麻疯树核糖体失活蛋白及其分离纯化方法与应用与流程

本发明属于植物蛋白质的分离纯化技术领域，特别涉及麻疯树核糖体失活蛋白及其分离纯化方法与应用。

背景技术：

恶性肿瘤严重威胁着人类的生命健康，但目前还非常缺乏有效的针对性治疗药物。植物中富含各种生物活性蛋白分子，从中寻找高效低毒的肿瘤治疗药物是一种有效途径。核糖体失活蛋白(ribosome-inactivatingproteins，rips，ec3.2.2.22)是一种存在于高等植物或真菌中的细胞毒素蛋白，多具有rnan-糖苷酶或多核苷酸:腺苷糖苷酶活性，通过作用于核糖体28srrna上保守的sarcin/ricin环腺苷酸的n-c糖苷键，使核糖体失活，进而抑制蛋白质翻译的进行。根据结构，植物rips可分为i型和ii型两大类，i型rip为单链蛋白，ii型rip除了含有类似i型rips的a链，还通过二硫键连接具有凝集素活性的b链。研究显示，rips具有抗肿瘤、抗病毒和抗真菌等多种生物学活性，特别是i型rips和ii型rips的a链显示出对肿瘤细胞的选择性杀伤作用，若将其与单克隆抗体结合制成免疫毒素，对肿瘤细胞的靶向性大大提高，有望开发成专一杀伤癌细胞的药物，在癌症治疗方面具有很大的发展潜能(linjy,tserngky,chencc,linlt,tungtc.abrinandricin:newanti-tumoursubstances.nature1970；227:292-293.)。

麻疯树(jatrophacurcasl.)为大戟科麻疯树属植物，广泛分布于热带和亚热带地区，其种子含油量高达40％，被当作一种理想的能源植物而广泛栽培，资源丰富。林娟等从麻疯树种仁中成功分离纯化了胚乳型核糖体失活蛋白curcin(麻疯树核糖体失活蛋白的分离纯化和作用机制研究，高技术通讯，2002，11，36-40)，并且发现其对胃癌细胞系sgc-7901、骨髓瘤细胞系sp2/0、人肝癌细胞系(humanhepatoma)的增殖有较强的抑制作用，对三者的半数抑制浓度依次为0.23mg/l、0.66mg/l和3.16mg/l(linjuanetal,antitumoreffectsofcurcinfromseedsofjatrophacurcas,actapharmacologicasinica,2003,24(3),241-246)。nuchsuk等从麻疯树种壳中分离纯化出了一种分子量为38.938kda的核糖体失活蛋白，该蛋白能抑制人乳腺癌mcf7细胞、结肠癌sw620和肝癌hepg2细胞的增殖，对三者的半数抑制浓度依次为0.15mm、0.25mm和0.40mm。由以上内容可知，麻疯树中存在多种核糖体失活蛋白变异体，不同的变异体虽然序列类似，但活性却存在较大差异，因此在麻疯树中继续挖掘新的、抗肿瘤活性高的核糖体失活蛋白，对于恶性肿瘤的针对性治疗将产生积极的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新的麻疯树核糖体失活蛋白及其分离纯化方法，以增加麻疯树核糖体失活蛋白的种类，并证明该麻疯树核糖体失活蛋白具有抗肿瘤活性，可作为制备治疗肿瘤的药物应用。

本发明提供的麻疯树核糖体失活蛋白，将该核糖体失活蛋白记作curcinc，curcinc从麻疯树种子萌发4～49天的麻疯树幼苗的子叶或/和胚乳中分离纯化得到，curcinc的相对分子量为31.398kda，等电点为7.12，curcinc的n-末端的氨基酸残基的序列如序列表中seqidno：1所示。

本发明通过实验证实curcinc能特异性地作用于兔网织红细胞的核糖体28srrna的高度保守的sarcin/ricin环的n-c糖苷键使其脱去腺嘌呤，curcinc对兔网织红细胞裂解液的离体翻译抑制半数浓度为0.05nmol/l。

