专利名称：青蒿素类化合物生物转化制备方法
技术领域：
本发明涉及青蒿素类化合物生物转化制备方法，具体说是利用已知微生物对青蒿素及其衍生物进行生物转化制备青蒿素类化合物的方法。
背景技术：
微生物转化是利用微生物产生的特异酶来完成特定的生化反应。微生物可产生多种酶，催化多种反应。例如，微生物转化反应类型有氧化、还原、水解、取代、脱去、缩合及裂解反应等。如能利用单一酶，使其专一地催化特定的反应，就可以减少副产物，提高目的产物的生产效率。所以，如果要利用微生物转化制备具有实用性的目的产物，首先必须筛选针对某类特定的底物产生所需要的反应的菌种，同时，为了提高目的物的生产效率，减少副产物，还需要研究生物转化的条件，如反应时pH、底物浓度、培养基的组成。
目前，国外已有利用生物转化制备青蒿素类化合物。例如Lee I.-S等人选用菌株Nacardia corallina(ATCC 19070)和Penicilium chrysogenum(ATCC 9480)对青蒿素进行生物转化，得到脱氧青蒿素(deoxyartmisinin)和3α-羟基脱氧青蒿素(3α-hydrodeoxyartemisinin)，参见抗疟药倍半萜青蒿素的微生物转化研究，天然产物杂志(Jounal of Natural Products)1989，52(2)337-341；Abourashed，E.A.和Hufford，C.D.选用菌株Cunninghamella elegans(ATCC 9275)对蒿甲醚进行生物转化，得到3α-羟基蒿甲醚(3α-hydroxyartemether)、3β-羟基蒿甲醚(3β-hydroxyartemether)等5个产物，参见蒿甲醚的生物转化，天然产物杂志(Jounal of Natural Products)1996，59(3)251-253。
浅灰色链霉菌ATCC13273在三项美国专利5,674,714、5,213,971、5,169,755中，均用于诱导细胞色素P-450酶，没有检索到其它用途。
发明内容
本发明要解决的技术问题是研究制备青蒿素类化合物的生物转化方法，尤其是利用生物转化方法制备具有生理活性的羟基化青蒿素类化合物的生物转化方法，这需要选择能够对青蒿素类化合物产生羟化反应的菌种。
为了提高目的物的生产效率，减少副产物，本发明还需要研究对青蒿素类化合物进行羟化反应的生物转化条件，如反应时pH、底物浓度、反应时间与培养基的组成，尤其需要在常规培养基的基础上筛选合适的碳源、氮源和金属离子。
本发明的技术方案是制备具有下列通式的青蒿素类化合物的方法，其特征在于利用保藏号为ATCC-13273的浅灰色链霉菌种微生物或其功能等同的变异体和突变体，对青蒿素、双氢青蒿素或蒿甲醚进行生物转化，得到下列青蒿素类化合物， 1)3α-羟基青蒿素，R1＝OH，R2＝R3＝H，R4+R5＝＝O；2)3β-羟基青蒿素，R1＝R3＝H，R2＝OH，R4+R5＝＝O；3)青蒿素酮-3，R1+R2＝＝O，R4+R5＝＝O，R3＝H4)3α-羟基双氢青蒿素，R1＝R4＝OH，R2＝R3＝R5＝H；5)3α-羟基-α-双氢青蒿素，R1＝R5＝OH，R2＝R3＝R4＝H；6)10α-羟基双氢青蒿素，R1＝R2＝R5＝H，R3＝R4＝OH；
7)10α-羟基-α-双氢青蒿素，R1＝R2＝R5＝H，R3＝R5＝OH；8)3α，3β-二羟基蒿甲醚，R1＝R2＝OH，R3＝R5＝H；R4＝-OCH39)3β，10α-二羟基蒿甲醚，R1＝R5＝H，R2＝R3＝OH，R4＝-OCH310)3α，10α-二羟基蒿甲醚，R1＝R3＝OH，R2＝R5＝H，R4＝-OCH311)3α-羟基蒿甲醚，R1＝OH，R2＝R5＝R3＝H，R4＝-OCH312)3β-羟基蒿甲醚，R1＝R5＝R3＝H，R2＝OH，R4＝-OCH3。
上述制备青蒿素类化合物的方法，培养基主要组成除20％马铃薯煎煮液，KH2PO4，MgSO4·7H2O，微量VB1外，其特征在于碳源为葡萄糖、淀粉、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、糊精、玉米粉和/或甘油，氮源为蛋白胨、酵母膏、玉米粉、豆粉、脲素、碳酸铵、硝酸钠、L-赖氨酸、DL-α-氨基丙酸，金属离子为K+或Co2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+。
所述制备青蒿素类化合物的方法，培养基主要组成除20％马铃薯煎煮液，KH2PO4，MgSO4·7H2O，VB1微量外，碳源选择葡萄糖、淀粉、糊精、玉米粉和/或甘油，氮源选择酵母膏、玉米粉和/或DL-α-氨基丙酸，金属离子选择Mn2+较好。
所述制备青蒿素类化合物的方法，培养基主要由20％马铃薯煎煮液1000ml、VB1微量、金属离子0.1-0.3mmol/L和以下原料(按重量比)组成碳源8-12份氮源1-5份KH2PO41-3份MgSO4·7H2O 1份。
所述制备青蒿素类化合物的方法，较好的培养基主要由20％马铃薯煎煮液1000ml、VB1微量、金属离子0.1-0.3mmol/L和以下原料(按重量比)组成碳源10-11份氮源3-3.5份KH2PO42份MgSO4·7H2O 1份。
所述制备青蒿素类化合物的方法，其特征在于生物转化是在pH5.0～7.5条件下进行；青蒿素、双氢青蒿素和/或蒿甲醚的浓度为0.2～1mg/mL；生物转化时间为36～108小时。
