目及100目筛，即得到40-100目水溶性良好的固体低聚糖粉末颗粒。
实施实例2
1、将20mmol抗坏血酸、1.5mol食品级过氧化氢溶解于50L水中，酶解罐夹套通入蒸汽把罐内水预热至45-50℃，加入12.5kg瓜尔豆胶，发酵罐在50℃下搅拌反应25min，转速55-60r/min。
2、按照3000U/L向反应液中添加过氧化氢酶，50℃搅拌反应15min，转速55-60r/min。
3、反应结束后，参照GB-T 23499-2016，用钛盐比色法测定反应体系中是否残留过氧化氢。
4、用盐酸将反应液调节pH至2.5，按照200U/g瓜尔豆胶底物的量加入酸性β-甘露聚糖酶进行酶解，50℃继续搅拌反应1h左右。酶解结束后将温度升高至90℃，保持10min灭酶。
5、蝶式离心机6500r/min离心，去除不溶性酶解残渣。
6、上清液使用双效浓缩设备浓缩至15L，按照浓缩后体积的3倍加入45L 95％乙醇，此时出现少量白色糖沉淀，离心除去大分子糖类物质。
7、醇沉上清液悬蒸浓缩至15L后测固形物含量，按照固形物含量20％添加麦芽糊精，溶解均匀后进行喷雾干燥即得半乳甘露低聚糖，其中喷雾干燥进口温度165-170℃，出口温度80-90℃，流速12-15mL/min。产物均为分子量低于10000Da的半乳甘露低聚糖，产物的得率可达到87％左右。
8、利用湿法造粒机，95％乙醇湿法造粒，造粒后60℃烘3h至恒重，过40目及100目筛，即得到40-100目水溶性良好的固体低聚糖粉末颗粒。
实施例3
本发明技术制备低聚糖与商业低聚糖产品的润肠通便效果的比较观察：
按照实施实例1制备本发明技术半乳甘露低聚糖。
取1400g瓜尔豆胶底物溶解于7L水中，溶解均匀后添加抗坏血酸2mmol/L、过氧化氢40mmol/L进行降解，40℃震荡反应0.5h。按照10000U/L向反应液中添加过氧化氢酶，40℃震荡反应20min。用盐酸将反应液调节pH至2.5，按照200U/g瓜尔豆胶底物的量加入酸性β-甘露聚糖酶进行酶解，50-55℃反应釜搅拌4-5h。反应釜升温至90℃保持10min灭酶，4800rpm离心20min去除不溶性酶解残渣，上清液悬蒸浓缩至2L，按照上清液3倍体积加入6L 95％乙醇，4800rpm离心20min除去大分子糖类物质。醇沉上清液悬蒸浓缩至2L后按照固形物含量添加20％麦芽糊精进行喷雾干燥即得半乳甘露低聚糖，其中喷雾干燥进口温度160-170℃，出口温度80-90℃，流速9-12mL/min。产物均为分子量低于10000Da的半乳甘露低聚糖，产物的得率87％。利用95％乙醇进行湿法造粒，60℃烘干1-2h，过40目及100目筛，得到40-100目溶解性良好低聚糖固体颗粒。
1、小鼠排便实验
参照保健食品检验与评价技术规范(2003版)中关于通便功能检验的方法安排实验。将60只雄性昆明小鼠适应性喂养后，按照平均体重随机分为本发明技术GMOS低、高剂量组，商业低聚木糖、低聚半乳糖产品作为两个阳性对照组，以及阴性对照组、便秘模型组，每组10只。本发明技术低、高剂量组分别灌胃本发明制作的的GMOS 0.25g/kg bw、1g/kg bw；商业低聚木糖与低聚半乳糖产品作为阳性对照组，分别灌胃1g/kg bw；阴性对照组和便秘模型组灌胃给予蒸馏水。灌胃量为10mL/kg bw，每日定时灌胃，每日一次，期间自由饮食，连续给药20d后，小鼠禁食不禁水20h，除阴性对照组灌胃蒸馏水外，其他各组灌胃10mg/kg bw洛哌丁胺造便秘模型。0.5h后，阴性对照组和便秘模型组小鼠用墨汁灌胃，本发明实验组与阳性对照组小鼠灌胃含对应受试样的墨汁，动物均单笼饲养，正常饮水进食。从灌墨汁开始，记录每只动物首粒排黑便所需时间、5h内排便粒数及重量，观察结束后粪便烘干至恒重计算含水量。
实验结果如表1，结果显示与正常阴性对照组小鼠相比，便秘模型组小鼠首次黑便时间增长，5h内排便粒数减少，粪便含水量显著降低，差异均有极显著性(P<0.01)，说明造模成功。本发明GMOS高低剂量组与便秘模型组相比，首次黑便时间缩短、5h内排便粒数增加、粪便含水量提高，且差异均有极显著性(P<0.01)，说明本发明GMOS能够改善小鼠便秘情况。
表1：本发明技术制作的GMOS与其他低聚糖产品对小鼠排便的影响
注：与便秘模型组相比，*p<0.05，**p<0.01
2、小鼠肠道推进实验
参照保健食品检验与评价技术规范(2003版)中关于通便功能检验的方法安排实验。将60只雄性昆明小鼠适应性喂养后，按照平均体重随机分为本发明技术GMOS低、高剂量组，商业低聚木糖、低聚半乳糖产品作为两个阳性对照组，以及阴性对照组、便秘模型组，每组10只。本发明技术低、高剂量组分别灌胃本发明制作的的GMOS 0.25g/kg bw、1g/kg bw；商业低聚木糖与低聚半乳糖产品作为阳性对照组，分别灌胃1g/kg bw；阴性对照组和便秘模型组灌胃给予蒸馏水。灌胃量为10mL/kg bw，每日定时灌胃，每日一次，期间自由饮食，连续给药20d后，小鼠禁食不禁水20h，除阴性对照组灌胃蒸馏水外，其他各组灌胃10mg/kg bw洛哌丁胺造便秘模型。25min后，脱颈椎处死动物，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端自幽门、下端至回盲部的肠管，轻轻将小肠拉成直线，测量肠管长度为“小肠总长度”，从幽门至墨汁前沿为“墨汁推进长度”，计算墨汁推进率如下：推进率(％)＝墨水移动距离(cm)/小肠全长(cm)×100。实验结果见表2，结果显示与便秘模型组小鼠相比，正常阴性对照组小鼠肠道推进率高129.62％，存在极显著差异(P<0.01)，说明造模成功。本发明GMOS高、低剂量组与便秘模型组相比，肠道推进率分别提高了87.88％、37.87％，且差异均有极显著性(P<0.01)。说明本发明GMOS能够改善小鼠便秘情况。
表2：本发明技术制作的GMOS与其他低聚糖产品对小鼠小肠运动的影响
注：与便秘模型组相比，*p<0.05，**p<0.01
上述内容是结合具体实施方式对本发明所做的进一步说明，不能认定本发明的具体实施方式只局限于这些说明。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，在未背离本发明的原理实质下所做的改进、修饰、替代、简化，均应为等效的处理方式，而所有这些变换都应该属于本发明所附权利要求的保护范围。