变异葡萄糖脱氢酶及其使用的制作方法
本发明涉及底物特异性提高的变异葡萄糖脱氢酶(gdh)。详细地讲，本发明涉及包含变异型α亚单位的gdh。本发明的gdh可以适当地用于葡萄糖传感器及葡萄糖检测试剂盒等，在生物化学领域、临床领域等中有用。
背景技术：
目前，将野生型的含细胞色素c的gdh(cygdh)及以吡咯并喹啉苯醌作为辅酶的pqqgdh用于血糖自测传感器。然而，野生型的cygdh及pqqgdh有以下缺点：由于其不仅与葡萄糖反应而且还与麦芽糖反应，因此不能测定准确的血糖值。
专利文献1中虽然公开了对二糖类的反应性低、且在α亚单位的326位、365位以及472位具有变异的变异gdh，但显示反应性低的仅仅是针对麦芽糖，并没有公开对木糖以及半乳糖的反应性低的变异gdh。
在先技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2012-090563号公报。
技术实现要素：
发明要解决的技术问题
本发明的课题在于，提供一种对木糖、优选木糖以及半乳糖的反应性低、且对葡萄糖的底物特异性提高的gdh。
用于解决技术问题的手段
本发明人为了解决如上所述的课题而进行了潜心研究，结果发现，通过在依次包含下面叙述的肽序列(i)～(v)的520～550个氨基酸的gdhα亚单位的氨基酸序列中、以其他氨基酸取代肽序列(iii)的10位的甘氨酸、肽序列(iv)的4位的组氨酸、以及肽序列(v)的4位的天冬酰胺中的一个以上，会降低对木糖以及半乳糖的反应性，并提高对葡萄糖的底物特异性，而且，根据该发现，成功地得到葡萄糖传感器等中有用的变异gdh，从而完成了本发明。
即，本发明为以下的内容。
(1)一种变异gdh，其包含变异葡萄糖脱氢酶α亚单位，所述变异葡萄糖脱氢酶α亚单位具有在依次包含下面的肽序列(i)～(v)的520～550氨基酸的葡萄糖脱氢酶α亚单位的氨基酸序列中、以其他氨基酸取代肽序列(iii)的10位的甘氨酸、肽序列(iv)的4位的组氨酸、以及肽序列(v)的4位的天冬酰胺的一个以上的氨基酸序列，其中，所述变异葡萄糖脱氢酶具有葡萄糖脱氢酶活性，对木糖的反应性降低。
(i)val/ileval/ileval/ileglyserglyvalalagly(序列号21)
(ii)cyscysglyasnasnasncysmetproilecys(序列号22)
(iii)valglyargasnleumetasphisproglythrgly(序列号23)
(iv)lyslysile/leuhisleuserasn(序列号24)
(v)phealapro/asnasnasnhisile(序列号25)
(2)根据(1)所述的变异gdh，其中，与从肽序列(ii)的8位的met、肽序列(iii)的12位的gly、肽序列(iv)的6位的ser、肽序列(v)的2位的ala、肽序列(v)的3位的pro/asn、肽序列(v)的5位的asn以及肽序列(v)的7位的ile中选择的至少一个氨基酸残基相当的氨基酸残基还被其他氨基酸残基取代。
(3)根据(1)或(2)所述的变异gdh，其特征在于，还对半乳糖的反应性降低。
(4)根据(1)至(3)中任一者所述的变异gdh，其中，所述变异gdhα亚单位包含和序列号3至少有60％的同一性的氨基酸序列。
(5)根据(1)至(3)中任一者所述的变异gdh，其中，所述变异gdhα亚单位包含和序列号3(sm4)、序列号4(yp_002234347)、序列号5(zp_02370914)、序列号6(zp_02007109)、序列号7(yp_002260434)或者序列号8(yp_001890482)至少有80％的同一性的氨基酸序列。
(6)根据(1)至(4)中任一者所述的变异gdh，其中，所述变异gdhα亚单位具有序列号3(sm4)、序列号4(yp_002234347)、序列号5(zp_02370914)、序列号6(zp_02007109)、序列号7(yp_002260434)或者序列号8(yp_001890482)中取代、缺失、插入或者添加了的一个或者多个氨基酸的氨基酸序列。
(7)一种变异gdh，其包含具有和序列号3至少有60％的同一性的氨基酸序列、且具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质，其特征在于，在所述氨基酸序列中，与序列号3的474位的天冬酰胺相当的氨基酸残基被丝氨酸取代，与序列号3的322位的甘氨酸相当的氨基酸残基被谷氨酰胺取代，与序列号3的363位的组氨酸相当的氨基酸残基被谷氨酰胺或者丝氨酸取代，并且，与序列号3的475位的天冬酰胺相当的氨基酸残基被丝氨酸取代，并且，所述变异葡萄糖脱氢酶对木糖的反应性降低。
(8)根据(1)至(3)中任一者所述的变异gdh，其中，所述变异葡萄糖脱氢酶还包含电子传递亚单位。
(9)根据(8)所述的变异gdh，其特征在于，电子传递亚单位是细胞色素c。
(10)一种dna，其编码(1)至(9)中任一者所述的变异gdh。
(11)一种重组载体，其包含(10)所述的dna。
(12)一种微生物，其由(11)所述的重组载体转化。
(13)一种葡萄糖检测试剂盒，其包含(1)至(9)中任一者所述的变异gdh。
(14)一种葡萄糖传感器，其包含(1)至(9)中任一者所述的变异gdh。
发明效果
根据本发明，提供一种对葡萄糖的特异性提高了的gdh，并适当地用于葡萄糖传感器等的用途中。
附图说明
图1-1是示出gdh的序列比对的图～之一；
图1-2是示出gdh的序列比对的图～之一(续)；
图1-3是示出gdh的序列比对的图～之一(续)；
图1-4是示出gdh的序列比对的图～之一(续)；
图1-5是示出gdh的序列比对的图～之一(续)；
图1-6是示出gdh的序列比对的图～之一(续)；
图1-7是示出gdh的序列比对的图～之一(续)；
图1-8是示出gdh的序列比对的图～之一(续)；
图1-9是示出gdh的序列比对的图～之一(续)；
图1-10是示出gdh的序列比对的图～之一(续)；
图2-1是示出gdh的序列比对的图～之二；
图2-2是示出gdh的序列比对的图～之二(续)；
图2-3是示出gdh的序列比对的图～之二(续)；
图2-4是示出gdh的序列比对的图～之二(续)；
图2-5是示出gdh的序列比对的图～之二(续)；