较理想的制备青蒿素类化合物的方法，其特征在于生物转化是在pH6.0条件下进行，青蒿素、双氢青蒿素和/或蒿甲醚的浓度为0.4-0.6mg/mL；生物转化时间为80～90小时。
所述制备青蒿素类化合物的方法包括，利用保藏号为ATCC-13273的浅灰色链霉菌种微生物或其功能等同的变异体和突变体，在分别以玉米粉作为碳源或氮源、pH为6.0、含Mn2+的培养基中，培养84小时，得到3α-羟基青蒿素。
制备青蒿素类化合物的方法还包括利用保藏号为ATCC-13273的浅灰色链霉菌种微生物或其功能等同的变异体和突变体，在分别以玉米粉作为碳源或氮源、pH为6.0、含Mn2+的培养基中，培养84小时，得到3β-羟基青蒿素。
本发明还包括具有免疫活性的青蒿素类化合物，其特征在于具有如下通式 1)3α-羟基青蒿素，R1＝OH，R2＝R3＝H，R4+R5＝＝O；2)3β-羟基青蒿素，R1＝R3＝H，R2＝OH，R4+R5＝＝O；3)青蒿素酮-3，R1+R2＝＝O，R4+R5＝＝O，R3＝H4)3α-羟基双氢青蒿素，R1＝R4＝OH，R2＝R3＝R5＝H；5)3α-羟基-α-双氢青蒿素，R1＝R5＝OH，R2＝R3＝R4＝H；6)10α-羟基双氢青蒿素，R1＝R2＝R5＝H，R3＝R4＝OH；7)10α-羟基-α-双氢青蒿素，R1＝R2＝R5＝H，R3＝R5＝OH；8)3α，3β-二羟基蒿甲醚，R1＝R2＝OH，R3＝R5＝H；R4＝-OCH39)3β，10α-二羟基蒿甲醚，R1＝R5＝H，R2＝R3＝OH，R4＝-OCH310)3α，10α-二羟基蒿甲醚，R1＝R3＝OH，R2＝R5＝H，R4＝-OCH3。
上述方法中用微生物S.griseus对青蒿素、双氢青蒿素和蒿甲醚进行了生物转化，从发酵液中共分得12个转化产物，其中3个为青蒿素的转化产物、4个为双氢青蒿素的转化产物、5个为蒿甲醚的转化产物。用IR、SCI-MS、ESI-MS、FAB-MS、HREI-MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT、HMBC、1H-1H COSY等多种波谱手段进行了结构鉴定，共鉴定了12个，其中10个为新化合物。
具体实施方法实施例1具转化活性微生物菌种的筛选本发明对14个菌种(株)进行了转化筛选，结果表明Streptomyces griseus(ATCC-13273)对青蒿素、双氢青蒿素和蒿甲醚均有较强的转化能力。
菌种筛选所用液体培养基—豆粉葡萄糖培养基取葡萄糖20g，酵母浸膏5g，豆粉5g，NaCl 5g，K2HPO4 5g，蒸馏水1000mL，用6N的HCl调pH至7.0。分装于150ml三角瓶，每瓶25ml，121℃、0.15Mpa灭菌20min。
菌种筛选时，保存菌种所用斜面固体培养基是在上述液体培养基中加入1.5％的琼脂，加热溶解后，分装于15mL具螺旋盖的试管中，121℃、0.15Mpa灭菌20min后，斜置冷却而成。
菌种保存与活化菌种接种于斜面固体培养基上，28℃培养3d，然后保存于4℃的冰箱内。
菌种活化采用两步活化法，参见Nair，M.S.R.，and Basile，D.V.Bioconversionof artenium B to artmisinn.天然产物杂志(Jounal of Natural Prodacts)1993，56(9)1559。先将菌种接种于液体培养基，28℃200r/min旋转培养48h后，转接于另一液体培养基，同条件培养24h。
加样与取样每瓶两步活化的菌液(25ml)加入用DMF溶解制成150mg/mL的青蒿素溶液100μL，使每mL菌液含青蒿素0.6mg。同条件培养84h后，将发酵液取出，加等量乙酸乙酯萃取3次，合并后回收乙酸乙酯，残渣少量丙酮溶解供薄层色谱鉴别用。
空白对照每瓶两步活化的菌液加入DMF 100μL，同条件培养84h后，将发酵液取出，加等量乙酸乙酯萃取3次，合并后回收乙酸乙酯，残渣少量丙酮溶解供薄层色谱鉴别用。
转化产物的薄层色谱鉴别分别转化后的样品和空白对照溶液点于用0.3％CMC-Na制成的硅胶G薄层板上，石油醚-丙酮(3∶1)上行法展开，取出晾干溶剂后，喷以5％的香草醛-浓硫酸，电吹风加热显色，检视转化结果。
转化结果见表1表.1.对青蒿素具转化活性微生物菌种的筛选Organism Metabolie productionAmycolatopsis orientalis subsp.orientalis(ATCC-19795) -Aspergillus niger(CGMCC-3.4463)-Beauveria sp.(CGMCC-3.3574)-Caldariomyces fumago(ATCC-16373) -Candida rugosa(ATCC-14830) -Corynebacterium mediolarrum(ATCC-14004)-Cylindrocapon radicicola(ATCC-11011) +Gliocbadium deliquescens(NRRL-1086)-Nocardia sp.(NRRL-5646)-Peeudomonas putida(ATCC-33015) -Penicillium notatum(ATCC-36740)-Polyporus versicolor(ATCC-12679) -Rhizopus sp(NRRL-1478) +Streptomyces griseus(ATCC-13273) ++ATCC美国典型培养物保藏中心，NRRLNorthern RegionalResearch Laboratories，CGMCC中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心从所筛选的14个菌种可以看出，仅有3个菌种对青蒿素有催化转化作用，其中以S.griseus的转化能力最强。此后，又用S.griseus对双氢青蒿素和蒿甲醚进行了转化实验，结果表明，该菌株对双氢青蒿素和蒿甲醚亦有较强的转化作用。因此，本发明选择该菌株作为制备规模转化的菌株。