本发明还提供了一种麻疯树核糖体失活蛋白的分离纯化方法，步骤如下：

(1)制备粗提液

①将麻疯树种子萌发，收集萌发4～49天的麻疯树幼苗的子叶或/和胚乳，将收集的子叶或/和胚乳用液氮研磨至粉状，然后向所得粉状物料中加入缓冲液a将粉状物料溶解并匀浆至少3min，将所得匀浆液旋转至少2h，然后离心并收集上清液；

②在搅拌下向步骤①所得上清液中加入硫酸铵至硫酸铵在上清液中的饱和度为55％～65％，再搅拌至少2h，离心并收集上清液；

③在搅拌下向步骤②所得上清液中加入硫酸铵至硫酸铵在上清液中的饱和度为75％～80％，再搅拌至少2h，离心并弃上清液、收集沉淀，将所得沉淀溶解于缓冲液a中即得粗提液；

步骤(1)中，液氮研磨之后的操作均在0～8℃进行，缓冲液a温度为0～8℃；

(2)脱盐层析及缓冲液交换

采用缓冲液b进行柱平衡，然后将步骤(1)所得粗提液作为样品上样，上样后用缓冲液b洗脱，收集第一个280nm吸收峰对应的洗脱组分，柱填料为sephadexg25superfine；

(3)阴离子交换层析

采用缓冲液b进行柱平衡，然后将步骤(2)收集的洗脱组分作为样品上样，上样后先用缓冲液b冲洗至基线稳定，然后采用缓冲液b和缓冲液c进行线性梯度洗脱，收集线性梯度洗脱阶段最高的280nm吸收峰对应的洗脱组分，柱填料为qsepharosehp；

(4)凝胶过滤层析

采用缓冲液b进行柱平衡，然后将步骤(3)收集的洗脱组分作为样品上样，上样后用缓冲液b洗脱，收集最高的280nm吸收峰对应的洗脱组分，将收集的洗脱组分冷冻干燥，即得麻疯树核糖体失活蛋白，柱填料为复合交联琼脂糖和右旋糖苷；

所述缓冲液a由磷酸缓冲液、乙二胺四乙酸水溶液和nacl配制而成，缓冲液a中，磷酸缓冲液的终浓度为0.2～0.8mmol/l、乙二胺四乙酸的终浓度为0.15～0.25mmol/l、nacl的终浓度为0.4～0.6mmol/l，缓冲液a的ph值为7.2～8.0；所述缓冲液b由磷酸缓冲液、乙二胺四乙酸水溶液配制而成，缓冲液b中，磷酸缓冲液的终浓度为0.2～0.8mmol/l、乙二胺四乙酸的终浓度为0.15～0.25mmol/l，缓冲液b的ph值为7.2～8.0；所述缓冲液c由磷酸缓冲液、乙二胺四乙酸水溶液和nacl配制而成，缓冲液c中，磷酸缓冲液的终浓度为0.2～0.8mmol/l、乙二胺四乙酸的终浓度为0.15～0.25mmol/l、nacl的终浓度为0.9～1.1mmol/l，缓冲液c的ph值为7.2～8.0。

上述方法的步骤(3)进行线性梯度洗脱时，洗脱起始点缓冲液c的体积百分含量为0、缓冲液b的体积含量为100％，洗脱结束点缓冲液c、缓冲液b在缓冲液b和缓冲液c组成的混合液中的体积含量为分别30％～35％、70％～65％。

上述方法的步骤(1)中，向粉状物料中加入缓冲液a溶解粉状物料时，缓冲液的加入量以缓冲液恰好将粉状物料溶解即可，通常向每1g粉状物料中加入2～4ml缓冲液a。

上述方法的步骤(1)③中，在使用缓冲液溶解所述沉淀形成粗提液时，缓冲液a的用量越多，后续步骤(2)～(4)的纯化操作的工作量越大，为了尽可能地减少纯化操作的工作量，该步骤中将所得沉淀恰好溶解于缓冲液a中即可。