图2-6是示出gdh的序列比对的图～之二(续)；
图2-7是示出gdh的序列比对的图～之二(续)；
图2-8是示出gdh的序列比对的图～之二(续)；
图2-9是示出gdh的序列比对的图～之二(续)；
图2-10是示出gdh的序列比对的图～之二(续)；
图3-1是示出gdh的序列比对的图～之三；
图3-2是示出gdh的序列比对的图～之三(续)；
图3-3是示出gdh的序列比对的图～之三(续)；
图3-4是示出gdh的序列比对的图～之三(续)；
图3-5是示出gdh的序列比对的图～之三(续)；
图3-6是示出gdh的序列比对的图～之三(续)；
图3-7是示出gdh的序列比对的图～之三(续)；
图3-8是示出gdh的序列比对的图～之三(续)；
图3-9是示出gdh的序列比对的图～之三(续)；
图3-10是示出gdh的序列比对的图～之三(续)。
具体实施方式
下面，详细地说明本发明。
本发明的变异gdh的特征在于，其包含变异gdhα亚单位，上述变异gdhα亚单位具有在依次包含下面的肽序列(i)～(v)的520～550氨基酸的gdhα亚单位的氨基酸序列中、以其他氨基酸取代肽序列(iii)的10位的甘氨酸、肽序列(iv)的4位的组氨酸、以及肽序列(v)的4位的天冬酰胺中的一个以上的氨基酸序列，其中，上述变异gdh具有gdh活性，对木糖的反应性降低。
(i)val/ileval/ileval/ileglyserglyvalalagly序列号21
(ii)cyscysglyasnasnasncysmetproilecys序列号22
(iii)valglyargasnleumetasphisproglythrgly序列号23
(iv)lyslysile/leuhisleuserasn序列号24
(v)phealapro/asnasnasnhisile序列号25
如图1～3所示，上面所述的肽序列(i)～(v)是被保存在各种gdhα亚单位蛋白质之间、且对gdh活性重要的区域。
图1的各序列为如下。
sequence3序列号3(cygdh)
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yp_002234347putativeoxidoreductase[burkholderiacenocepaciaj2315](序列号7)
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图2的各序列为如下：
sequence3序列号3(cygdh)
wp_038789867.1multispecies：cholinedehydrogenase[pseudomalleigroup]
wp_041198446.1cholinedehydrogenase[burkholderiapseudomallei]
kgt02773.1faddependentoxidoreductasefamilyprotein[burkholderiapseudomallei]
wp_015602981.1fad-bindingprotein[burkholderiathailandensis]
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wp_004629448.1multispecies：cholinedehydrogenase[ralstonia]
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zp_02007109faddependentoxidoreductase[ralstoniapickettii12d](序列号9)
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[ralstoniasolanacearumpsi07]
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yp_002260434transmembranedehydrogenase(1argesubunit)protein[ralstoniasolanaceammipo1609](序列号10)
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cfb68626.12-keto-d-gluconatedehydrogenasemembrane-boundnavoprotein[yersiniaenterocolitica]
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cfr23261.12-keto-d-gluconatedehydrogenasemembrane-boundflavoprotein[yersiniakristensenii]
图3的各序列为如下。
sequence3序列号3(cygdh)
wp_013650283.1cholinedehydrogenase[yersiniaenterocolitica]
cqj52766.12-keto-d-gluconatedehydrogenasemembrane-boundflavoprotein[yersiniaenterocolitica]
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ccv62586.1hypotheticalproteinye3094_31131[yersiniaenterocolitica(typeo：2)str.ye3094/96]
wp_005172530.1cholinedehydrogenase[yersiniaenterocolitica]
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wp_008921043.1cholinedehydrogenase[burkholderiasp.h160]
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yp_001890482glucose-methanol-cholineoxidoreductase[burkholderiaphytofirmans
