一种抗衰老乳液的制备方法与流程

本发明属于生物医药技术领域。

背景技术：

衰老是一种自然规律，皮肤作为生物衰老过程中变化最为显著的器官之一，主要表现有皮肤松弛、褶皱、色斑出现等。关于衰老解释有不同的学说，其中最具有影响力的是自由基学说，它认为衰老的诱因是衰老相关的环境、疾病和自身因素所产生的自由基。环境污染、长时间紫外线照射和吸烟会加速皮肤的衰老进程，导致皮肤组织缺水、角质层变硬、表皮和真皮层变薄、皮肤胶原纤维减少、黑色素沉积，从而产生皱纹、皮肤变得松弛、无光泽、色斑等问题。

D-半乳糖皮下注射可降低抗自由基的相关酶活性，加快皮肤衰老，属于衰老造模的内源性因素；紫外线的照射可影响真皮层成纤维细胞的生长、代谢等功能，属于衰老造模的外源性因素。

我国现有茶园约150万公顷，除嫩叶做茶外，修剪的过百万吨枝叶、花、籽都作为废弃物扔掉。茶树叶富含茶多酚，茶多酚的抗氧化性可调节人体自由基代谢平衡，延缓衰老，预防和治疗心血管疾病、肿瘤等。茶树花香气清甜，含丰富的蛋白质、多糖、茶多酚、氨基酸、维生素、微量元素、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶、黄酮等，对人体具有解毒、降脂、降糖、抗癌、滋补、养颜等功效。茶种仁油理化特性与橄榄油相似，所含角鲨烯是血液输氧剂和生物抗氧化剂，提高免疫力，延缓衰老，消炎杀菌；以上各成分综合作用，有润泽皮肤和修复皮肤创伤的作用，可抵抗紫外线伤害，修复细胞，加快伤口愈合或防治皮肤皲裂，治疗皮肤病等。如能综合利用茶树修剪下的废弃的叶、花、籽研发功能食品、保健药品和日化产品，可充分利用茶树资源，带动茶树品种更新改良，增加茶园产值和茶农收入，促进宜林荒山绿化。

国内外报道对茶叶的研究较多，但多用于内服给药和日常饮用；对茶树种仁的研究仅局限于其含有的茶皂素、茶籽多糖、油脂和糠醛等的提取，未充分利用抗氧化功效的角鲨烯、茶多酚等，更未见以茶树树叶、茶树花、种仁油为原料制备乳液并进行相关抗衰老实验的报道。

技术实现要素：

本发明目的在于提出利用废弃的茶树叶、茶树花及茶树种仁为原料制备抗衰老乳液的方法。

本发明抗衰老乳液的制备方法包括以下步骤：

1）将茶树叶清洗后粉碎，然后用80℃水浸提1h，离心收集上清液，将茶树叶渣用80℃水再浸提1h，离心收集上清液；合并两次上清液过滤，滤液为茶树叶提取液；将茶树种仁粉碎后与60℃水混合后经1h研磨，再经离心取得上层油脂，即茶树种仁油；将茶树花经气流粉碎机超微粉碎，得茶树花超微粉；

2）在均质条件下，先将茶树种仁油滴入茶树叶提取液中，再加入茶树花超微粉，继续均质，得抗衰老乳液。

本发明产品经试验证实具有抗皮肤衰老作用，因而可用于祛斑、去皱和美白润肤。

茶树叶中含有茶皂素，具有乳化、发泡等表面活性，实验确定提取适宜温度为80℃，温度过高时乳化发泡严重，不利于提取，也不利于茶多酚类成分的稳定。

茶种仁因淀粉含量较高，用机械压榨法榨油时淀粉受热膨胀，阻塞油路，使出油率降低；用有机溶剂浸提茶种油，提取率虽很高，但存在后续的减压蒸馏回收溶剂和脱臭等精制工序以及产品中溶剂残留等安全和环保问题等；超临界CO₂萃取具有萃取温度低、省时、无毒无害，可避免产物氧化、无化学试剂残留和污染、不需要精炼等优点，但经济成本高未工业化普及。本发明将茶种仁粉碎，加60℃水使细胞吸水热涨，再经胶体磨进一步破坏细胞壁，再离心分离上层油脂和下层淀粉。实验确定提油适宜温度为60℃，因茶种仁中皂素含量也较高，温度过高时乳化发泡严重，对油层分离不利，温度过高淀粉糊化粘度增加也影响油份析出。

茶树花因皂素含量很高不适宜用水性溶剂提取，也没必要用高成本的有机溶剂提取或超临界CO₂萃取。本发明将茶树花超微粉碎后，细胞破壁，所含茶皂素遇水即溶，起乳化剂作用使茶树种仁油稳定的分散在茶树叶提取液中；同时茶花超微粉使乳液有一定的粘稠性，有利于乳液的稳定；乳液散发着茶花的自然怡人的清香。

