分子标志物MK2基因及其应用的制作方法

本发明涉及肿瘤的分子诊断领域，更具体地，本发明涉及骨髓瘤细胞中的分子标志物mk2基因及其在制备诊断多发性骨髓瘤的产品中的应用。

背景技术：

多发性骨髓瘤(multiplemyeloma，mm)是一种浆细胞恶性肿瘤，其特点是骨髓中浆细胞克隆性增殖，并分泌单克隆免疫球蛋白或轻链。由于异常浆细胞浸润骨骼、骨髓和全身多个器官组织，引起病理性的骨骼破坏，患者的血清中出现异常的单克隆免疫球蛋白，从而抑制了机体的正常的多克隆免疫球蛋白，患者的尿内出现蛋白，患者最后表现出导致贫血、肾功能损害及病理性骨折等。mm是全世界发病率排名第二位的血液肿瘤，当前我国50岁以上的肿瘤病人中mm患者大约占据3％左右，随着我国人口的老龄化，mm发病率以每年1％的速度上升。目前认为mm发生是一个逐步进展的过程，很多患者在早期发生意义不明的单克隆球蛋白症，然后进展为mm，部分患者最终发展为髓外骨髓瘤(浆细胞白血病)，整个过程中患者骨髓浆细胞伴有多种基因的突变。

目前多发性骨髓瘤的诊断主要依靠骨髓克隆性浆细胞比例和(或)活组织病理学检查作为mm诊断基础。国际骨髓瘤工作组(imwg)于2014年修订了意义未明的单克隆免疫球蛋白血症(mgus)、mm诊断标准。mm诊断标准包括骨髓中克隆性浆细胞比例≥10％和/或活组织病理学检查证实为浆细胞瘤；同时伴有以下一种或多种情况：高钙血症、肾功能不全、贫血和溶骨性骨损害。单克隆免疫球蛋白(m蛋白)是临床常用的mm诊断标志物，但修订后的诊断标准强调m蛋白不是诊断mm的必备条件，但可用来区别分泌型或非分泌型mm。此外，mri、低剂量全身ct、fdg/pet及pet/ct等现代影像学技术被纳入检查辅助方法。

目前多发性骨髓瘤诊断的方法复杂、检查项目多，缺少一种可靠、方便的临床诊断方法。近年来，本课题组基于基因芯片表达谱，发现在多发性骨髓瘤患者中，mk2基因的表达显著增高，mk2基因的表达水平与与多发性骨髓瘤患者病理进程及耐药性密切相关。表明mk2是一种高危的骨髓瘤基因，可为多发性骨髓瘤的临床诊断提供可靠的判断。

mk2(mitogen-activatedproteinkinase-activatedproteinkinase2，mapkapk2)是于1992年发现并被纯化的第一个mapk激活蛋白激酶，主要被p38蛋白激酶直接磷酸化激活，是p38蛋白激酶的重要底物，在介导胞外信号引起的细胞增殖、分化、衰老、凋亡及炎症等反应中起着重要作用。mk2为致癌基因，可通过磷酸化途径直接活化多种肿瘤相关因子如细胞分裂周期蛋白25b/c和热休克蛋白27等；其亦可通过转录后调控机制上调多个癌基因和促炎因子的表达，而促进肿瘤包括肺癌的发生发展；mk2过表达可活化lim激酶而激活vegf诱导的血管生成过程，从而促进肿瘤的侵袭和转移。

技术实现要素：

解决的技术问题：本发明的目的在于提供一种分子标志物mk2基因及其在制备诊断多发性骨髓瘤的产品中的应用。

技术方案：分子标志物mk2基因，序列如seqidno.1所示。

分子标志物mk2蛋白，序列如seqidno.2所示。

分子标志物mk2基因在制备诊断多发性骨髓瘤的产品中的应用。

上述产品包括：通过rt-pcr、实时定量pcr、免疫组化、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测mk2基因表达水平以诊断多发性骨髓瘤的产品。