因此，在本发明中，关于在引入使对木糖的反应性降低的变异之前的gdhα亚单位的序列，只要具有这些肽序列(i)～(v)的序列、全长氨基酸为520～550(优选525～544)且gdh活性被维持，就没有特别限制。
在本发明中，在引入使对木糖的反应性降低的变异之前的gdhα亚单位的序列优选和序列号3有60％以上的同一性。
序列号3是洋葱伯克霍尔德菌(burkholderiacepacia)ks1株保持的gdhα亚单位的氨基酸序列。ks1株在平成12年9月25日以保藏号码为第fermbp-7306保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(
作为和序列号3有60％以上同一性的gdhα亚单位的氨基酸序列，例示洋葱伯克霍尔德菌j2315株的putativeoxidoreductase(序列号7)、泰国伯克菌(burkholderiathailandensis)txdoh株的hypotheticalproteinbthat#07876(序列号8)、皮氏罗尔斯顿氏菌(ralstoniapickettii)12d株的faddependentoxidoreductase(序列号9)、茄科雷尔氏菌(ralstoniasolanacearum)ipo1609株的transmembranedehydrogenase(序列号10)以及伯克霍尔德氏菌(burkholderiaphytofirmans)psjn株的glucose-methanol-cholineoxidoreductase(序列号11)的各自的α亚单位。
此外，关于序列号7～11所示的氨基酸序列，均在美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation，ncbi)的数据库中登录。各自的登录号码分别为：序列号7为yp_002234347、序列号8为zp_02370914、序列号9为yp_002980762、序列号10为yp_002260434、序列号11为yp_001890482。
另外，洋葱伯克霍尔德菌j2315株以lmg16656、atccbaa-245、ccm4899、ccug48434、nctc13227保藏。伯克霍尔德氏菌psjn株以lmg22487、ccug49060保藏。
另外，作为和序列号3有60％以上同一性的gdhα亚单位，也可以举出以下：作为和洋葱伯克霍尔德菌ks1株同属的洋葱伯克霍尔德菌株，来自例如jcm2800、jcm2801、jcm5506、jcm5507、ifo14595的各gdh的α亚单位(序列号12～16)。此外，jcm2800、jcm2801、jcm5506及jcm5507保存于日本独立行政法人理化学研究所微生物菌种保藏中心(japancollectionofmicroorganisms，jcm)。ifo14595保存于日本财团法人发酵研究所(ifo)。
此外，序列号3示出的氨基酸序列相对于序列号7～11分别有96％、93％、82％、82％、63％的氨基酸序列同一性。
在图1～3中，关于含有这些的149个gdhα亚单位的序列，与序列号3进行序列比对。图1～3所示的各种gdhα亚单位的序列中的、具有和序列号3有最低同一性的是yp_001890482，yp_001890482和序列号3有63％同一性。如上所述，已知有多个gdhα亚单位，均和序列号3有60％以上的同一性，并被保存在如上所述的区域。因此，通过在依次包含肽序列(i)～(v)的520～550个氨基酸的gdhα亚单位的氨基酸序列、优选依次包含肽序列(i)～(v)、且和序列号3有60％以上(优选63％以上)的同一性的520～550个氨基酸的氨基酸序列中、以其他氨基酸取代肽序列(iii)的10位的甘氨酸、肽序列(iv)的4位的组氨酸、以及肽序列(v)的4位的天冬酰胺中的一个以上，能够获得包含本发明的变异gdhα亚单位的变异gdh。
取代肽序列(iii)的10位的甘氨酸的氨基酸可以是甘氨酸以外的任何氨基酸，优选谷氨酰胺、组氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、天冬酰胺酸、半胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸，特别优选谷氨酰胺。
取代肽序列(iv)的4位的组氨酸的氨基酸可以是组氨酸以外的任何氨基酸，优选谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、丝氨酸，特别优选谷氨酰胺。
取代肽序列(v)的4位的天冬酰胺的氨基酸可以是天冬酰胺以外的任何氨基酸，优选丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺酸、天冬酰胺酸，特别优选丝氨酸。
本发明的变异gdhα亚单位只要具有这些三个变异中的任何一个即可，但优选具有两个以上，特别优选三个。
优选肽序列(iii)的10位的甘氨酸的取代和肽序列(v)的4位的天冬酰胺的取代的组合，更优选肽序列(iii)的10位的甘氨酸的取代、肽序列(v)的4位的天冬酰胺的取代、以及肽序列(iv)的4位的组氨酸的取代的组合。
肽序列(iii)的10位的甘氨酸在序列号3中对应于322位的甘氨酸，在序列号7中对应于322位的甘氨酸，在序列号8中对应于320位的甘氨酸，在序列号9中对应于323位的甘氨酸，在序列号10中对应于323位的甘氨酸，在序列号11中对对应于318位的甘氨酸。
肽序列(iv)的4位的组氨酸在序列号3中对应于363位的组氨酸，在序列号7中对应于363位的组氨酸，在序列号8中对应于361位的组氨酸，在序列号9中对应于364位的组氨酸，在序列号10中对应于364位的组氨酸，在序列号11中对应于359位的组氨酸。
肽序列(v)的4位的天冬酰胺在序列号3中对应于474位的天冬酰胺，在序列号7中对应于474位的天冬酰胺，在序列号8中对应于472位的天冬酰胺，在序列号9中对应于475位的天冬酰胺，在序列号10中对应于475位的天冬酰胺，在序列号11中对应于468位的天冬酰胺。