本申请的发明人研究发现，从麻疯树种子萌发的第4天开始，麻疯树幼苗的胚乳中开始出现curcinc，并一直持续到胚乳从麻疯树幼苗上脱落(麻疯树种子萌发后的第8天)，从麻疯树种子萌发的第5天开始，麻疯树幼苗的子叶中开始出现curcinc，并一直持续到子叶从麻疯树幼苗上脱落(麻疯树种子萌发后的第49天)，因此上述方法的步骤(1)中，在收集分离纯化curcinc的原料时，收集上述两个时间段的麻疯树幼苗的子叶或胚乳即可。

本发明还提供了上述麻疯树核糖体失活蛋白在制备治疗肿瘤的药物中的应用，所述肿瘤为人骨肉瘤、人非小细胞肺癌或者人结肠癌。

本发明通过体外实验证明：本发明提供的麻疯树核糖体失活蛋白curcinc对人骨肉瘤u20s、人非小细胞肺癌a549、人非小细胞肺癌h1975和人结肠癌hct116均具有明显的增殖抑制作用，对人骨肉瘤u20s、人非小细胞肺癌a549、人非小细胞肺癌h1975和人结肠癌hct116的24小时ic50值分别为0.019μmol/l、0.047μmol/l、0.056μmol/l和0.13μmol/l。curcinc对人骨肉瘤u20s的离体增殖抑制效果尤其明显，效果优于curcin(0.27μmol/l)和紫杉醇(0.032μmol/l)，并且对人正常肾细胞hek-293的毒性较低。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明从麻疯树种子萌发4～49天的麻疯树幼苗的子叶或/和胚乳中分离纯化得到了麻疯树核糖体失活蛋白curcinc，curcinc的相对分子量、等电点、n-末端的氨基酸残基的序列均不同于现有文献报道的麻疯树胚乳型核糖体失活蛋白curcin、根据病原菌等诱导处理的麻疯树叶片mrna推导出的蛋白curcinl和从麻疯树种壳中分离纯化出的核糖体失活蛋白jc-scrip，是一种新型的麻疯树核糖体失活蛋白。

2.本发明提供的麻疯树核糖体失活蛋白curcinc对人骨肉瘤u20s、人非小细胞肺癌a549、人非小细胞肺癌h1975和人结肠癌hct116均具有明显的增殖抑制作用，对人骨肉瘤u20s、人非小细胞肺癌a549、人非小细胞肺癌h1975和人结肠癌hct116的24小时ic50值分别为0.019μmol/l、0.047μmol/l、0.056μmol/l和0.13μmol/l。curcinc对人骨肉瘤u20s的离体增殖抑制效果尤其明显，效果不仅明显优于curcin，而且高于阳性对照紫杉醇，且curcin对人正常肾细胞hek-293的毒性较低，适合在制备治疗肿瘤的药物中应用。

3.本发明首次建立了从麻疯树中分离纯化curcinc的方法，该方法的步骤(1)中采用55％～65％饱和度的硫酸铵将大量杂蛋白进行预沉淀，然后用75％～80％饱和度的硫酸铵对目标蛋白进行富集沉淀，这一操作能使粗提液中蛋白质组分复杂度大幅度下降，具有明显的纯化效果，经过该方法的步骤(3)的阴离子交换层析，能够得到纯度达到电泳纯的curcinc，该纯度能满足基于curcinc基础研究和后续的产品研发，经过该方法步骤(4)的凝胶过滤层析，能够得到纯度高于95％的高纯curcinc。

附图说明

图1为实施例1中curcin和麻疯树种子萌发不同天数后的子叶和胚乳中的curcinc的western杂交分析图，其中，图(a)为curcin和麻疯树种子萌发前至萌发后第8天的胚乳中curcinc的western杂交分析图，图(b)为curcin和麻疯树种子后第1天至第8天的子叶中curcinc的western杂交分析图，图(c)为麻疯树种子萌发后第3天至第49天的子叶中curcinc的western杂交分析图，图1中，m是蛋白质分子量标准，curcin是指curcin的western杂交分析图d0是指浸泡种子的当天，d1是指种子萌发的第一天，d2是指种子萌发的第二天，d3～d49d的含义以此类推。