进一步地，本发明每次浸提茶树叶的水与茶树叶的混合质量比为5∶1。水是提取茶树叶中茶多酚等功效成分的溶剂，采用该比例进行两次提取符合功效成分提取率要求，也符合作为分散茶树种仁油所需水相（茶树叶提取液）量要求，经济、合理。

所述茶树种仁和水的混合质量比为1∶10，这样的比例使研磨后的混合液稠度适当，利于离心分出油层。

所述步骤2）中均质时均质机转子转速＞3000 r/min，加入茶树花超微粉后继续均质的时间为5～10min。因本发明未添加任何表面活性剂做乳化剂，经实验表明：制备本发明抗衰老乳液需要在＞3000r/min均质条件下才能产生较大的剪切力，使油水两相能均匀乳化，均质时间5～10min可以形成稳定乳液。

另外，本发明所述茶树叶、茶树种仁与茶树花的用料质量比为10∶10∶1。茶树叶是提取茶多酚等功效成分的原料，前期实验测定了茶树叶中抗衰老功效成分表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和表儿茶素（EC）的含量，以此为依据确定茶树叶用量；前期实验也测定了加水研磨法提取茶树种仁油的提取率以及油中角鲨烯的含量，以此为依据确定茶树种仁用量；实验中发现茶树花含有大量皂素，用作乳化剂兼有增稠作用而确定其用量。

附图说明

图1为EGCG标准对照品高效液相色谱图。

图2为EC标准对照品高效液相色谱图。

图3为角鲨烯标准对照品高效液相色谱图。

图4为检测波长为278nm的抗衰老乳液高效液相色谱图。

图5为检测波长为210nm的抗衰老乳液高效液相色谱图。

图6为显微镜下观察正常组小鼠皮肤表皮层形态照片。

图7为显微镜下观察模型组小鼠皮肤表皮层病理变化照片。

图8为显微镜下观察阳性对照组小鼠皮肤表皮层病理变化照片。

图9为显微镜下观察抗衰老乳液低剂量组小鼠皮肤表皮层病理变化照片。

图10为显微镜下观察抗衰老乳液高剂量组小鼠皮肤表皮层病理变化照片。

图11为显微镜下观察正常组小鼠皮肤中胶原纤维的照片。

图12为显微镜下观察模型组小鼠皮肤中胶原纤维的照片。

图13为显微镜下观察阳性对照组小鼠皮肤中胶原纤维的照片。

图14为显微镜下观察抗衰老乳液低剂量组小鼠皮肤中胶原纤维的照片。

图15为显微镜下观察抗衰老乳液高剂量组小鼠皮肤中胶原纤维的照片。

具体实施方式

一、抗衰老乳液的制备工艺：

1、取10kg茶树叶，清洗后搅碎，加入50kg温度为80℃的水中1h不时搅拌，然后离心收集上清液。再将离心后的茶树叶渣用80℃水50 kg再浸提1h，再次离心收集上清液。合并两次上清液，经过滤，得茶树叶提取液。

2、取10kg茶树种仁，粉碎后加100kg温度为60℃的水1 h胶体磨研磨，离心分离上层油脂得茶树种仁油。

3、将1kg茶树花经气流粉碎机超微粉碎得茶树花超微粉。

4、在3200 r·min^-1均质条件下将茶树种仁油滴入茶树叶提取液中，再逐渐加入茶树花超微粉，继续均质5～10min得抗衰老乳液。

二、高效液相色谱法对抗衰老乳液中功效成分的含量测定：

准确称取抗衰老乳液20mg，分别用甲醇定容至10ml，超声30min后，以0.45μm微孔滤膜过滤，滤液作为用于检测EGCG和EC的供试液1。

另外准确称取抗衰老乳液500mg，加正己烷超声溶解，过滤，挥干正己烷，用甲醇定容于10mL容量瓶，超声30min后，以0.45μm微孔滤膜过滤，滤液作为用于检测角鲨烯的供试液2。

色谱柱为C₁₈（4.6×250mm，5μm），流速为1.0ml/min，柱温25℃，检测EGCG和EC是以水∶甲醇∶冰醋酸=84∶15∶1的体积比混合液作为流动相，检测波长为278nm；检测角鲨烯是以甲醇∶乙腈=6∶4的体积比混合液作为流动相，检测波长为210nm。

精密吸取各供试液20μL，按上述色谱条件进样测定3次，并按标准对照法计算样品中各功效成分的含量。

EGCG的线性回归方程为：Y=529808X-320.31，R²=0.9996，在0.05mg～0.4mg内具有良好的线性关系；EC的线性回归方程为：Y=2220370X+3.7073，R²=0.9999，在0.025mg～0.2mg内具有良好的线性关系；角鲨烯的线性回归方程为：Y=143760X+907.4，R²=0.9992，在0.1mg～0.6mg内具有良好的线性关系。结果见表1和附图1～5（各图中纵坐标表示信号强度，AU为电压放大倍数）。

