一种参与紫草素生物合成的AePGT‑6蛋白及其编码基因与应用的制作方法

本发明涉及一种参与紫草素生物合成的aepgt-6蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
：药用植物活性成分通常是植物生长发育和适应环境过程中次生代谢产生的一类小分子有机化合物。活性成分生物合成途径的解析是药用植物次生代谢产物研究的核心内容。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将为诠释药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制，为药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。新疆紫草arnebiaeuchroma(royle)johns是传统中药材紫草arnebiaeradix的重要来源，已被列为野生药材动植物资源三类保护品种。新疆紫草的有效化学成分主要分为两大类，一类是脂溶性的萘醌类化合物，紫草素类化合物；另一类是水溶性成分，主要是多糖类和酚酸类。现代药理学研究发现紫草素类化合物具有抗肿瘤、抗hiv活性、调节免疫、抗生育、抗血栓、镇静、促进伤口愈合等多种临床作用，在医药行业应用广泛。此外，紫草素更是重要的天然染料被国际上称为“天然红色素之王”，具有很高的经济价值。紫草素为萘醌类化合物，在植物体内通过苯丙氨酸(phenylalaninepathway，pp)-甲羟戊酸(mevalonatepathway，mva)/去氧木酮糖磷酸(2-c-methyl-d-erythritol4-phosphate，mep)途径复合途径合成，由一分子对-羟基苯甲酸(4-hydroxybenzoicacid，phba)和一分子焦磷酸香叶酯(geranylpyrophosphate，gpp)结合，形成紫草素的基本骨架——香叶烯基对羟基苯甲酸(3-geranyl-4-hydroxybenzoicacid，gba)，gba为再经过一系列的脱羧、加氧、脱氢生成紫草素。对-羟基苯甲酸香叶烯基转移酶(4-hydroxybenzoategeranyltransferase，pgt)将两个途径联系起来，属于紫草素生物合成过程的特有酶促反应，能够催化gpp和phba结合产生gba。对羟基苯甲酸香叶烯基转移酶(pgt)是紫草细胞中紫草素衍生物生物合成的一个关键而重要的代谢酶，它将甲羟戊酸代谢途径形成的gpp的香叶烯基转移到来自苯丙素类代谢途径的phba上形成香叶烯基对羟基苯甲酸(gba)，最终反应生成紫草素及其衍生物。pgt位于紫草细胞的内质网膜上，增加或减少它的活性直接影响到紫草素的产生，故在紫草素形成的过程中起着重要的作用。在紫草培养细胞中，pgt基因的表达模式与其酶活性变化和紫草素及其衍生物的形成具有高度的一致性，可见pgt基因的表达水平对调控紫草素及其衍生物形成的重要性。技术实现要素：本发明的目的是提供一种参与紫草素生物合成的aepgt-6蛋白及其编码基因与应用。本发明提供了一种蛋白质，获自新疆紫草，命名为aepgt-6蛋白，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。为了使(a1)中的蛋白质便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述(a2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。本发明还保护编码aepgt-6蛋白的基因(aepgt-6基因)。所述aepgt-6基因为如下(b1)-(b3)中任一所述的dna分子：(b1)编码区如序列表中序列2所示的dna分子；(b2)在严格条件下与(b1)限定的dna序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的dna分子；(b3)与(b1)或(b2)限定的dna序列具有90％以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的dna分子。上述严格条件可为用0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液，在dna或者rna杂交实验中65℃下杂交并洗膜。本发明还保护aepgt-6蛋白的应用，为如下(c1)和/或(c2)：(c1)作为对羟基苯甲酸香叶烯基转移酶；(c2)催化对羟基苯甲酸和焦磷酸香叶酯反应产生香叶烯基-对羟基苯甲酸。本发明还保护一种重组菌(重组菌甲)，是将aepgt-6基因导入宿主菌中得到的；所述宿主菌不能生产焦磷酸香叶酯。