此外，如上所述的氨基酸取代变异的位置是序列号3、7、8、9、10、11中的位置，但是在序列号3、7、8、9、10、11的氨基酸序列中除上述特定的变异以外还具有取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的gdhα亚单位的同源物或变体中，在和原氨基酸序列的比对中，表示与上述氨基酸取代的位置相当的位置。例如，在1～321位的区域中具有1个氨基酸残基缺失的gdhα亚单位的保守变体中，322位表示所述变体的321位。
作为本发明的变异型α亚单位的例子，除了所述特定的变异以外，可以举出具有序列号3、7～11所示的氨基酸序列的蛋白质。另外，对于变异型α亚单位而言，只要具有gdh活性、且相对于木糖的反应性降低，也可以是具有如下氨基酸序列的蛋白质：所述氨基酸序列为序列号3、7～11的氨基酸序列中，除了具有如上所述的特定的变异之外，还取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸残基。所述“一个或多个”例如为1～20个、优选为1～10个、更优选为1～5个、特别优选为1～3个。另外，如上所述的取代优选为保守的取代，“保存的取代”是指酸性氨基酸之间的取代、中性氨基酸之间的取代、碱基性氨基酸之间的取代等性质相似的氨基酸之间的取代。
此外，本发明的变异型α亚单位优选为相对于序列号3、7～11中的任一个氨基酸序列而言，具有至少80％、优选85％、更优选90％的氨基酸同一性的蛋白质。
本发明的变异型α亚单位除了如上所述的变异之外，还可以以其他氨基酸残基取代相当于选自肽序列(ii)的8位的蛋氨酸、肽序列(iii)的12位的甘氨酸、肽序列(iv)的6位的丝氨酸、肽序列(v)的2位的丙氨酸、肽序列(v)的3位的脯氨酸或者天冬酰胺、肽序列(v)的5位的天冬酰胺以及肽序列(v)的7位的异亮氨酸中的至少一个氨基酸残基的氨基酸残基。
这些氨基酸对应于序列号3中的下面的位置。
肽序列(ii)的8位的蛋氨酸…序列号3的219位的蛋氨酸肽序列(iii)的12位的甘氨酸…序列号3的324位的甘氨酸肽序列(iv)的6位的丝氨酸…序列号3的365位的丝氨酸肽序列(v)的2位的丙氨酸…序列号3的472位的丙氨酸肽序列(v)的3位的脯氨酸或者天冬酰胺…序列号3的473位的脯氨酸肽序列(v)的5位的天冬酰胺…序列号3的475位的天冬酰胺肽序列(v)的7位的异亮氨酸…序列号3的477位的异亮氨酸
除此之外，可以取代相当于序列号3的59位的蛋氨酸、序列号3的61位的苯丙氨酸、序列号3的326位的丝氨酸、序列号3的341位的谷氨酰胺酸、序列号3的367位的亮氨酸、序列号3的369位的精氨酸、序列号3的400位的酪氨酸、序列号3的402位的谷氨酰胺、序列号3的404位的天冬酰胺酸的氨基酸的一个以上。
下面，示出优选的变异体的例子。
g322q-h363q-n474s-n475s
g322q-h363q-s365a-n474s-n475s
g322q-h363q-s365g-n474s-n475s
g322q-h363s-s365n-n474s-n475s
g322q-h324q-n474s-n475s
g322q-h324s-n474s-n475s
g322q-d404e-n474s-n475s
g322q-a472m-n474s-n475s
这些变异点表示序列号3中的位置，例如，g322q-h363q-n474s-n475s是序列号3中的、322位的甘氨酸被谷氨酰胺取代、363位的组氨酸被谷氨酰胺取代、474位的天冬酰胺被丝氨酸取代、475位的天冬酰胺被丝氨酸取代的变异体，也可以在序列号3中的除了这些以外的氨基酸中引入变异，当然，在序列号7～11等的其他gdh的序列中的相同位置引入变异的也被包含在本发明的变异gdh。
例如，下面所示的变异体被包含在本发明的变异体。
一种变异gdh，其包含具有和序列号3至少有60％的同一性的氨基酸序列、且具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质，其特征在于，相当于序列号3的474位的天冬酰胺的氨基酸残基被丝氨酸取代，相当于序列号3的322位的甘氨酸的氨基酸残基被谷氨酰胺取代，并且相当于序列号3的475位的天冬酰胺的氨基酸残基被丝氨酸取代，并且，对木糖的反应性降低。
一种变异gdh，其是包含具有和序列号3至少有60％的同一性的氨基酸序列、且具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质，其特征在于，与序列号3的474位的天冬酰胺相当的氨基酸残基被丝氨酸取代，与序列号3的322位的甘氨酸相当的氨基酸残基被谷氨酰胺取代，与序列号3的363位的组氨酸相当的氨基酸残基被谷氨酰胺或者丝氨酸取代，并且与序列号3的475位的天冬酰胺相当的氨基酸残基被丝氨酸取代，并且，对木糖的反应性降低。
本发明的变异gdh通过具有如上所述的特定的变异，来降低对木糖的反应性。例如，对木糖的反应性是野生型gdh的50％以下、优选为20％以下、更优选为10％以下。
此外，在与对葡萄糖的反应性相比，对木糖的反应性相对低的情况也被包含在“对木糖的反应性降低”中。例如，如下所述的底物特异性(xyl/glc)对应于比野生型gdh低的情况。例如，底物特异性(xyl/glc)是野生型gdh的50％以下、优选为20％以下、更优选为10％以下。底物特异性＝(对木糖的比活性/对葡萄糖的比活性)×100。
本发明的变异gdh由于具有如上所述的特定的变异，不仅对木糖的反应性比野生型gdh低，对半乳糖的反应性也比野生型gdh低。例如，对半乳糖的反应性与野生型gdh相比，例如为50％以下、优选为20％以下、更优选为10％以下。
此外，在与对葡萄糖的反应性相比，对半乳糖的反应性相对低的情况也包含在“对半乳糖的反应性降低”中。例如，如下所述的底物特异性(gal/glc)对应于比野生型gdh低的情况。例如，底物特异性(gal/glc)是野生型gdh的50％以下、优选为20％以下、更优选为10％以下。
底物特异性＝(对半乳糖的比活性/对葡萄糖的比活性)×100)
本发明的变异gdh可以仅仅是α亚单位，可以是包括α亚单位及β亚单位的复合体、α亚单位及γ亚单位的复合体、或者α亚单位、β亚单位及γ亚单位的复合体。