上述用实时定量pcr诊断多发性骨髓瘤的产品至少包括一对特异扩增mk2基因的引物；所述用免疫组化诊断多发性骨髓瘤的产品包括：与mk2蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断多发性骨髓瘤的产品包括：与mk2基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断多发性骨髓瘤的产品包括：蛋白芯片和基因芯片，其中蛋白芯片包括与mk2蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与mk2基因的核酸序列杂交的探针。

上述用实时定量pcr诊断多发性骨髓瘤的产品至少包括一对特异扩增mk2基因的引物，序列如：seqidno.3和seqidno.4所示。

一种用于诊断多发性骨髓瘤的工具，该工具能够检测样本中mk2基因的表达。

上述工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。

上述芯片包括基因芯片或蛋白质芯片，所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测mk2基因转录水平的针对mk2基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的mk2蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫组化试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测mk2基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫组化试剂盒包括mk2蛋白的特异性抗体；所述试纸包括用于检测mk2基因转录水平的试纸；所述高通量测序平台包括用于检测mk2基因转录水平的试剂。

上述检测mk2基因转录水平的试剂包括针对mk2基因的引物和/或探针。

有益效果：本发明首次发现了mk2基因表达与多发性骨髓瘤相关。本发明发现了一种诊断多发性骨髓瘤的分子标志物mk2，使用该分子标志物可以在多发性骨髓瘤发生的早期即可作为判断，或者判断受试者是否存在患有多发性骨髓瘤的风险,提供了患者的生存率。本发明发现了一种新的生物标记物mk2基因，相比传统的检测手段，基因诊断不仅稳定、方便，且灵敏、特异，从而及时控制多发性骨髓瘤的进程，降低死亡率。

附图说明

图1显示利用基因芯片(geneexpressionprofiling,gep)检测mk2基因在多发性骨髓瘤患者和正常人中的表达差异图。分析22例正常骨髓(np)、44例意义未明的单克隆丙种球蛋白疾病(monoclonalgammopathyofundeterminedsignificance，mgus，骨髓瘤前体疾病)以及351例初诊mm患者样本，mk2表达水平在mm患者样本中显著升高。

图2显示利用qpcr检测mk2基因在多发性骨髓瘤患者和正常人中的表达差异图。

图3显示利用免疫组化(ihc)染色方法分析mk2在正常骨髓和mm患者骨髓样本中表达情况图，结果显示mk2在mm患者样本中表达显著升高。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明提供了检测mk2基因表达的产品在制备诊断多发性骨髓瘤的工具中的应用。

进一步，上面所提到的检测mk2基因表达的产品包括：通过实时定量pcr、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台等检测mk2基因表达水平以诊断多发性骨髓瘤的产品。

进一步，所述用实时定量pcr诊断多发性骨髓瘤的产品至少包括一对特异扩增mk2基因的引物；所述用免疫检测诊断多发性骨髓瘤的产品包括：与mk2蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断多发性骨髓瘤的产品包括：与mk2基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断多发性骨髓瘤的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与mk2蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与mk2基因的核酸序列杂交的探针。

在本发明的具体实施方案中，所述用实时定量pcr诊断多发性骨髓瘤的产品至少包括一对特异扩增mk2基因的引物的序列如：seqidno.3和seqidno.4所示。

优选地，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中，高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测mk2基因表达的产品可以应用于该平台实现对mk2基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知mk2基因的异常与多发性骨髓瘤相关也属于mk2基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种多发性骨髓瘤的工具，所述产品包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测mk2基因转录水平的针对mk2基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的mk2蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括mk2基因在内的多个基因(例如，与多发性骨髓瘤相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括mk2蛋白在内的多个蛋白质(例如与多发性骨髓瘤相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与多发性骨髓瘤相关的标志物同时检测，可大大提高多发性骨髓瘤诊断的准确率。

其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测mk2基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括mk2蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用实时定量pcr、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测mk2基因表达水平过程中所需的试剂。优选地，所述试剂包括针对mk2基因的引物和/或探针。根据基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测mk2基因表达水平的引物和探针。