实施例2青蒿素类化合物的生物转化实验材料与仪器微生物 本实验所用微生物为浅灰色链霉菌Streptomyces griseus保藏号为ATCC-13273，在美国专利5,674,714、5,213,971、5,169,755中已公开。
试药和试剂 青蒿素按文献方法制备，参见陈有根、余伯阳等，青蒿素及其前体化合物的提取分离与鉴定，中草药，2001；32(4)302-303，并经光谱鉴定其结构与文献报道一致；双氢青蒿素购自北京第六制药厂；蒿甲醚购自昆明制药股份有限公司。此三化合物分别用丙酮溶解制成浓度为240mg/mL的溶液，摇匀，作为转化底物备用。
培养基 20％马铃薯煎煮液6000ml，玉米粉120g，MnSO41.50g，VB16g(6N NaOH或HCl调pH＝6.0)。分装于24个1000ml三角瓶(每瓶200ml)和24个150ml三角瓶(每瓶25ml)，121℃、0.15Mpa灭菌20min。
仪器 WL-1型显微熔点测定仪(未校正)；NICOLET Impact 410红外光谱仪；VarianXL-500、XL-400和BRUKER ACF-300核磁共振仪；Finnigan FTMS-2000质谱仪(70eV)。
青蒿素、双氢青蒿素和蒿甲醚的微生物转化可以直接进行，也可以按上述文献方法，将菌种进行活化或二次活化。
菌种活化菌种活化采用两步活化法，先将菌种接种于8个150ml的三角瓶(内装25ml液体培养基)中，28℃200r/min振荡旋转培养48h后，分别转接于另8个1000ml的三角瓶(内装200ml液体培养基)中，同条件培养24h。
加样与取样每瓶两步活化的菌液(200ml)加用丙酮溶解制成240mg/mL的青蒿素溶液0.5mL。同条件培养84h后，将发酵液取出，过滤后合并，得滤液1.6L，用乙酸乙酯萃取3次(3.2L，1.6L×2)，合并萃取液，用Na2SO4脱水后，水浴55℃减压回收乙酸乙酯，残渣用少量氯仿溶出，得青蒿素的转化混合物(I)0.840g，备用。同样方法，制得双氢青蒿素(II)0.967g和蒿甲醚的转化混合物(III)0.935g。
转化产物的分离上述混合物I，II和III分别用少量氯仿溶解后，加2g硅胶拌样，氯仿湿法上样上于装有80g柱层硅胶(200-300目)的硅胶柱内，用氯仿-甲醇20∶1-5∶1梯度洗脱，由I得到1-3，II得到4-7，III得到8-12共12个化合物，所有化合物均用氯仿重结晶。 从青蒿素转化获得的新化合物1. 3α-羟基青蒿素(3α-hydroxylartemisinin)R1＝OH，R2＝R3＝H，R4+R5＝＝O；2. 3β-羟基青蒿素(3β-hydroxylartemisinin)R1＝R3＝H，R2＝OH，R4+R5＝＝O；3. 青蒿素酮-3(artemistone-3)R1+R2＝＝O，R4+R5＝＝O，R3＝H从二氢青蒿素转化获得的新化合物4. 3α-羟基双氢青蒿素(3α-hydroxy-dihydroartemisinin)R1＝R4＝OH，R2＝R3＝R5＝H；5. 3α-羟基-α-双氢青蒿素(3α-hydroxy-α-dihydroartemisinin)R1＝R5＝OH，R2＝R3＝R4＝H；6. 10α-羟基双氢青蒿素(10α-hydroxy-dihydroartemisinin)R1＝R2＝R5＝H，R3＝R4＝OH；7. 10α-羟基-α-双氢青蒿素(10α-hydroxy-α-dihydroartemisinin)R1＝R2＝R5＝H，R3＝R5＝OH；从蒿甲醚转化获得的新化合物8. 3α，3β-二羟基蒿甲醚(3α，3β-dihydroxyartemether)R1＝R2＝OH，R3＝R5＝H；R4＝-OCH39. 3β，10α-二羟基蒿甲醚(3β，10α-dihydroxyartemether)R1＝R5＝H，R2＝R3＝OH，R4＝-OCH310. 3α，10α-二羟基蒿甲醚(3α，10α-dihydroxyartemether)R1＝R3＝OH，R2＝R5＝H，R4＝-OCH3从蒿甲醚转化获得的已知化合物11. 3α-羟基蒿甲醚，R1＝OH，R2＝R5＝R3＝H，R4＝-OCH312. 3β-羟基蒿甲醚，R1＝R5＝R3＝H，R2＝OH，R4＝-OCH3。