序列号1示出包含洋葱伯克霍尔德菌ks1株的gdhα亚单位基因、以及β亚单位基因的一部分的染色体dna片段的碱基序列(美国专利申请公开第2004/0023330号)。该碱基序列中存在3个开放阅读框(orf)，从5′末端侧开始第2个及第3个orf分别编码α亚单位(序列号3)及β亚单位(序列号4)。另外，第1个orf编码γ亚单位(序列号2)。另外，序列号5示出含有β亚单位基因全长的片段的碱基序列。而且，序列号6示出β亚单位的氨基酸序列(欧洲专利申请公开第1498484号)。序列号6中的氨基酸编号1～22为信号肽。
在本发明的变异gdh包含β亚单位的情况下，关于β亚单位，只要作为β亚单位而起作用即可，没有特别的限制，可以使用包括公知的在内的、来自各种生物的β亚单位，具体而言，例如，可以使用具有来自洋葱伯克霍尔德菌ks1株的序列号6的氨基酸编号23～425的氨基酸序列的蛋白质。但是，只要可以作为cygdh的β亚单位起作用，也可以是具有序列号6的氨基酸号码23～425的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的蛋白质。另外，只要可以作为cygdh的β亚单位起作用，也可以是具有ks1株以外的β亚单位及该β亚单位的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的蛋白质。所述“一个或多个”优选为1～20个、更优选为1～10个、特别优选为1～5个。此外，作为cygdh的β亚单位起作用是指，当和α亚单位一起形成复合体时，不损害该复合体的gdh活性而作为电子传递亚单位、即细胞色素c而起作用。
在本发明的变异gdh包含γ亚单位的情况下，关于γ亚单位，只要作为γ亚单位而起作用即可，没有特别的限制，可以使用包含公知的在内、来自各种生物的γ亚单位，具体而言，例如，可以使用来自洋葱伯克霍尔德菌ks1株的序列号2的氨基酸序列的蛋白质。但是，只要可以作为γ亚单位起作用，也可以是具有由序列号2构成的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的蛋白质。另外，只要可以作为γ亚单位起作用，也可以是具有ks1株以外的γ亚单位的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的蛋白质。所述“一个或多个”优选为1～20个、更优选为1～10个、特别优选为1～5个。此外，作为γ亚单位起作用是指，当和α亚单位一起形成复合体时，提高该复合体的gdh活性的作用。
作为编码本发明的变异gdh的α亚单位的基因，只要具有与变异gdhα亚单位的氨基酸序列对应的碱基序列即可，但作为具体例，可以举出包含在由序列号1的碱基号764～2380构成的碱基序列中具有与如上所述的氨基酸取代对应的密码子取代的碱基序列的dna。另外，α亚单位基因可以是具有包含序列号1的碱基序列的碱基号764～2380的碱基序列的dna，或者可以是在严谨条件下与可由该序列制备的探针杂交、并且编码具有gdh活性的蛋白质的dna。
作为β亚单位基因的具体例，可以举出包含包括序列号5的碱基号187～1398的碱基序列的dna。另外，β亚单位基因可以是具有包括序列号5的碱基号187～1398的碱基序列的dna，或者可以是在严谨条件下与可由该序列制备的探针杂交、并且编码可作为β亚单位而起作用的蛋白质的dna。
作为γ亚单位基因的具体例，可以举出包含包括序列号1的碱基号258～761的碱基序列的dna。另外，γ亚单位基因可以是具有包括序列号1的碱基号258～761的碱基序列的dna、或者可以是在严谨条件下与可由该序列制备的探针杂交、并且编码可作为γ亚单位而起作用的蛋白质的dna。
作为所述严谨条件，可以举出优选具有80％、更优选具有90％以上、特别优选具有95％以上的同一性的dna之间杂交的条件，具体而言，在0.1×ssc、0.1％sds、60℃下洗涤的条件。
α亚单位基因、β亚单位基因及γ亚单位基因例如可以通过以洋葱伯克霍尔德菌ks1株的染色体dna为模板的pcr来获取。pcr用引物可以通过基于上述的碱基序列而进行的化学合成来制备。另外，还可以通过将基于所述序列而制作的寡核苷酸作为探针的杂交，能够从洋葱伯克霍尔德菌ks1株的染色体dna获取。此外，也可以使用ks1株以外的新洋葱伯克霍尔德菌j2315株、泰国伯克菌txdoh株、皮氏罗尔斯顿氏菌12d株、茄科雷尔氏菌ipo1609株及伯克霍尔德氏菌psjn株。
具有期望的变异的gdhα亚单位可通过如下方法来获取，利用位点特异性变异法，在编码gdhα亚单位的dna(α亚单位基因)上，引入对应于期望的氨基酸变异的核苷酸变异，将获得的变异dna用适当的表达体系来表达。另外，通过将编码变异gdhα亚单位的dna、与编码β亚单位的dna(β亚单位基因)或β亚单位基因和编码γ亚单位的dna(γ亚单位基因)一起表达，可以获得变异cygdh复合体。此外，关于向编码gdhα亚单位的dna引入变异，也可以使用依次编码γ亚单位、α亚单位及β亚单位的多顺反子dna片段。
关于依次编码γ亚单位、α亚单位及β亚单位的多顺反子dna片段，例如能够通过以洋葱伯克霍尔德菌ks1株的染色体dna为模板、且将具有序列号19、20的碱基序列的寡核苷酸作为引物的pcr来获取。
作为gdh的各亚单位的基因的获取、变异的引入、基因的表达等的载体，可以举出例如通过escherichia属细菌起作用的载体，具体地ptrc99a、pbr322、puc18、puc118、puc19、puc119、pacyc184、pbbr122等。作为用于基因表达的启动子，例如可以举出lac、trp、tac、trc、pl、tet、phoa等。另外，通过在包含启动子的表达载体的适当位点插入α亚单位基因或其他亚单位基因，能够在相同步骤中进行向这些基因的载体的插入和启动子的连接。作为这样的表达载体，可以举出ptrc99a、pblucscript、pkk223-3等。
另外，α亚单位基因或其他亚单位基因可以以能够表达的方式整合进宿主微生物的染色体dna中。
在使用重组载体转化微生物时，例如可以举出利用钙处理的感受态细胞法、原生质粒法或电穿孔法等。