图2为实施例2的步骤(1)中加硫酸铵至不同饱和度得到的沉淀组分的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的结果(考马斯亮蓝r-250染色)，图中，泳道1为蛋白质分子量标准，泳道2为加(nh4)2so4至30％饱和度得到的沉淀组分，泳道3为加(nh4)2so4至60％饱和度得到的沉淀组分，泳道4为加(nh4)2so4至80％饱和度得到的沉淀组分，箭头所指为curcinc所在位置；

图3为实施例3的步骤(2)的层析峰型图(或称色谱图)，箭头所指为需要收集的洗脱组分的吸收峰，图中，uv表示紫外信号，cond表示电导率信号；

图4为实施例3的步骤(3)的层析峰型图(或称色谱图)，箭头所指为需要收集的洗脱组分的吸收峰，图中，uv表示紫外信号，cond表示电导率信号；

图5为实施例3的步骤(4)的层析峰型图(或称色谱图)，箭头所指为需要收集的洗脱组分的吸收峰，图中，uv表示紫外信号；

图6为实施例2中步骤(1)～(4)的粗提液以及收集的洗脱组分的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图(考马斯亮蓝r-250染色)，图中，m为蛋白质分子量标准，泳道1为curcinc粗提液，泳道2为步骤(2)中收集的洗脱组分，泳道3为步骤(3)中收集的洗脱组分，泳道4为步骤(4)中收集的洗脱组分；

图7为实施例4中采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测定curcinc的相对分子量的结果图，图中，箭头指向的位置为基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱得到的curcinc的分子量；

图8为实施例4中采用毛细管电泳法测定curcinc等电点的结果图，图中，1、2、3处的三个峰分别为三个标记物的等电点；

图9为实施例5中curcinc的n-糖苷酶活性测定结果图，图中，m为核酸分子量标记dl2000，泳道1为经curcinc处理的兔网织红细胞核糖体28srrna，泳道2为curcinc加酸性乙酸苯胺处理兔网织红细胞核糖体28srrna，箭头所指为450bp左右的特征带；

图10为实施例6中curcinc离体抑制蛋白质翻译活性测定的结果图，图中，横坐标为curcinc浓度的常用对数值，curcinc的浓度单位为nmol/l，纵坐标为荧光素酶活性百分率。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明所述麻疯树核糖体失活蛋白及其制备方法与应用作进一步说明。

下述各实施例中，麻疯树种子采自四川省和云南省，实验用兔选择成年雄性新西兰大白兔，体重为2.5kg；封闭用正常羊血清原液，购自北京中杉金桥生物技术有限公司，产品编号zli-9021，辣根过氧化物酶标山羊抗兔igg，购自北京中杉金桥生物技术有限公司，产品编号zb2305；四甲基联苯胺(n,n,n',n'-tmb)购自美国amresco公司，氯化钠、乙二胺四乙酸(edta)、硫酸铵、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、吐温-20等其他所有化学药品均为进口或国产分析纯试剂。

下述各实施例中，纯化系统采用aktapurifierupc10(gehealthcare)；脱盐层析柱填料采用sephadexg-25superfine(gehealthcare)，阴离子交换层析柱填料采用qsepharosehp(gehealthcare)，凝胶过滤柱填料为复合交联琼脂糖和右旋糖苷，即cross-linkedagaroseanddextran(gehealthcare)，凝胶过滤层析柱为superdex75prepgrade(gehealthcare)；高速冷冻离心机的型号为j-25r(beckman)。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照j.萨姆布鲁克等著的《分子克隆实验指南》(第三版)中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

以下各实施例中，将本发明所述麻疯树核糖体失活蛋白记作curcinc，curcin是指linjuan等公开的麻疯树核糖体失活蛋白(见antitumoreffectsofcurcinfromseedsofjatrophacurcas,actapharmacologicasinica,2003,24(3),241-246)，下述各实施例中的curcin均按照cn101891798b中公开的方法制备。