上述转化产物中10个新化合物的结构鉴定及波谱数据1、3α-羟基青蒿素白色针晶(CHCl3)；mp，161-162℃；IR(KBr)Vmax3523，1720，1114，1010，989，880，832(cm-1)；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ5.83(1H，s，H-7)，3.81(1H，td，J＝2.4，3.2Hz，H-3)，3.38(1H，q，J＝7.2Hz，H-11)，2.36(1H，m，H-5)，2.43(1H，td，J＝4.0，12.8Hz，H-9b)，2.03(2H，m，H-9a，4a)，1.89(2H，m，H-1，2b)，1.54(1H，br，HO-3)，1.50(1H，m，H-2)，1.47(1H，m，H-10a)，1.43(3H，s，H-15)，1.28(1H，td，J＝2.4，14.4Hz，H-4b)，1.18(3H，d，J＝7.2，H-13)，1.06(3H，d，J＝6.4，H-14)；13C-NMR(400MHz，CDCl3)δ172.6(C-12)，105.5(C-8)，93.4(C-7)，79.2(C-6)，69.1(C-3)，43.4(C-1)，41.3(C-2)，37.6(C-5)，36.0(C-9)，32.3(C-11)，30.7(C-4)，25.2(C-15)，24.6(C-10)，15.8(C-14)，12.5(C-13)；CIMS m/z 299[M++1](37)，265(9)，253(43)，239(100)，235(39)，221(64)，207(52)；HREIMS[M+]298.1421(calc.for C15H22O6，298.1416)。
2、3β-羟基青蒿素白色针晶(CHCl3)；mp，158-159℃；IR(KBr)Vmax3469，1740，1113，1032，998，882，831(cm-1)；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ5.90(1H，s，H-7)，3.39(1H，q，J＝6.0Hz，H-11)，3.30(1H，td，J＝3.2，4.0Hz，H-3)，2.47(1H，td，J＝3.6，4.0，H-9a)，2.13(1H，m，H-4a)，2.09(2H，m，H-9b，5)，1.93(1H，m，H-10a)，1.64(1H，br，HO-3)，1.53(2H，m，H-1，9b)，1.47(3H，s，H-15)，1.41(1H，m，H-2)，1.23(1H，d，J＝26.8Hz，H-14)，1.19(1H，m，H-4b)，1.11(3H，d，J＝5.2，H-13)；13C-NMR(400MHz，CDCl3)δ171.5(C-12)，105.4(C-8)，93.2(C-7)，78.8(C-6)，73.5(C-3)，48.0(C-1)，44.5(C-2)，42.2(C-5)，35.8(C-9)，32.5(C-4)，32.2(C-11)，25.2(C-15)，24.8(C-10)，15.5(C-14)，12.6(C-13)；CIMS m/z 299[M++1](54)，253(19)，239(66)，235(25)，221(7)，207(100)；HREIMS[M+]298.1421(calc.for C15H22O6，298.1416)。
3、青蒿酮-3白色针晶(CHCl3)；mp，164-165℃；IR(KBr)Vmax，1739，1714cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.17(1H，s，H-7)，3.41(1H，dt，J＝4.8，7.2Hz，H-5)，2.60(1H，m，H-10b)，2.50(1H，m，H-9b)，2.20(1H，m，H-10a)，2.19(1H，m，H-2)，2.15(1H，m，H-9a)，2.07(1H，d，J＝4.8Hz，H-4a)，1.84(1H，m，H-11)，1.82(1H，m，H-1)，1.66(1H，d，J＝5.2Hz，H-4b)，1.48(3H，s，H-15)，1.18(3H，d，J＝7.2Hz，H-13)，1.13(3H，d，J＝6.4Hz，H-14)；13C NMR(400MHz，CDCl3)δ205.8(C-3)，170.7(C-12)，105.8(C-8)，92.8(C-7)，77.9(C-6)，49.5(C-11)，48.6(C-1)，43.7(C-2)，38.3(C-4)，35.8(C-9)，33.0(C-5)，26.1(C-10)，25.1(C-15)，12.4(C-14)，11.9(C-13)；CIMS m/z 297[M++1](9)，233(34)，222(28)，206(63)，91(67)，55(60)，43(100)；HREIMS m/z 296.1359[M+](calcd for C15H20O6296.1260)。
4、3α-羟基双氢青蒿素白色针晶(CHCl3)；m.p.134-136℃；IR(KBr)Vmax(cm-1)3500(OH)，1100，1038，880，827；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ5.64(1H，s，H-7)，5.26(1H，d，J＝3.2，H-12)，2.60(3H，s，H-16)，1.41(3H，s，H-15)，1.05(3H，d，J＝6.2，H-14)，0.95(3H，d，J＝7.2，H-13)；13C-NMR(400MHz，CDCl3)δ104.4(C-8)，94.5(C-12)，90.9(C-7)，80.2(C-6)，74.2(C-3)，50.0(C-1)，44.4(C-2)，43.0(C-5)，36.2(C-9)，34.4(C-4)，31.1(C-11)，26.2(C-15)，24.7(C-10)，16.2(C-14)，13.1(C-13)；FAB-MS m/z 323[M++Na+](18)，277(19)，251(22)，207(18)，173(17)，159(30)，137(50)，115(100)。