作为宿主微生物，可以举出枯草芽孢杆菌等芽孢杆菌属细菌、酿酒酵母等酵母、黑曲霉等丝状真菌，但并不限于这些，只要是适合生产异源蛋白质的宿主微生物就可以使用。
例如通过实施例中所记载的方法来调查对各种糖类的反应性，并与包含野生型α亚单位的gdh的反应性进行比较，由此能够决定对包含变异型α亚单位的gdh的糖类的底物特异性。
包含本发明的变异α亚单位的gdh或者对其进行表达的微生物，可以作为葡萄糖传感器的酶电极的构成要素来使用。作为葡萄糖传感器，可以举出将酶电极作为工作电极而使用的葡萄糖传感器，其中，在酶电极中，包含本发明的变异α亚单位的gdh被固定在金电极、铂电极、碳电极等的电极表面上。传感器是指电化学测定作为目标的待测物质的浓度的测定系统，通常包含工作电极(酶电极)、对极(铂等)、以及参照极(ag/agcl等)的三个电极。或者，也可以是如在惯用的简易血糖值系统中使用的、由工作电极以及对极构成的两个电极系统。传感器还优选包括放入缓冲液以及待测试样的恒温小室、向工作电极施加电压的电源、电流表、记录仪等。传感器可以是间歇式，也可以是流式。尤其作为流式的传感器，可以是能够连续性测量血糖值的传感器。即，可以是在被连续性供给的血液试样或该透析试样、或者血液中或细胞间液中插入固定了本发明的酶的两个电极系统或者三个电极系统并进行测量的传感器。这样的酶传感器的结构在该技术领域中已被所知，例如记载在biosensors-fundamentalandapplications-anthonyp.f.turner，isaokarubeandgeroges.wilson，oxforduniversitypress1987。
使用本发明的葡萄糖传感器的葡萄糖的浓度的测定能够通过下面的方式进行。将缓冲液添加到传感器的恒温小室，并维持一定温度。作为作用电极，使用固定了本发明的变异gdh的酶电极，作为对极，例如使用铂电极，作为参照电极，例如使用ag/agcl电极。向工作电极施加一定的电压，在电流变得稳定之后，将含有葡萄糖的试样添加到恒温小室并测定电流的增加。按照由标准浓度的葡萄糖溶液制作的校正曲线，可以计算试样中的葡萄糖浓度。
包含本发明的变异α亚单位的gdh能够作为葡萄糖检测试剂盒的构成要素而使用。葡萄糖检测试剂盒中除了包含本发明的变异α亚单位的gdh以外，还可以包括发色或者发光试剂、稀释用缓冲液、标准物质、使用说明书等。
例如，使用了洋葱伯克霍尔德菌的野生型gdh的葡萄糖传感器以及葡萄糖检测试剂盒被记载在美国专利公开第2004/0023330a1中。本发明的变异gdh也可以以同样的方式使用。
实施例
接着，举出实施例而更具体地说明本发明，但本发明并不局限于这些实施例。
〔实施例1〕作为表达用于表达洋葱伯克霍尔德菌的gdh的质粒的、构建洋葱伯克霍尔德菌的gdh，准备表达gdh的α亚单位及γ亚单位的质粒。
作为表达α亚单位及γ亚单位的质粒，使用了wo02/036779(对应于ep1331272a1)中记载的质粒ptrc99a/γ+α。该质粒是通过以下的方式形成的质粒：将连续包含洋葱伯克霍尔德菌ks1株的gdh下亚单位结构基因和α亚单位结构基因的dna片段插入到作为载体ptrc99a的克隆位点的ncoi/hindiii。本质粒中的gdhγα基因通过trc启动子来控制。ptrc99a/γ+α保持有氨苄青霉素抗性基因。
通过以所述质粒ptrc99a/γ+α作为模板、且以具有下面的序列的寡核苷酸作为引物的pcr，来扩增包含dna片段的整个质粒，其中，该dna片段通过在gdh的α亚单位c末端附加了6个组氨酸残基而形成。
〔正向引物〕
5’-accaccactgataaggaggtctgaccgtgcggaaatctac-3’(序列号17)
〔反向引物〕
5’-agcctgtgcgacttcttccttcagcgatcggtggtggtgg-3’(序列号18)
将扩增得到的片段两端进行平末端化后，将5’末端磷酸化，利用连接反应进行环状化。通过获得的重组载体来转化大肠杆菌dh5α，并采集在包含氨苄青霉素50μg/ml的lb琼脂培养基中产生的菌落。在液体lb培养基中培养获得的转化体并提取质粒，并且分析该插入dna片段，结果确认了约2.1kb的插入片段。本质粒中gdh的各结构基因利用trc启动子来控制。本质粒保持有氨苄青霉素抗性基因。
〔实施例2〕向gdhα亚单位基因引入变异
使用实施例1中获得的ptrc99a/γ+α中包含的gdhα亚单位基因，并进行位点特异性变异引入，以使得在该基因引起编码的α亚单位的各氨基酸中引入变异。具体而言，使用市售的位点特异性变异引入试剂盒(stratagene公司，quikchangeiisite-directedmutagenesiskit)而进行密码子改变，使得实施例1中记载的质粒ptrc99a/γ+α中含有的gdhα亚单位基因的、322位的甘氨酸、363位的组氨酸、以及474位的天冬酰胺等的氨基酸被其他氨基酸取代。
表1示出构建的各变异体。此外，在表示变异的标记中，数字表示氨基酸序列中的位置，数字之前的字母表示氨基酸取代前的氨基酸残基，数字之后的字母表示氨基酸取代之后的氨基酸残基。例如，n474g表示从474位的天冬酰胺取代为甘氨酸。
〔实施例3〕变异gdh的底物特异性的分析
使用实施例2中获得的变异酶表达质粒而制造变异酶，并研究底物特异性。
(1)培养
关于引入了变异gdh表达质粒的大肠杆菌bl21株，分别使用3ml的lb培养基(含有羧苄青霉素100μg/ml)，并使用l形管而在37℃下培养4个小时之后，在温度25℃下进一步培养了20个小时。
(2)粗制酶样品的调制
从以如上所述的方式培养的培养液中收集菌体，将它们悬浮在400μl的bugbuster(默克密理博制造)并在室温下进行20分钟的高速振荡，由此粉碎。对该悬浮液进行离心分离(15000×g，20分，4℃)并去除残渣，将获得的上清液(水溶性级分)作为粗制酶样品。
(3)gdh活性的测定
通过600nm时的吸光度的随时间变化来对由脱氢酶和底物的反应还原的dcip(2，6-二氯靛酚)的褪色进行定量，由此进行酶活性测定。除非另有规定，反应条件在下面的条件下进行。通过在包含酶溶液的反应溶液(10mm磷酸钾(ph6.5)+6.0mmpms(甲基吩嗪硫酸盐)+0.12mmdcip浓度全为最终浓度)中添加底物(葡萄糖、木糖或者半乳糖)，开始进行反应，并测定了600nm的吸光度变化。表1示出底物的最终浓度为40mm时的结果。此外，作为野生型gdh，使用了sm4γα。