所述高通量测序平台包括检测mk2基因表达水平的试剂。

所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测mk2基因的转录水平。

与mk2基因的核酸序列杂交的探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其他衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4碱基对，以免影响杂交效率。

进一步，所述mk2蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述mk2蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如：嵌合抗体，scfv、fab、f(ab’)2、fv等)。只要所述片段能够保留与mk2蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

本发明的具体实施方案中，所述针对mk2基因的引物序列如下：正向引物序列如seqidno.3所示，反向引物序列如seqidno.4所示。

用于诊断多发性骨髓瘤的mk2基因及其表达产物的来源包括但不限于骨髓、血液、组织液、尿液、唾液等可以获得基因组dna的体液。在本发明的具体实施方案中，用于诊断多发性骨髓瘤的mk2基因及其表达产物的来源是骨髓。

本发明的上下文中，“mk2基因”包括mk2基因以及mk2基因的任何功能等同物的多核苷酸。mk2基因包括与目前国际公共核酸序列genebank中mk2基因(nc_000001.11)dna序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna序列；

优选地，mk2基因的编码序列包括以下任意一种：

(1)序列表中seqidno.1所示的dna序列；

(2)在严格条件下与(1)限定的dna序列杂交且编码相同蛋白质的dna序列；

(3)与(1)或(2)限定的dna序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna分子。

在本发明的具体实施方案中，所述mk2基因的编码序列是seqidno.1所示的dna序列。

在本发明的上下文中，mk2基因表达产物包括mk2蛋白以及mk2蛋白的部分肽。所述mk2蛋白的部分肽含有与多发性骨髓瘤相关的功能域。

“mk2蛋白”包括mk2蛋白以及mk2蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括mk2蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与mk2的dna杂交的dna所编码的蛋白质。

优选地，mk2蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

(1)由序列表中seqidno.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将seqidno.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由seqidno.2所示的氨基酸序列衍生物的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-20个，最佳地1-10个。

(3)与seqidno.2所示的氨基酸序列至少具有80％同源性(又称为序列统一性)，更优选地，与seqidno.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。

在本发明的具体实施方案中，所述mk2蛋白是具有seqidno.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是mk2蛋白的融合蛋白。对于与mk2蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留mk2蛋白的生物活性即可。

本发明的mk2蛋白也包括对seqidno.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留mk2蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。

在本发明的上下文中，“多发性骨髓瘤”既包括判断受试者是否已经患有多发性骨髓瘤、也包括受试者是否存在患有多发性骨髓瘤的风险。

实施例1筛选多发性骨髓瘤患者和正常人中差异表达的基因

1、研究对象：

收集多发性骨髓瘤患者8例，正常人8例

多发性骨髓瘤患者的纳入标准：所有多发性骨髓瘤的诊断根据who诊断多发性骨髓瘤标准，所有初治多发性骨髓瘤患者骨髓单个核细胞标本获得病人的知情同意。

多发性骨髓瘤患者的排除标准：转移癌，反应性浆细胞增多症和未定性的单克隆免疫球蛋白病。

2、骨髓中总rna的提取

(1)骨髓单个核细胞的分离：向收集到的骨髓标本中加入3倍体积的红细胞裂解液，用滴管反复吹打混匀后于冰上放置10～15min，使骨髓标本中的红细胞充分裂解；1200rpm/min离心5min，弃上清，pbs洗涤细胞1次。弃上清，加入1mlpbs吹打混匀后转移至1.5mlep管中，1200rpm/min离心5min，弃上清。每个样本加1mltrizol，吹打混匀。

(2)每1mltrizol加入氯仿200μl，充分混匀剧烈震荡15秒，室温静置10min等待分层。

(3)于4℃12000rpm/min离心15min。离心后可见管中混合物液面分为3层，最上层为无色水相，含有rna；中间层为白色絮状，含有蛋白层与dna；最下层为红色的酚-氯仿有机相。