5、3α-羟基-α-双氢青蒿素白色针晶(CHCl3)；m.p.134-136℃；IR(KBr)Vmax(cm-1)3500(OH)，1100，1038，880，827；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ5.45(1H，s，H-7)，4.74(1H，d，J＝8.8，H-12)，2.32(3H，s，H-16)，1.42(3H，s，H-15)，1.06(3H，d，J＝6.2，H-14)，0.94(3H，d，J＝7.2，H-13)；13C-NMR(400MHz，CDCl3)δ104.2(C-8)，96.3(C-12)，87.4(C-7)，79.6(C-6)，73.9(C-3)，9.0.0(C-1)，44.1(C-2)，41.8(C-5)，36.1(C-9)，33.7(C-4)，30.5(C-11)，25.9(C-15)，24.6(C-10)，15.4(C-14)，12.7(C-13)；FAB-MS m/z 323[M++Na+](18)，277(19)，251(22)，207(18)，173(17)，159(30)，137(50)，115(100)。
6、10α-羟基双氢青蒿素白色针晶(CHCl3)；m.p.130-132℃；IR(KBr)Vmax(cm-1)3389 br(OH)，1092，1027，859，826；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ5.53(1H，s，H-7)，5.25(1H，d，J＝2.8，H-12)，2.61(3H，s，H-16)，1.41(3H，s，H-15)，1.02(3H，d，J＝6.4，H-14)，0.93(3H，d，J＝7.2，H-13)；13C-NMR(400MHz，CDCl3)δ102.7(C-8)，94.8(C-12)，90.8(C-7)，80.4(C-6)，70.0(C-10)，59.8(C-1)，46.4(C-9)，44.6(C-5)，37.1(C-3)，35.5(C-2)，34.8(C-11)，24.5(C-4)，25.8(C-15)，21.3(C-14)，13.1(C-13)；FAB-MS m/z 323[M++Na+](12)，277(38)，251(8)，207(12)，173(22)，159(26)，137(38)，115(100)。
7、10α-羟基-α-双氢青蒿素白色针晶(CHCl3)；m.p.130-132℃；IR(KBr)Vmax(cm-1)3389 br(OH)，1092，1027，859，826；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ5.32(1H，s，H-7)，4.73(1H，d，J＝9.2，H-12)，2.29(3H，s，H-16)，1.42(3H，s，H-15)，1.03(3H，d，J＝6.4，H-14)，0.92(3H，d，J＝7.2，H-13)；13C-NMR(400 MHz，CDCl3)102.4(C-8)，94.5(C-12)，87.5(C-7)，79.6(C-6)，69.4(C-10)，58.8(C-1)，45.3(C-9)，44.3(C-5)，37.0(C-3)，35.1(C-2)，30.8(C-11)，22.1(C-4)，25.8(C-15)，21.2(C-14)，12.7(C-13)；FAB-MS m/z 323[M++Na+](12)，277(38)，251(8)，207(12)，173(22)，159(26)，137(38)，115(100)。
8、3α，3β-二羟基蒿甲醚白色针晶(CHCl3)；IR(KBr)Vmax(cm-1)3528 br(OH)；1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ5.77(1H，s，H-7)，4.77(1H，d，J＝3.2，H-12)，3.48(3H，s，H-16)，3.06(1H，t，J＝14.6，H-4b)，2.67(1H，m，H-11)，2.43(3H，m，H-9b，4，2)，3.01(1H，m，H-9a)，1.93(2H，m，H-5，10b)，1.73(2H，m，H-1，10a)，1.50(3H，s，H-15)，1.07(3H，d，J＝6.7，H-14)，0.92(3H，d，J＝7.0，H-13)；13C-NMR(300MHz，CDCl3)δ117.6(C-3)，104.4(C-8)，103.6(C-12)，86.91(C-7)，79.4(C-6)，56.3(C-16)，51.6(C-2)，47.5(C-1)，44.0(C-5)，39.9(C-4)，36.1(C-9)，30.9(C-11)，26.0(C-15)，25.7(C-10)，12.6(C-13)，11.8(C-14)；ESI-MSm/z 315[M++1](5)，284(12)，283(100)，224(21)，227(9)，195(8)，179(14)，161(29)。