实施例1

本实施例中，通过实验证实本发明所述麻疯树核糖体失活蛋白curcinc存在于萌发后麻疯树幼苗子叶和胚乳中。

将麻疯树种子用自来水浸泡2小时，然后种在蛭石制成的培养床上，在温度为25～30℃，光照18小时、黑暗6小时的条件下萌发，适当浇水使培养床保持湿润，当子叶完全展开时，将幼苗移栽至蛭石与营养土的体积比为1:1的混合土壤里，在与萌发相同的环境条件下继续生长。从浸泡种子开始，每天收集麻疯树的子叶和胚乳，直至子叶和胚乳从麻疯树幼苗上脱落，其中，子叶在萌发后第49天左右从麻疯树幼苗上脱落，胚乳在萌发后第8天左右从麻疯树幼苗上脱落。

将收集的麻疯树子叶和胚乳，以及按照cn101891798b中公开的方法制备的curcin，按照j.萨姆布鲁克等著的《分子克隆实验指南》(第三版)中所列的具体方法进行蛋白质印迹分析(westernblotanalysis)，蛋白质印迹分析时采用的一抗为curcin抗兔的多克隆抗体，二抗为鼠抗兔多克隆抗体。

实验结果如图1所示，由图1(a)可知，从麻疯树种子萌发的第4天开始，麻疯树幼苗的胚乳中开始出现curcinc，并一直持续到胚乳从麻疯树幼苗上脱落，也就是麻疯树种子萌发后的第8天；由图1(b)和(c)可知，从麻疯树种子萌发的第5天开始，麻疯树幼苗的子叶中开始出现curcinc，并一直持续到子叶从麻疯树幼苗上脱落，也就是麻疯树种子萌发后的第49天；结合蛋白质分子量标准可知，curcinc的相对分子量约为32kda，curcin的相对分子量约为28kda。

实施例2

本实施例中，从萌发的麻疯树幼苗的子叶和胚乳中分离纯化curcinc，步骤如下：

(1)制备粗提液

①将麻疯树种子萌发，收集萌发4～49天的麻疯树幼苗的子叶和胚乳共40g，将收集的子叶和胚乳分别用液氮研磨至粉状，然后向所得粉状物料中加入120ml4℃的缓冲液a将粉末状物料溶解，在4℃匀浆，匀浆时每匀浆30s、停30s，共匀浆5min，将所得匀浆液在4℃旋转过夜，在4℃以10000rpm的转速离心30min并收集上清液(即为匀浆粗提液)；

②在4℃于搅拌条件下向上清液中加入粉末状硫酸铵至硫酸铵在上清液中的饱和度为60％，继续在4℃搅拌2h，在4℃以10000rpm的转速离心30min并收集上清液；

③在4℃于搅拌条件下向上清中加入粉末状硫酸铵至硫酸铵在上清液中的饱和度为80％，在4℃继续搅拌2h，再在4℃以10000rpm的转速离心30min并弃上清液、收集沉淀，将所得沉淀溶解于20ml4℃的缓冲液a中即得curcinc粗提液。

图2为该步骤中加硫酸铵至不同饱和度得到的沉淀组分的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的结果(考马斯亮蓝r-250染色)，其中，泳道1为蛋白质分子量标准，泳道2为加(nh4)2so4至30％饱和度得到的沉淀组分，泳道3为加(nh4)2so4至60％饱和度得到的沉淀组分，泳道4为加(nh4)2so4至80％饱和度得到的沉淀组分，图中，箭头所指为curcinc所在位置。后续实验(实施例4)通过质谱分析测定了curcinc的相对分子量为31.398kd，结合图2中泳道1的蛋白质分子量标准可知，该步骤加(nh4)2so4至60％和80％饱和度得到的沉淀组分中含有curcinc。

(2)脱盐层析及缓冲液交换

该步骤在aktapurifierupc10纯化系统上进行，柱填料为sephadexg25superfine，柱体积为5ml，流速控制在1ml/min，检测波长为280nm。