本发明还保护一种重组菌(重组菌乙)，是将aepgt-6基因导入宿主菌中得到的；所述宿主菌可以生产焦磷酸香叶酯。所述可以生产焦磷酸香叶酯的宿主菌具体可为酿酒酵母k197g。所述aepgt-6基因可通过含有aepgt-6基因的重组表达载体导入宿主菌得到重组菌。可用现有的表达载体构建含有aepgt-6基因的重组表达载体。使用aepgt-6基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子；此外，使用aepgt-6基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。所述重组表达载体具体可为将pesc-his质粒bamhi和apai酶切位点之间的小片段取代为序列表的序列2自5’端第1-924位核苷酸所示的dna分子得到的重组表达载体。本发明还保护一种对羟基苯甲酸香叶烯基转移酶的制备方法，包括如下步骤：培养以上任一所述重组菌，从重组菌中得到对羟基苯甲酸香叶烯基转移酶。所述培养以上任一所述重组菌包括如下步骤：(a1)将重组菌接种至sd-his-ura培养基中培养，得到菌液；(a2)将步骤(a1)培养后的菌液离心收集沉淀；(a3)使用含2％(质量百分比)半乳糖的sd-his-ura培养基重悬步骤(a2)得到的菌体，继续培养。步骤(a1)中，所述培养具体可为30℃、200r.min-1培养。步骤(a1)中，所述菌液od600nm＝0.6。步骤(a2)中，所述离心具体可为3000g离心。步骤(a3)中，所述培养具体可为30℃、200r.min-1培养。步骤(a3)中，所述培养时间具体可为48h。所述培养以上任一所述重组菌还包括完成步骤(a3)后，收集培养体系，离心收集菌体沉淀。所述离心具体可为3000g离心。所述从重组菌中得到对羟基苯甲酸香叶烯基转移酶的方法具体可为从所述菌体沉淀中提取酵母微粒体蛋白，得到对羟基苯甲酸香叶烯基转移酶。所述提取酵母微粒体蛋白具体可采用玻璃珠法。本发明还保护以上任一所述重组菌在制备对羟基苯甲酸香叶烯基转移酶产品中的应用。本发明还保护香叶烯基对羟基苯甲酸的制备方法，为方法甲或方法乙。所述方法甲包括如下步骤：培养所述重组菌甲，同时加入对羟基苯甲酸和焦磷酸香叶酯，从培养产物中分离得到香叶烯基对羟基苯甲酸。所述方法乙包括如下步骤：培养以上任一所述重组菌乙，同时加入对羟基苯甲酸，从培养产物中分离得到香叶烯基-对羟基苯甲酸。方法甲或方法乙中，所述培养具体可为将可以生产焦磷酸香叶酯的重组菌接种至含2％(质量百分比)半乳糖的sd-his-ura培养基中培养。所述培养的培养体系初始od600nm＝0.5。所述培养具体可为30℃、200r.min-1培养。所述培养时间可为36h-72h。所述培养时间具体可为36h。所述培养时间具体可为72h。所述培养时间具体可为48h。方法甲或方法乙中，对羟基苯甲酸的使用浓度为0.05mm-1mm。对羟基苯甲酸的使用浓度具体可为0.05mm。对羟基苯甲酸的使用浓度具体可为0.1mm。对羟基苯甲酸的使用浓度具体可为0.5mm。对羟基苯甲酸的使用浓度具体可为1mm。方法甲或方法乙中，所述从培养产物中分离得到香叶烯基-对羟基苯甲酸具体可通过hplc分离纯化实现。所述从培养产物中分离得到香叶烯基对羟基苯甲酸具体包括如下步骤：(b1)将培养产物采用乙酸乙酯超声提取，收集上清液(有机相)；(b2)将步骤(b1)提取的上清液(有机相)用氮气吹干乙酸乙酯后用甲醇溶解，将溶液产物过滤后通过hplc分离纯化。步骤(b1)中，所述培养产物与乙酸乙酯的体积配比为1∶1。步骤(b2)中，所述过滤为0.22μm微孔滤膜过滤。所述hplc分离纯化的参数如下：色谱柱为watersc181.8μm2.1×100mmt3hhs；流动相由溶液a和b组成；溶液a为乙腈；溶液b为0.1％(体积分数)甲酸水溶液；流速：0.5ml/min；洗脱程序为：0min：10％溶液a；4min：35％溶液a；4.3min：60％溶液a；8min；72％溶液a：8.5min，98％溶液a；10.5min：98％溶液a；11min：10％溶液a；13min：10％溶液a；收集保留时间为5.79min出现的色谱峰对应的洗脱液；柱温40℃；pda检测器全波长扫描。本发明还保护试剂盒甲，所述试剂盒甲包括所述重组菌甲、对羟基苯甲酸和焦磷酸香叶酯。本发明还保护试剂盒乙，所述试剂盒乙包括以上任一所述重组菌乙和对羟基苯甲酸。所述组合物甲或组合物乙还包括sd-his-ura培养基。所述组合物甲或组合物乙的用途为生产香叶烯基-对羟基苯甲酸。