表1-1
表1-2
表1-3
表1-4
表1-5
表1-6
表1-7
表1-8
表1-9
其结果为，可以确认当取代了322位的甘氨酸、363位的组氨酸、474位的天冬酰胺的一个以上时，维持对葡萄糖的反应性，并降低与木糖之间的反应性，并且很多这些变异体还同时降低对半乳糖的反应性。
产业上的可应用性
本发明的变异gdh对葡萄糖的底物特异性提高，并且可以适当地用于使用了葡萄糖传感器等的葡萄糖的测定中。
序列表
<110>爱科来株式会社；究极酵素国际股份有限公司
<120>变异葡萄糖脱氢酶及其使用
<130>p-150607
<160>25
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>2467
<212>dna
<213>burkhorderiacepacia
<220>
<221>cds
<222>(258)..(761)
<220>
<221>cds
<222>(764)..(2380)
<220>
<221>cds
<222>(2386)..(2466)
<400>1
aagctttctgtttgattgcacgcgattctaaccgagcgtctgtgaggcggaacgcgacat60
gcttcgtgtcgcacacgtgtcgcgccgacgacacaaaaatgcagcgaaatggctgatcgt120
tacgaatggctgacacattgaatggactataaaaccattgtccgttccggaatgtgcgcg180
tacatttcaggtccgcgccgatttttgagaaatatcaagcgtggttttcccgaatccggt240
gttcgagagaaggaaacatgcacaacgacaacactccccactcgcgtcgc290
methisasnaspasnthrprohisserargarg
1510
cacggcgacgcagccgcatcaggcatcacgcggcgtcaatggttgcaa338
hisglyaspalaalaalaserglyilethrargargglntrpleugln
152025
ggcgcgctggcgctgaccgcagcgggcctcacgggttcgctgacattg386
glyalaleualaleuthralaalaglyleuthrglyserleuthrleu
303540
cgggcgcttgcagacaaccccggcactgcgccgctcgatacgttcatg434
argalaleualaaspasnproglythralaproleuaspthrphemet
455055
acgctttccgaatcgctgaccggcaagaaagggctcagccgcgtgatc482
thrleusergluserleuthrglylyslysglyleuserargvalile
60657075
ggcgagcgcctgctgcaggcgctgcagaagggctcgttcaagacggcc530
glygluargleuleuglnalaleuglnlysglyserphelysthrala
808590
gacagcctgccgcagctcgccggcgcgctcgcgtccggttcgctgacg578
aspserleuproglnleualaglyalaleualaserglyserleuthr
95100105
cctgaacaggaatcgctcgcactgacgatcctcgaggcctggtatctc626
progluglngluserleualaleuthrileleuglualatrptyrleu
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435440445
thrarggluvaltyralathralaalalysvalleuglyglythrasp
450455460
valvalpheasnaspgluphealaproasnasnhisilethrglyala
465470475480
thrilemetglyalaaspalaargaspservalvalasplysaspcys
485490495
argthrpheasphisproasnleupheileserserserserthrmet
500505510
prothrvalglythrvalasnvalthrleuthrilealaalaleuala
515520525
leuargmetseraspthrleulyslysgluval
530535
<210>16
<211>539
<212>prt
<213>burkholderiacepacia
<400>16
metalaaspthraspthrglnlysalaaspilevalvalvalglyser
151015
glyvalalaglyalailevalalahisglnleualametalaglylys
202530
servalileleuleuglualaglyproargmetproargtrpgluile
354045
valgluargpheargasnglnproasplysthraspphemetalapro
505560
tyrproserserprotrpalaprohisproglutyrglyproproasn
65707580
asptyrleuileleulysglygluhislyspheasnserglntyrile
859095
argalavalglyglythrthrtrphistrpalaalaseralatrparg
100105110
pheileproasnaspphelysmetlysthrvaltyrglyvalalaarg
115120125
asptrpproileglntyraspaspleugluhistrptyrglnargala
130135140
gluglugluleuglyvaltrpglyproglyproglugluaspleutyr
145150155160