9、3β，10α-二羟基蒿甲醚白色针晶(CHCl3)；m.p.123-125℃；IR(KBr)Vmax(cm-1)，3380 br(OH)，1116，858，827；1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ5.21(1H，s，H-7)，4.74(1H，d，J＝2.8，H-12)，4.46(1H，td，J＝11.0，4.8，H-3a)，3.98(1H，dd，J＝7.9，9.4，H-10b)，3.49(1H，s，HO-3)，3.47(3H，s，H-16)，2.82(1H，m，H-11)，2.52(2H，m，H-9a，9b)，2.18(1H，s，HO-10)，1.87(1H，ddd，J＝12.7，12.7，4.8，H-4b)，1.57(2H，m，H-2，5)，1.45(3H，s，H-15)，1.32(1H，dd，J＝11.5，7.9，H-1)，1.20(3H，d，J＝7.9，H-13)，1.16(3H，d，J＝5.2，H-14)，1.16(H，m，H-4a)；13C-NMR(300MHz，CDCl3)103.6(C-12)，δ102.7(C-8)，88.1(C-7)，81.0(C-6)，70.0(C-3)，69.1(C-10)，59.1(d，C-1)，56.0(s，C-16)，51.3(C-2)，46.3(C-9)，45.3(C-5)，33.1(C-4)，31.4(C-11)，25.7(C-15)，20.9(C-14)，15.6(C-13)；ESI-MS m/z 353[M++Na](100)，323(49)，307(37)，235(43)。
10、3α，10α-二羟基蒿甲醚白色针晶(CHCl3)；m.p.121-123℃；IR(KBr)Vmax(cm-1)，3380 br(OH)；1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ5.28(1H，s，H-7)，4.70(1H，d，J＝3.5，H-12)，3.43(3H，s，H-16)，1.47(3H，s，H-15)，1.24(3H，d，J＝6.9，H-13)，1.16(3H，d，J＝3.8，H-14)；13C-NMR(300MHz，CDCl3)103.6(C-12)，δ102.4(C-8)，86.8(C-7)，81.1(C-6)，70.1(C-3)，69.4(C-9)，56.1(s，C-16)，51.6(d，C-1)，46.7(C-5)，40.3(C-2)，37.5(C-4)，32.4(C-10)，31.4(C-11)，25.9(C-15)，17.8(C-14)，12.8(C-13)；ESI-MS m/z 353[M++Na](88)，323(62)，307(100)，235(64)。
实施例3青蒿素微生物转化培养基中碳源、氮源、金属离子的选择对微生物Streptomyces griseus转化青蒿素产生的主产物，尤其是3α-羟基青蒿素的转化条件进行了筛选。
培养基碳源选择培养基20％马铃薯煎煮液1000ml，碳源(葡萄糖或可溶淀粉、蔗糖、麦芽糖、柠檬酸、半乳糖、糊精、玉米粉、甘油)20g，酵母膏5g，豆粉5g，KH2PO43.0g，MgSO4·7H2O 1.5g，VB1微量(pH5.0～7.5)。
氮源选择培养基20％马铃薯煎煮液1000ml，葡萄糖20g，氮源(蛋白胨或牛肉膏、酵母膏、玉米粉、豆粉10g，或脲素、碳酸铵、硝酸钠、L-赖氨酸、DL-α-氨基丙酸相当于硝酸钠2g/L)，KH2PO43.0g，MgSO4·7H2O 1.5g，VB1微量(pH5.0～7.5)。
金属离子选择培养基20％马铃薯煎煮液1000ml，葡萄糖20g，酵母膏5g，豆粉5g，金属离子(K+或Co2+、Fe3+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+)0.2mmol/L，VB1微量(pH5.0～7.5)。方法菌种保存与活化菌种接种于斜面固体培养基上，28℃培养3d，然后保存于4℃的冰箱内。菌种活化采用两步活化法，先将菌种接种于液体培养基，28℃200r/min振荡旋转培养48h后，转接于另一液体培养基，同条件培养24h。
加样与取样每瓶两步活化的菌液(25ml)加用DMF溶解制成150mg/ml的青蒿素溶液100μl。同条件培养36-120h后，分时取样，将发酵液取出，加等量乙酸乙酯萃取3次，合并后回收乙酸乙酯，残渣加色谱纯甲醇溶解定容为10ml，用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液供高效液相测定用。
高效液相测定条件与方法Waters 600E高效液相色谱仪，4通道在线脱气机，717型自动进样器，996二极管阵列检测器，Waters Symmetry C18层析柱。流动相乙腈-水35∶65；流速1.5ml/min；检测波长200nm。
上述碳源考察研究结果表明菌种S.griseus在以玉米粉为碳源的培养基中对青蒿素的转化能力最强；其次是淀粉、甘油、糊精和葡萄糖；在以柠檬酸为碳源的培养基中菌丝生长缓慢，对青蒿素几乎没有转化能力。