以上任一所述sd-his-ura培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在sd-his-ura培养基中的浓度为：无氨基酵母氮源0.67g/100ml、葡萄糖2g/100ml、硫酸亚铁铵0.4g/100ml、琼脂2g/100ml、腺嘌呤20mg/100ml、l-缬氨酸150mg/100ml、l-异亮氨酸30mg/100ml、l-精氨酸20mg/100ml、l-亮氨酸100mg/100ml、l-赖氨酸30mg/100ml、l-甲硫氨酸20mg/100ml、l-苯丙氨酸50mg/100ml、l-苏氨酸200mg/100ml、l-色氨酸20mg/100ml、l-酪氨酸30mg/100ml、l-天冬氨酸10mg/100ml、l-丝氨酸40mg/100ml、l-谷氨酸10mg/100ml。本发明提供的aepgt-6蛋白与紫草素类化合物合成代谢密切相关，能催化对羟基苯甲酸(phba)和焦磷酸香叶酯(gpp)结合形成gba。本发明对于调节生产植物萘醌类化合物和通过生物技术提高新疆紫草中萘醌类活性成分紫草素类的含量具有重要的理论和实际意义。附图说明图1为实施例2中液相色谱检测结果。图2为实施例2中核磁共振氢谱(hnmr)图。图3为实施例2中核磁共振碳谱(cnmr)图。图4为实施例2中hmbc图。图5为实施例2中高分辨质谱图。图6为实施例2中新产物结构式。图7为phba和gpp反应生成gba的反应过程。图8为实施例3中gba产量统计结果图。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。pesc-his质粒：安捷伦科技(中国)有限公司，货号：217451。酿酒酵母k197g：参考文献：fischermj，meyers，claudelp，etal.metabolicengineeringofmonoterpenesynthesisinyeast.[j].biotechnologyandbioengineering，2011，108(8)：1883-92.；酿酒酵母k197g在文献中的名称为“k197g”，公众可以从中国中医科学院中药研究所获得。sd-his-ura培养基：北京泛基诺科技有限公司，货号：ygm003a-13。sd-his-ura培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在sd-his-ura培养基中的浓度为：无氨基酵母氮源0.67g/100ml、葡萄糖2g/100ml、硫酸亚铁铵0.4g/100ml、琼脂2g/100ml、腺嘌呤20mg/100ml、l-缬氨酸150mg/100ml、l-异亮氨酸30mg/100ml、l-精氨酸20mg/100ml、l-亮氨酸100mg/100ml、l-赖氨酸30mg/100ml、l-甲硫氨酸20mg/100ml、l-苯丙氨酸50mg/100ml、l-苏氨酸200mg/100ml、l-色氨酸20mg/100ml、l-酪氨酸30mg/100ml、l-天冬氨酸10mg/100ml、l-丝氨酸40mg/100ml、l-谷氨酸10mg/100ml。无氨基酵母氮源：sigma公司，货号：y0626。phba：上海融禾医药科技发展有限公司，货号：131109。phba的分子式为c7h6o3，cas号为：99-96-7，结构式如下：gpp：美国sigma-aldrich公司，货号：76532-10mg。gpp的分子式为c10h20o7p2，cas号为：21141-43-5，结构式如下：实施例1、aepgt-6蛋白及其编码基因的获得通过对新疆紫草进行大量序列分析、表达量分析与功能验证，发现了一个dna编码序列，如序列表的序列2所示，其编码的蛋白质如序列表的序列1所示。将序列表的序列1所示的蛋白质命名为aepgt-6蛋白，由307个氨基酸残基组成。将编码aepgt-6蛋白的基因命名为aepgt-6基因，其开放阅读框如序列表的序列2自5’末端第1-924位核苷酸所示。实施例2、aepgt-6蛋白功能分析一、重组菌株的构建1、构建重组质粒pesc-aepgt-6。根据测序结果，对重组质粒pesc-aepgt-6进行结构描述如下：以pesc-his质粒为出发载体，将pesc-his质粒bamhi和apai酶切位点之间的小片段取代为序列表的序列2自5’端第1-924位核苷酸所示的dna分子。2、将步骤1制备的重组质粒pesc-aepgt-6转化酿酒酵母k197g，得到重组菌株k197g-aepgt-6；将pesc-his质粒转化酿酒酵母工程菌株k197g，得到重组菌株k197g-pesc-his(转空载体菌株)。二、体外酶促实验待测菌株为：步骤一得到的重组菌株k197g-aepgt-6或重组菌株k197g-pesc-his(转空载体菌株)。