采用缓冲液b进行柱平衡直至280nm吸收线和电导检测线稳定，然后将步骤(1)所得curcinc粗提液作为样品上样，上样后采用缓冲液b进行等相洗脱，收集第一个280nm吸收峰对应的洗脱组分。图3为该步骤(2)的层析峰型图(或称色谱图)，箭头所指为需要收集的洗脱组分的吸收峰，实际操作时，收集该吸收峰对应的洗脱组分。

(3)阴离子交换层析

该步骤在aktapurifierupc10纯化系统上进行，柱填料为qsepharosehp，柱体积为5ml，流速控制在5ml/min，检测波长为280nm。

采用缓冲液b进行柱平衡直至基线稳定，然后将步骤(2)收集的洗脱组分作为样品上样，上样后先用缓冲液b冲洗至基线稳定，然后采用缓冲液b和缓冲液c进行线性梯度洗脱，梯度洗脱时，洗脱起始点缓冲液c的体积百分含量为0、缓冲液b的体积含量为100％，洗脱结束点缓冲液c、缓冲液b在缓冲液b和缓冲液c组成的混合液中的体积含量为分别30％～35％、70％～65％，收集线性梯度洗脱阶段最高的280nm吸收峰对应的洗脱组分。图4为该步骤的层析峰型图(或称色谱图)，箭头所指为需要收集的洗脱组分的吸收峰，实际操作时，收集该吸收峰对应的洗脱组分。

(4)凝胶过滤层析

该步骤在aktapurifierupc10纯化系统上进行，柱填料为复合交联琼脂糖和右旋糖苷(cross-linkedagaroseanddextran)，柱体积为24ml，流速控制在0.5ml/min，检测波长为280nm。

采用缓冲液b进行柱平衡直至基线稳定，然后将步骤(3)收集的洗脱组分作为样品上样，上样后用缓冲液b洗脱，收集最高的280nm吸收峰对应的洗脱组分，将收集的洗脱组分冷冻干燥，即得麻疯树核糖体失活蛋白curcinc。图5为该步骤的层析峰型图(或称色谱图)，箭头所指为需要收集的洗脱组分的吸收峰，实际操作时，收集该吸收峰对应的洗脱组分。

上述各步骤中，所述缓冲液a由磷酸缓冲液、乙二胺四乙酸水溶液和nacl配制而成，缓冲液a中，磷酸缓冲液的终浓度为0.5mmol/l、乙二胺四乙酸的终浓度为0.2mmol/l、nacl的终浓度为0.5mmol/l，缓冲液a的ph值为8.0；所述缓冲液b由磷酸缓冲液、乙二胺四乙酸水溶液配制而成，缓冲液b中，磷酸缓冲液的终浓度为0.5mmol/l、乙二胺四乙酸的终浓度为0.2mmol/l，缓冲液b的ph值为8.0；所述缓冲液c由磷酸缓冲液、乙二胺四乙酸水溶液和nacl配制而成，缓冲液c中，磷酸缓冲液的终浓度为0.5mmol/l、乙二胺四乙酸的终浓度为0.2mmol/l、nacl的终浓度为1mmol/l，缓冲液c的ph值为8.0。

图6为实施例2中步骤(1)～(4)的粗提液以及收集的洗脱组分的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图(考马斯亮蓝r-250染色)，图中，m为蛋白质分子量标准，泳道1为curcinc粗提液，泳道2为步骤(2)中收集的洗脱组分，泳道3为步骤(3)中收集的洗脱组分，泳道4为步骤(4)中收集的洗脱组分。

以上纯化curcinc的过程中，各步骤curcinc的得率如表1所示。

表1curcinc纯化过程的得率

实施例3

本实施例中，测定curcinc的n-末端氨基酸残基的序列，并将其与现有文献报道的麻疯树核糖体失活蛋白的n-末端氨基酸残基的序列进行比较。

curcinc的n-末端的氨基酸残基的序列通过下述方法获得：将实施例2得到的curcinc经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移到pvdf膜上，采用岛津ppsq-33a型全自动蛋白质多肽测序仪测定curcinc的n-末端氨基酸残基的序列，结果为：-alaglyserthrprothrleualailethrtyraspalathrthr。