氮源考察研究结果表明菌种S.griseus在以玉米粉为氮源的培养基中对青蒿素的转化能力最强；其次是酵母膏和DL-α-氨基丙酸。
在含所考察的7种金属离子培养基中，菌种S.griseus对青蒿素的转化率都比较高，相比较而言，在含Mn2+的培养基中3α-羟基青蒿素得率最高。
实施例4青蒿素微生物转化培养基pH、培养时间、加样量的选择对微生物Streptomyces griseus转化青蒿素产生新产物的培养基pH、培养时间、加样量等条件的考察，培养基转化用培养基20％马铃薯煎煮液1000ml，葡萄糖20g，酵母膏5g，豆粉5g，KH2PO43.0g，MgSO4·7H2O 1.5g，VB1微量。
以上所有培养基均分装于150ml三角瓶，每瓶25ml，121℃、0.15Mpa灭菌20min。方法菌种保存与活化菌种接种于斜面固体培养基上，28℃培养3d，然后保存于4℃的冰箱内。菌种活化采用两步活化法，先将菌种接种于液体培养基，28℃200r/min振荡旋转培养48h后，转接于另一液体培养基，同条件培养24h。
加样与取样每瓶两步活化的菌液(25ml)加用DMF溶解制成150mg/ml的青蒿素溶液30、60、100、130、160μl。同条件培养84h后(取样时间考察除外)，将发酵液取出，加等量乙酸乙酯萃取3次，合并后回收乙酸乙酯，残渣加色谱纯甲醇溶解定容为10ml，用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液供高效液相测定用。
高效液相测定条件与方法Waters 600E高效液相色谱仪，4通道在线脱气机，717型自动进样器，996二极管阵列检测器，Waters Symmetry C18层析柱。流动相乙腈-水35∶65；流速1.5ml/min；检测波长200nm。
实验证明pH值对转化具有较大影响。转化培养基分别用1.0mol的盐酸或氢氧化钠调pH。分别考察了pH4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0青蒿素对转化率的影响，结果pH在5.0～7.5范围内均有利于转化反应。在pH为5.0～7.5的范围内，菌种的长势随pH值增大而增强，对青蒿素的转化率也随着增大，但3α-羟基青蒿素的得率却以pH为6.0时最高。
不同取样时间的转化结果证明测试了12、36、60、84、108、132、156七个不同取样时间青蒿素的转化率，结果在转化36-108小时期间均有较高的转化率。随着培养时间的延长，菌种对青蒿素的消耗量增多，但当培养84h后，菌种长势减弱。3α-羟基青蒿素的得率以培养84h取样最高。
实施例5青蒿素类化合物的生物活性测定用淋巴细胞发光法比较了青蒿素、3α-青蒿素、3β-青蒿素3个化合物的免疫活性，结果表明青蒿素的转化产物3α-羟基青蒿素、3β羟基青蒿素均具有很强的免疫增强活性。
1材料与仪器1.1药品与试剂鲁米诺(Luminol，Mark CO，F.R.G，终浓度10-5mmol/L)；葡聚糖F500(Pharmacia产品)；淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技有限公司)；植物血凝素(PHA，上海伊华临床医学科技公司，批号980101)；佛波豆蔻酸乙酯(PMA)，甲酰甲硫亮氨酰苯丙氨酸(fMLP)均为Sigma公司产品；淋巴细胞(PMN)分离液(内含NaCl 140mmol/L，KCl 5mmol/L，MgCl21mmol/L，CaCl21mmol/L，NaH2PO41mmol/L，HEPES 10mmol/L，Tris 5mmol/L)；瑞特氏染液(南京建成生物工程研究所)；青蒿素；3α-羟基青蒿素、3β-羟基青蒿素为转化获得的新化合物；其余试剂均为国产分析纯。
1.2仪器SHG-C型生物化学发光测量仪(上海上立检测仪器厂)；FA-1104上皿电子天平，上海天平仪器厂；HH-2数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司1.3动物，SD大鼠，体重180～250g，雌雄不拘。
2方法2.1 PMN的分离与保存取大鼠新鲜抗凝血，按文献(陶忆训等审编临床免疫学检查，上册，上海，上海科技出版社，1983，p16-19)进行PMN分离。经葡聚糖沉淀40分钟后，取上清液，经淋巴细胞分离液密度梯度离心分离出PMN。苔盼蓝检察PMN活力在3小时内为95％以上，瑞特氏染色法检验纯度在95％以上。用含2％小牛血清的Hanks液调整细胞悬液浓度为5×106PMN/mL，4℃保存，12小时内使用活力恒定。
2.2化学发光的测定用SHG-C型生物化学发光测量仪测定化学发光(CL)反应。37℃循环水使样品室温度为37±0.5℃。取PMN悬液1mL，加1uminol 0.2mL，37℃水浴孵育10min，测PMN自发性CL 1min。加入不同浓度测试样品，对照加HBSS 0.1mL，连续测定CL强度5min，然后立即加入PHA、PMA、fMLP，再连续测定10-15min。测定结果由生物-化学光度计6s积分自动记录。参照文献方法(张学军等化学发光法测量人外周血分离的淋巴细胞和中性粒细胞的活性中华医学杂志1992，15365；张学军等活性氧清除剂和钙通道阻断剂对人淋巴细胞化学发光的影响生物化学和生物物理学进展1990，17444)。