1、将待测菌株的单菌落接种于5mlsd-his-ura培养基中，30℃、200r.min-1培养24h；然后取1ml菌液接种至50mlsd-his-ura培养基中，30℃、200r.min-1培养至菌液od600nm＝0.6，3000g离心培养体系，弃上清，用去离子水洗涤菌体沉淀后，使用50ml含2％(质量百分比)半乳糖的sd-his-ura培养基重悬菌体，30℃、200r.min-1培养48h，3000g离心培养体系，弃上清，收集菌体。2、取步骤1得到的菌体，采用玻璃珠法提取酵母微粒体蛋白，依次按照如下步骤操作得到酵母微粒体蛋白溶液：(1)采用5mltek缓冲液(0.1mkcl+te缓冲液)重悬步骤1收集的菌体，室温放置5min，离心收集菌体。(2)用500μl冰浴的tesb缓冲液(0.6m山梨醇+te缓冲液)重悬菌体，得到菌悬液。(3)向菌悬液中小心加入玻璃珠，使其刚好接触菌悬液表面，4℃涡旋震荡30min破碎菌体，加入1ml的tesb缓冲液，回收上清。(4)重复(3)中的tesb清洗3次，合并上清。将回收的上清4℃，12000rpm离心15min，收集上清。(5)向上清中加入2倍体积的沉淀缓冲液(tesb缓冲液+0.225mnacl+0.15g/mlpeg4000)，冰浴15min，4℃，12000rpm离心15min，弃上清收集沉淀。(6)采用400μlteg缓冲液(te缓冲液+20％甘油)溶解沉淀。3、将步骤2得到的酵母微粒体蛋白溶液进行蛋白定量，蛋白浓度为20mg/ml。4、取步骤3定量后的酵母微粒体蛋白溶液，进行体外酶促反应，得到反应产物。反应体系为：微粒体蛋白溶液(蛋白含量为500μg)，tris-hcl(ph7.8)50mm，phba200nmol，gpp100nmol，mgcl210μmol，补充蒸馏水至250μl。反应条件为：30℃、150rpm反应1h。反应结束后加入1μl甲酸终止反应。5、采用高效液相色谱检测步骤4得到的反应产物，向反应产物中加入250μl乙酸乙酯，涡旋1min，室温下10000g离心2min，小心的吸取上清(有机相)，n2吹干，加入250μl甲醇溶解，0.22微孔滤膜过滤，用于检测；hplc检测采用watersacquity-uplc-pda系统。检测参数如下：色谱柱：watersc181.8μm2.1×100mmt3hhs；洗脱液：洗脱液由a液(50％)和b液(50％)组成，a液为乙腈，b液为0.1％(体积分数)甲酸水溶液。流速：0.5ml/min；柱温40℃；pda检测器全波长扫描。结果如图1所示。图1中，横坐标为时间(min)，纵坐标为紫外吸光度。图1结果表明，与转空载体菌株相比，重组菌株k197g-aepgt-6的体外酶促反应产物中出现了新产物。收集新产物对应的洗脱峰，通过核磁和质谱进一步验证产物表征。核磁共振氢谱(hnmr)图见图2。核磁共振碳谱(cnmr)图见图3。hmbc图见图4，高分辨质谱图见图5。核磁1h-nmr，13c-nmr表征结果分析见表2。表2核磁1h-nmr，13c-nmr表征结果分析分析结果表明：phba和gpp在aepgt-6的催化下，生成了分子量为274.16(m/z)的新产物，认为该产物(结构式见图6)为gba，phba和gpp反应生成gba的反应过程见图7。将gba产物经高效液相进行纯度检测，纯度在98％以上。实施例3、重组菌k197g-aepgt-6发酵生产gba及其产量分析1、将实施例2制备的重组菌株k197g-aepgt-6接种于10ml含有不同浓度phba(0mm、0.05mm、0.1mm、0.5mm、1mm)的含2％(质量百分比)半乳糖的sd-his-ura培养基中(初始菌液od600nm＝0.5)，30℃、200r.min-1培养不同时间(36h、72h)，得到菌液。2、取5ml步骤1得到的菌液，加入5ml乙酸乙酯，超声提取2h，离心收集上清有机相，保留下层菌液。3、取步骤2的下层菌液中再次加入等体积乙酸乙酯，超声提取2h，离心收集上清有机相。4、合并步骤2和步骤3得到的上清有机相，用氮气吹干乙酸乙酯，得到混合物。5、用1.5ml甲醇溶解步骤4得到的混合物，0.22μm微孔滤膜过滤，用于uplc含量检测。hplc检测采用watersacquity-uplc-pda系统。检测参数如下：色谱柱：watersc181.8μm2.1×100mmt3hhs；洗脱液由溶液a和溶液b组成：溶液a为乙腈，溶液b为0.1％(体积分数)甲酸水溶液。流速：0.5ml/min；采用梯度洗脱的方式：0min：10％溶液a；4min：35％溶液a；4.3min：60％溶液a；8min；72％溶液a：8.5min，98％溶液a；10.5min：98％溶液a；11min：10％溶液a；13min：10％溶液a。柱温40℃；pda检测器全波长扫描。采用实施例2纯化后的gba产物(纯度在98％以上)作为标准品。