serproarglysglnalatyrprometproproleuproleuserphe
165170175
asngluglnthrilelysseralaleuasnglytyraspprolysphe
180185190
hisvalvalthrgluprovalalaargasnserargprotyraspgly
195200205
argprothrcyscysglyasnasnasncysmetproilecysproile
210215220
glyalamettyrasnglyilevalhisvalglulysalagluglnala
225230235240
glyalalysleuileaspseralavalvaltyrlysleugluthrgly
245250255
proasplysargilevalalaalailetyrlysasplysthrglyala
260265270
asphisargvalgluglylystyrphevalleualaalaasnglyile
275280285
gluthrprolysileleuleumetseralaasnargasppheproasn
290295300
glyvalalaasnserseraspmetvalglyargasnleumetasphis
305310315320
proglythrglyvalserphetyralaasnglulysleutrpprogly
325330335
argglyproglnglumetthrserleuileglypheargaspglypro
340345350
pheargalathrglualaalalyslysilehisleuserasnmetser
355360365
argileasnglngluthrglnlysilephelysalaglylysleumet
370375380
lyshisglugluleuaspalaglnileargaspargseralaargtyr
385390395400
valglnpheaspcysphehisgluileleuproglnprogluasnarg
405410415
ilevalproserlysthralathraspalaileglyileproargpro
420425430
gluilethrtyralaileaspasptyrvallysargglyalavalhis
435440445
thrarggluvaltyralathralaalalysvalleuglyglythrasp
450455460
valvalpheasnaspgluphealaproasnasnhisilethrglyala
465470475480
thrilemetglyalaaspalaargaspservalvalasplysaspcys
485490495
argthrpheasphisproasnleupheileserserserserthrmet
500505510
prothrvalglythrvalasnvalthrleuthrilealaalaleuala
515520525
leuargmetseraspthrleulyslysgluval
530535
<210>17
<211>40
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>17
accaccactgataaggaggtctgaccgtgcggaaatctac40
<210>18
<211>40
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>18
agcctgtgcgacttcttccttcagcgatcggtggtggtgg40
<210>19
<211>26
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>19
catgccatggcacacaacgacaacac26
<210>20
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>20
gtcgacgatcttcttccagccgaacatcac30
<210>21
<211>9
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>区域(i)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(3)
<223>xaa是val或ile
<400>21
xaaxaaxaaglyserglyvalalagly
15
<210>22
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>区域(ii)
<400>22
cyscysglyasnasncysmetproilecys
1510
<210>23
<211>12
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>区域(iii)
<400>23
valglyargasnleumetasphisproglythrgly
1510
<210>24
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>区域(iv)
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>xaa是ile或leu
<400>24
lyslysxaahisleuserasn
15
<210>25
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>区域(v)
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>xaa是pro或asn
<400>25
phealaxaaasnasnhisile
15
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