表1 HPLC测定抗衰老乳液中各功效成分含量结果

即测定抗衰老乳液中表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素及角鲨烯含量分别为18.26%、1.53%及1.02%。

由图1可见保留时间24.848分钟处表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的色谱峰。

由图2可见保留时间32.724分钟处表儿茶素（EC）的色谱峰。

由图3可见保留时间31.594分钟处角鲨烯的色谱峰。

由图4可见保留时间24.942分钟处色谱峰，归属于抗衰老乳液中表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的分离峰；保留时间32.742分钟处色谱峰归属于抗衰老乳液中表儿茶素（EC）的分离峰。

由图5可见保留时间32分钟处色谱峰，归属于抗衰老乳液中角鲨烯的分离峰。

三、抗衰老乳液的功效实验：

（一）在体动物实验方法：

1、动物分组与处理：

分组：取30只小鼠，雌雄各半，随机分为5组，分别为：正常组、模型组、维生素E阳性对照组（200 mg/kg·d）、抗衰老乳液低剂量组（200 mg/kg·d）、抗衰老乳液高剂量组（400 mg/kg·d）。

造模：小鼠背部脱毛约5cm×5 cm，模型组、阳性对照组、抗衰老乳液低剂量组和抗衰老乳液高剂量组小鼠每日颈背部皮下注射1 %D-半乳糖1 ml/100 g，并进行30瓦紫外灯照射，照射时间为30 min/d，持续40 d；正常组小鼠每日注射等体积的生理盐水，正常光照，持续时间同造模组。

给药：从造模第11天开始，阳性对照组、抗衰老乳液低剂量组和抗衰老乳液高剂量组小鼠每天按照设定剂量背部涂抹维生素E和抗衰老乳液，正常组和模型组小鼠每天背部涂抹生理盐水，连续涂抹30天后考察小鼠背部皮肤变化。

2、皮肤观察：

2.1 皮肤肉眼观察：

肉眼观察小鼠背部皮肤表面，通过观察皮肤的光泽度、光滑度、有无斑点、有无弹性等初步判断小鼠皮肤的衰老情况。

2.2 皮肤组织的形态学观察：

2.2.1 皮肤切片染色：

剪取背部皮肤组织约2 cm×2 cm，脱毛处理后除去皮下的脂肪组织，在Bouin氏固定液中固定超过24 h，酒精脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后，分别HE染色和Masson三色染色，对比各组皮肤的显微结构。

2.2.2 图像采集与定量：

对每组HE染色的切片，分别在200倍镜下拍摄采集，每组挑选4个视野，观察皮肤的显微结构，测量表皮和真皮层厚度；对每组Masson三色染色的切片，在400倍镜下拍摄，同样每组挑选4个视野，观察胶原纤维的形态变化，测定胶原纤维的粗细、长度及面积比例。所采集的图像均用image-pro Plus 6.0对各指标进行测量。

3、皮肤生化指标的测定：

取小鼠皮肤组织制备成组织匀浆，按照测定试剂盒说明书，采用羟胺法测SOD值、TBA法测MDA值。取小鼠皮肤采用碱水解法测定Hyp值，根据试剂盒说明书提供的公式计算所需数据。

4、皮肤含水量的测定：

取脱毛后背部皮肤2cm×2cm，精密称取湿重，放置烘箱24 h后精密称取干重。

。

5、统计学方法：

所有测定指标均用均值±标准差()表示，应用SPSS 17.0软件对数据结果进行处理分析和比较，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05时，有显著性差异；P<0.01时，有极显著性差异，均具有统计学意义。

（二）在体动物实验结果：

1、皮肤考察：

正常组皮肤光滑，有色泽，有弹性；模型组皮肤粗糙且有褶皱，表皮变薄，缺乏弹性；对比于模型组，阳性对照组、抗衰老乳液高低剂量组表皮褶皱明显变少，皮肤光滑有光泽；同时高剂量组有较好的皮肤弹性，皮肤无明显褶皱，恢复光泽等明显优于低剂量组。