取上层水相约400μl至另一ep管中，注意避免吸入中间的蛋白层，每管加入等体积异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，室温静置10min，于4℃12000rpm/min离心10min，可见管底白色沉淀。

弃上清，加入-20℃预冷的75％depc酒精1ml，悬起沉淀，4℃7500rpm/min离心5min。

弃上清，室温放置10-20min风干沉淀，依据沉淀量的多少酌情加入depc水溶解沉淀。-80℃冰箱保存。

3、rna样品的质量分析

紫外分光光度计检测rna样品，od260/od280为1.8-2.0。

4、基因芯片杂交及扫描

采用affymetrixu133plus2.0microarrays检测rna水平。多发性骨髓瘤患者组的数据可在nih基因表达综合(geo)下gse2658检索号查得，正常组和未定性的单克隆免疫球蛋白病的基因芯片数据在gse5900下。

5、芯片数据处理与分析

基因芯片的数据分析基于gco1.1软件(affymetrix)，包含对与疾病相关相关的生存的单变量的对数等级检测。对于两组比值的自然对数绝对值大于2.0或小于0.5的基因作为差异表达基因。

6、统计学处理

采用spss13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，p＜0.05有显著意义。

7、结果

结果显示(如图1所示，分析22例正常骨髓，44例意义未明的单克隆丙种球蛋白疾病(monoclonalgammopathyofundeterminedsignificance，mgus，mm前体疾病)，351例mm初诊病人浆细胞基因芯片数据库，发现mk2基因的表达水平在mm患者中要明显高于正常以及mgus样本)，与正常人相比，多发性骨髓瘤患者mk2基因的mrna水平显著升高，差异具有统计学意义(p＜0.05)。

实施例2qpcr实验验证多发性骨髓瘤患者和正常人中差异表达的基因

1、研究对象

筛选标准同实施例1，多发性骨髓瘤患者46例，正常人66例。

2、骨髓中总rna的提取

步骤同实施例1。

3、逆转录

根据takara逆转录试剂盒进行rna逆转录。采用10μl反应体系，分别加入5×primescriptrtmastermix2μl，总rna0.5μg，加一定量rnasefreewater至10μl。37℃反应15min，85℃反应5s。产物cdna置-20℃冰箱保存。

4、qpcr

采用10μl反应体系，每个样本设置3个复孔，加样过程避光。配制以下反应体系：2×sybgreenmastermix5μl，正向引物0.5μl，反向引物(5pm)0.5μl，反向引物(5pm)0.5μl，模板cdna1μl，ddh2o3μl。扩增mk2基因的正向引物序列为5’-tggggcgttaactgcatctgg-3’(seqidno.3)，反向引物序列为5’-tgggcctgctgttcacagtt-3’(seqidno.4)；扩增gapdh基因的正向引物序列为5’-gcaccgtcaaggctgagaac-3’(seqidno.5)，反向引物序列为5’-tggtgaagacgccagtgga-3’(seqidno.6)，各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃1min，95℃15s，60℃15s，72℃30s；共40个循环。以sybrgreen作为荧光标记物，在lightcycler荧光实时定量pcr仪上进行反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，△△ct法进行相对定量。

5、统计学方法

结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss13.0统计软件来进行统计分析，两者之间差异采用t检验，认为当p＜0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图2所示，与正常人相比，多发性骨髓瘤患者的mk2基因的mrna水平显著增高，差异具有统计学意义(p＜0.05)，结果同基因芯片实验。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>南京中医药大学

<120>分子标志物mk2基因及其应用

<130>

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>49266

<212>dna

<213>人源

<400>1

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100105110

glncysprohisilevalargilevalaspvaltyrgluasnleutyr

115120125

alaglyarglyscysleuleuilevalmetglucysleuaspglygly

130135140

gluleupheserargileglnaspargglyaspglnalaphethrglu

145150155160

argglualasergluilemetlysserileglyglualaileglntyr

165170175

leuhisserileasnilealahisargaspvallysprogluasnleu

180185190

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225230235240

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260265270

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