标准品的出峰时间为5.79min，收集在相同时间出峰的gba产物。根据检测结果计算gba的产量。结果如图8所示。图8中，1-5为培养36h的发酵产物检测结果，6-10为72h的发酵产物检测结果。1-5依次为培养基中的phba浓度为0mm、0.05mm、0.1mm、0.5mm、1mm的发酵产物检测结果，6-10依次为培养基中的phba浓度为0mm、0.05mm、0.1mm、0.5mm、1mm的发酵产物检测结果。结果表明，gba的产量随phba的浓度增加而增加，在含有1mmphba的培养基中，诱导72h，gba的产量可以达到71.69mg/l培养体系。实施例4、同源重组菌株对照实验1、构建重组质粒pesc-aepgt。根据测序结果，对重组质粒pesc-aepgt进行结构描述如下：以pesc-his质粒为出发载体，将pesc-his质粒bamhi和apai酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列4自5’端第1-921位核苷酸所示的dna分子。所述序列4编码序列3所示的蛋白质(序列3所示的蛋白质为aepgt-6蛋白的同源蛋白)。2、将步骤1制备的重组质粒pesc-aepgt转化酿酒酵母k197g，得到重组菌株k197g-aepgt。3、取实施例2构建的重组菌株k197g-aepgt-6和步骤2制备的重组菌株k197g-aepgt，进行如下操作：(1)将重组菌株接种于10ml含有1mmphba的含2％(质量百分比)半乳糖的sd-his-ura培养基中(初始菌液od600nm＝0.5)，30℃、200r.min-1培养48h，得到菌液。(2)取5ml步骤(1)得到的菌液，加入5ml乙酸乙酯，超声提取2h，离心收集上清有机相。(3)取步骤(2)得到的上清有机相，加入等体积乙酸乙酯，超声提取2h，离心收集上清有机相。(4)取步骤(3)得到的上清有机相，用氮气吹干乙酸乙酯，得到混合物。(5)用1.5ml甲醇溶解步骤4得到的混合物，0.22μm微孔滤膜过滤，用于uplc含量检测。hplc检测参数和方法与实施例3步骤5相同。采用实施例2纯化后的gba产物(纯度在98％以上)作为标准品。根据检测结果计算gba的产量。经过计算，重组菌株k197g-aepgt-6的发酵产物gba产量为70.96mg/l，重组菌株k197g-aepgt的发酵产物gba产量为20.86mg/l。<110>中国中医科学院中药研究所<120>一种参与紫草生物合成的aepgt-6蛋白及其编码基因与应用<160>4<210>1<211>307<212>prt<213>紫草（arnebiaeuchroma）<400>1metthrtyrlysglnserleulyslysglnasnlysargprosertrp151015ileaspthrasnleuproilethrpheglnprotyralahisleuala202530argleuasplysproileglysertrpleuleualatrpproalaphe354045trpservalalaleualaalaaspaspleuglyserleuprolysmet505560leualailepheglytrptrpalailetrpileargglyalaglycys65707580thrileasnasptyrpheaspargasppheasplyslysvalgluarg859095thrlysserargproleualaserglyalaleuserproalaglngly100105110leutrptrpleualaileglnleuphemetglyleuglyvalleutyr115120125glnleuasnmetleuthrleuvalleualaileleuhisvalproleu130135140valphealatyrproleumetlysargilethrtyrtrpproglnala145150155160pheleuglyvalmetilesertrpglyalaleuleuglyproalaala165170175leugluglythrileaspprolysilealacysproleutyrvalser180185190serphephetrpthrleuvaltyraspthriletyralahisglnasp195200205lysgluaspaspalalysalaglyilelysserthrthrleuargphe210215220glyaspleuthrlysvaltrpvalglyglypheglyvalalacysthr2252302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