把curcinc蛋白的n-末端氨基酸残基的序列与ncbi上的rips的n-末端氨基酸残基的序列进行比对，发现有三组与curcincn-末端的氨基酸残基的序列接近的蛋白，其n-末端的氨基酸残基的序列信息如下：

1.从麻疯树种仁的胚乳中分离纯化出的curcin，其n-末端氨基酸残基的序列为-alaglyserthrprothrleuthrilethrtyraspalaalaala(见linjuanetal,“antitumoreffectsofcurcinfromseedsofjatrophacurcas”,actapharmacologicasinica,2003,24(3),241-246)；

2.病原菌等诱导处理麻疯树叶片所获mrna推导蛋白curcinl，其n-末端的氨基酸残基的序列为-alaglyserthrprothrleuthrvalthrtyraspalathrthr(见xiaoboqinetal,“differentfunctionsandexpressionprofilesofcurcinandcurcin-linjatrophacurcasl.”zeitschriftfürnaturforschungc,2010；65:5-6)；

3.从麻疯树种壳中分离纯化出的核糖体失活蛋白jc-scrip，其n-末端的氨基酸残基的序列为-alaileasnglyglyvalala(见chanthakannuchsuketal,“bioactivitiesofjc-scrip,atype1ribosomeinactivatingproteinfromjatrophacurcasseedcoat”chembioldrugdes2013；82:453–462)。

将本实施例测得的curcinc的n-末端的氨基酸残基的序列与上述三个麻疯树核糖体失活蛋白的n-末端的氨基酸残基的序列进行同源性比较，结果表明：curcinc的n-末端的15个氨基酸残基的序列与curcin的n-末端的15个氨基酸残基的序列的同源性为80％，curcinc的n-末端的15个氨基酸残基的序列与curcinl的n-末端的15个氨基酸残基的序列的同源性为93％，curcinc的n-末端的15个氨基酸残基的序列与jc-scrip的n-末端的氨基酸残基的序列差异明显，二者没有可比性，以上内容说明curcinc是一个新的麻疯树核糖体失活蛋白。

实施例4

本实施例中，测定curcinc的相对分子量和等电点。

1.相对分子量的测定

将实施例2得到的curcinc经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝r-250染色，用超纯水或者蒸馏水脱色，然后在分子量约为32kda的位置切下目的条带，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的正离子模式线性方法测定表观分子量，采用的质谱仪为5800maldi-tof/tof,absciex，标准物质校准范围为：39212±100、66430±100，原始数据及图谱由4000seriesexplorerv3.5软件导出。图7为实施例4中采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测定curcinc的相对分子量的结果图，由图7可知，curcinc的相对分子质量为31.398kda。

2.等电点的测定

将实施例2得到的curcinc经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，在对应分子量约为32kda的位置切下目的条带，用毛细管电泳法测定等电点，选用的仪器为beckman-coulter的pa800plus药物分析系统，样品检测使用280nm光吸收，结果分析使用32karat软件，采用毛细管电泳法测定curcinc等电点的结果见图8，由图8可知，curcinc的等电点为7.12。

将本发明的curcinc与现有文献报道的麻疯树核糖体失活蛋白的相对分子量和等电点进行比较，列于表2，由表2可知，curcinc的相对分子量和等电点与现有文献报道的麻疯树核糖体失活蛋白的相对分子量和等电点均不同。