2、皮肤组织的形态学观察：

2.1 HE染色结果：

HE染色显微镜下观察结果见附图6～10（放大倍数200，标尺为100μm）。

图6可见显微镜下观察到的正常组小鼠皮肤表皮层形态：小鼠皮肤结构完整，表皮和真皮层厚度正常，毛囊和皮脂腺饱满，表皮和真皮分界较清楚，染色较均匀。

图7可见显微镜下观察到的模型组小鼠皮肤表皮层病理变化情况：表皮和真皮都变薄，汗腺和毛囊数量与图6相比显著减少。

图8可见显微镜下观察到的阳性对照组小鼠皮肤表皮层病理变化情况：小鼠表皮较规则，真皮层厚度增加，毛囊和汗腺与图7相比显著增多。

图9可见显微镜下观察到的抗衰老乳液低剂量组小鼠皮肤表皮层病理变化情况：小鼠表皮较规则，真皮层厚度增加，但毛囊和汗腺与图8、图10比较不够饱满。

图10可见显微镜下观察到的抗衰老乳液高剂量组小鼠皮肤表皮层病理变化情况：与图7相比，观察到小鼠表皮规则，真皮层厚度显著增加且分界较清晰，染色均匀，毛囊和皮脂腺明显增加。

2.2 抗衰老乳液对衰老小鼠皮肤厚度的影响：

表皮和真皮的测量结果表明，对比于正常组，模型组的表皮和真皮均明显变薄，抗衰老乳液给药后，各给药组的表皮和真皮均有显著增加（P<0.05，P<0.01），见表2。

表2 抗衰老乳液对衰老小鼠皮肤厚度的影响（, n=6）

注：^△与正常组比较，^△△P<0.01；^▲与模型组比较，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01。

2.3 Masson三色染色结果：

Masson三色染色胶原纤维染色为蓝色，见附图11～15（放大倍数400，标尺为20 μm）。

由图11可见，正常组的小鼠皮肤中胶原纤维粗细适中，紧密有序。

由图12可见，模型组的小鼠皮肤中胶原纤维排列松散杂乱无序，胶原纤维变短变细且数量少间隙大。

由图13可见，阳性对照组相对于模型组，小鼠皮肤中胶原纤维的量明显增加，且形态恢复正常。

由图14、图15可见，抗衰老乳液给药组相对于模型组，小鼠皮肤中胶原纤维的量明显增加，且形态恢复正常，并且抗衰老乳液高剂量组效果更优于低剂量组。

2.4 抗衰老乳液对衰老小鼠胶原纤维组织学参数的影响：

小鼠皮肤中胶原纤维的粗细、长度和密度的测定结果表明，与正常组相比，模型组的胶原纤维明显变细，长度变短，密度变小。给药后，相对于模型组，阳性对照组和抗衰老乳液低剂量组小鼠皮肤胶原纤维比例增加，但差异无统计学意义（P>0.05），给药组的其他参数均有显著增加（P<0.01），见表3。

表3抗衰老乳液对衰老小鼠胶原纤维组织学参数的影响（, n=6）

注：^△与正常组比较，^△△P<0.01；^▲与模型组比较，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01。

3、皮肤中生化指标的测定：

试验结果表明，与空白组相比较，模型组皮肤中的SOD、Hyp含量明显降低，MDA含量则明显增加。与模型组相比，抗衰老乳液高低剂量组皮肤的SOD、Hyp含量显著增加，MDA含量显著下降（P<0.05，P<0.01），见表4。

表4 抗衰老乳液对衰老小鼠皮肤SOD、MDA、Hyp含量的影响（, n=6）

注：^△与正常组比较，^△△P<0.01；^▲与模型组比较，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01。

4、抗衰老乳液对衰老小鼠皮肤含水率的影响：

皮肤含水率试验表明，相比于正常组，模型组的小鼠皮肤含水率减少；抗衰老乳液高低剂量给药后，小鼠皮肤的含水率均较模型组显著增加（P<0.05，P<0.01），见表4。

表4 抗衰老乳液对衰老小鼠皮肤含水率的影响（,n=6）

注：^△与正常组比较，^△△P<0.01；^▲与模型组比较，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01。

综上，本发明采用D-半乳糖联合紫外照射，综合模拟内源性和外源性衰老因素，更加符合真实衰老过程，成功建立小鼠衰老模型进行抗衰老乳液抗衰老实验。

实验结果显示：对比于正常组的小鼠皮肤，模型组小鼠的皮肤褶皱、暗沉且有色素沉着，表皮和真皮层变薄，胶原纤维排序紊乱且断裂，皮肤中超氧化物歧化酶（SOD）、羟脯氨酸（Hyp）含量减少，丙二醛（MDA）含量增加，皮肤含水率减少。经过抗衰老乳液经皮给药后，皮肤的皱纹变浅，且有光泽，皮肤光滑，相比于模型组，抗衰老乳液给药组皮肤全层结构完整，小鼠的表皮和真皮层变厚，胶原纤维排列致密且有序，胶原纤维比例也明显增加，皮肤中SOD、Hyp含量和含水率均显著增加，MDA含量显著减少。说明本发明产品—抗衰老乳液具有抗皮肤衰老作用。