表2麻疯树核糖体失活蛋白的相对分子量和等电点比较

实施例5

本实施例中，测定curcinc的n-糖苷酶活性。

将50μl兔网织红细胞裂解液加入50μgcurcinc并混合均匀，在30℃的水浴中放置30min，然后加入1mltrizol提取液，混合均匀，在冰浴中放置3min，加入200μl三氯甲烷，振荡30s，在4℃以13000rpm的转速离心10min并收集上清液，将所得上清液平均分为两份。向其中一份上清液中加入1/5体积的现配制的酸性乙酸苯胺溶液(0.2mol/l，ph4.5，苯胺:冰乙酸:depc水＝1:1:3.5(v/v)，在黑暗条件下配制)，然后加入等体积的异丙醇，在-20℃的冰箱中静置30min；向另一份上清液中加入等体积的异丙醇，在-20℃的冰箱中静置30min；将经过上述处理的两样品在4℃以13000rpm的转速离心10min，弃上清，收集沉淀，使用70％(v/v)的乙醇洗涤挥发后，加入10μldepc水溶解沉淀，然后加入5μl6×上样电泳缓冲液混合，2.0％琼脂糖凝胶电泳检测。图9本实施例中curcinc的n-糖苷酶活性测定结果图，图中，m为核酸分子量标记dl2000，泳道1为经curcinc处理的兔网织红细胞核糖体28srrna，泳道2为curcinc加酸性乙酸苯胺处理兔网织红细胞核糖体28srrna，箭头所指为450bp左右的特征带。由图9可知，curcinc能特异性地作用于兔网织红细胞的核糖体28srrna的高度保守的sarcin/ricin环的n-c糖苷键使其脱去腺嘌呤，并在酸性乙酸苯胺的处理下导致磷酸二酯键的断裂，从而产生450bp左右的特征带。

实施例6

本实施例中，测定curcinc的离体翻译抑制活性。

采用兔网织红细胞裂解液试剂盒(promega)并按照试剂盒步骤说明进行，curcinc离体抑制蛋白质翻译活性测定的结果如图10所示，测得的curcinc对兔网织红细胞裂解液系统的离体翻译半数抑制浓度为0.05nm，而已经公开的curcin的离体翻译半数抑制浓度为0.217nm，这说明curcinc的活性明显高于curcin。

实施例7

本实施例中，考察curcinc对体外培养的肿瘤细胞的增殖抑制作用及对人正常细胞的影响。

取生长状态较好的对数生长期的肿瘤细胞(包括人骨肉瘤u20s、人非小细胞肺癌a549、人非小细胞肺癌h1975、人结肠癌hct116及人白血病mv4-11)和人正常肾细胞hek-293，稀释到2×10⁴/ml并接种到96孔板上，在37℃培养24h，更换新鲜的mtt培养基，加入不同浓度梯度的curcin(3,6,12,24,48,96μg/ml)和curcinc(1.25,2.5,5,10,20,40μg/ml)诱导培养24h。以紫杉醇和curcin作为阳性对照，阴性对照加营养液100μl，空白对照加营养液100μl，用于仪器调零。培养结束后，每孔加入液体mtt培养基并摇匀，继续孵育4h，弃上清，向每孔中加入150μl二甲亚砜，震荡10分钟使结晶物充分溶解。用酶标仪在570nm测定各孔的吸光度，每个浓度设置5个复孔并且重复实验3次，计算肿瘤活性抑制率，肿瘤活性抑制率＝[(od570空白对照-od570样品)/od570空白对照]×100％，用spss软件进行统计学分析并计算半数抑制浓度ic50，结果如表3所示。

表3curcinc、curcin以及紫杉醇对肿瘤生长半数抑制浓度ic50

n.d.表示未检测

由表4可知，curcinc对人骨肉瘤u20s、人非小细胞肺癌a549、人非小细胞肺癌h1975、人结肠癌hct116均具有明显的增殖抑制作用，其48h的ic50为0.019μm到0.13μm，对于人骨肉瘤u20s的离体增殖抑制效果尤其明显，效果不仅优于阳性对照curcin，甚至高于阳性对照紫杉醇。curcinc对人正常肾细胞hek-293和人白血病mv4-11的细胞抑制作用较小，其48h的ic50分别为0.24μm和＞1μm，curcinc对肿瘤细胞的增殖具有明显的选择性抑制作用，且对人正常肾细胞毒性较低，可在制备治疗肿瘤的药物中应用。

序列表

<110>四川大学

<120>麻疯树核糖体失活蛋白及其分离纯化方法与应用

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>15

<212>prt

<213>麻疯树(jatrophacurcasl.)

<220>

<221>acetylation

<222>(1)..(15)

<223>麻疯树核糖体失活蛋白的n-末端的氨基酸残基的序列

<400>1

alaglyserthrprothrleualailethrtyraspalathrthr

151015