2.3结果处理CL强度以mV表示。以PMN自发性CL为本底，加刺激剂PMA、FMLP和PHA后出现的CL最高值为峰值。实验结果以峰值减去本底后的纯峰值表示。每份标本检测均做复管，统计数据取自3份以上标本的实验结果。测试样品影响大鼠PMN的CL程度以抑制率表示。
PMN-CL抑制率(％)＝[1-实验组纯峰值均数/对照组纯峰值均数]×100％3、实验结果(参见表2)
表2、对大鼠PMN的抑制率(％)浓度(mol/L)样品10-510-6青蒿素 -0.31873.74333α-羟基青蒿素 -1.2392-1.20823β-羟基青蒿素 -9.0381-5.4654本发明用淋巴细胞化学发光法对青蒿素类3个化合物进行了体外免疫活性比较，结果表明青蒿素的转化产物3α-羟基青蒿素和3β-羟基青蒿素具有显著的免疫促进作用，而且在药物浓度为10-5mol/L时，3β-羟基青蒿素的促进作用比青蒿素强约30倍。
权利要求
1.制备具有下列通式的青蒿素类化合物的方法，其特征在于利用保藏号为ATCC-13273的浅灰色链霉菌种微生物或其功能等同的变异体和突变体，对青蒿素、双氢青蒿素或蒿甲醚进行生物转化，得到下列青蒿素类化合物， 1)3α-羟基青蒿素，R1＝OH，R2＝R3＝H，R4+R5＝＝O；2)3β-羟基青蒿素，R1＝R3＝H，R2＝OH，R4+R5＝＝O；3)青蒿素酮-3，R1+R2＝＝O，R4+R5＝＝O，R3＝H4)3α-羟基双氢青蒿素，R1＝R4＝OH，R2＝R3＝R5＝H；5)3α-羟基-α-双氢青蒿素，R1＝R5＝OH，R2＝R3＝R4＝H；6)10α-羟基双氢青蒿素，R1＝R2＝R5＝H，R3＝R4＝OH；7)10α-羟基-α-双氢青蒿素，R1＝R2＝R5＝H，R3＝R5＝OH；8)3α，3β-二羟基蒿甲醚，R1＝R2＝OH，R3＝R5＝H；R4＝-OCH39)3β，10α-二羟基蒿甲醚，R1＝R5＝H，R2＝R3＝OH，R4＝-OCH310)3α，10α-二羟基蒿甲醚，R1＝R3＝OH，R2＝R5＝H，R4＝-OCH3。11)3α-羟基蒿甲醚，R1＝OH，R2＝R5＝R3＝H，R4＝-OCH312)3β-羟基蒿甲醚，R1＝R5＝R3＝H，R2＝OH，R4＝-OCH3。
2.根据权利要求1所述制备青蒿素类化合物的方法，培养基主要组成除20％马铃薯煎煮液，KH2PO4，MgSO4·7H2O，微量VB1外，其特征在于碳源为葡萄糖、淀粉、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、糊精、玉米粉和/或甘油，氮源为蛋白胨、酵母膏、玉米粉、豆粉、脲素、碳酸铵、硝酸钠、L-赖氨酸、DL-α-氨基丙酸，金属离子为K+或Co2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+。
3.根据权利要求1或2所述制备青蒿素类化合物的方法，培养基主要组成除20％马铃薯煎煮液，KH2PO4，MgSO4·7H2O，微量VB1外，其特征在于碳源为葡萄糖、淀粉、糊精、玉米粉和/或甘油，氮源为酵母膏、玉米粉和/或DL-α-氨基丙酸，金属离子为Mn2+。
4.根据权利要求1或2所述制备青蒿素类化合物的方法，培养基主要由20％马铃薯煎煮液1000ml、VB1微量、金属离子0.1-0.3mmol/L和以下原料(按重量比)组成碳源8-12份氮源1-5份KH2PO41-3份MgSO4·7H2O 1份。
5.根据权利要求4所述制备青蒿素类化合物的方法，培养基主要由20％马铃薯煎煮液1000ml、VB1微量、金属离子0.1-0.3mmol/L和以下原料(按重量比)组成碳源10-11份氮源3-3.5份KH2PO42份MgSO4·7H2O 1份。
6.根据权利要求1或2所述制备青蒿素类化合物的方法，其特征在于生物转化是在pH5.0～7.5条件下进行；青蒿素、双氢青蒿素和/或蒿甲醚的浓度为0.2～1mg/mL；生物转化时间为36～108小时。
7.根据权利要求6所述制备青蒿素类化合物的方法，其特征在于生物转化是在pH6.0条件下进行，青蒿素、双氢青蒿素和/或蒿甲醚的浓度为0.4-0.6mg/mL；生物转化时间为80～90小时。
8.根据权利要求1-2所述制备青蒿素类化合物的方法，其特征在于利用保藏号为ATCC-13273的浅灰色链霉菌种微生物或其功能等同的变异体和突变体，在分别以玉米粉作为碳源或氮源、pH为6.0、含Mn2+的培养基中，培养84小时，得到3α-羟基青蒿素。
9.根据权利要求1-2所述制备青蒿素类化合物的方法，其特征在于利用保藏号为ATCC-13273的浅灰色链霉菌种微生物或其功能等同的变异体和突变体，在分别以玉米粉作为碳源或氮源、pH为6.0、含Mn2+的培养基中，培养84小时，得到3β-羟基青蒿素。
10.具有免疫活性的青蒿素类化合物，其特征在于具有如下通式 1)3α-羟基青蒿素，R1＝OH，R2＝R3＝H，R4+R5＝＝O；2)3β-羟基青蒿素，R1＝R3＝H，R2＝OH，R4+R5＝＝O；3)青蒿素酮-3，R1+R2＝＝O，R4+R5＝＝O，R3＝H4)3α-羟基双氢青蒿素，R1＝R4＝OH，R2＝R3＝R5＝H；5)3α-羟基-α-双氢青蒿素，R1＝R5＝OH，R2＝R3＝R4＝H；6)10α-羟基双氢青蒿素，R1＝R2＝R5＝H，R3＝R4＝OH；7)10α-羟基-α-双氢青蒿素，R1＝R2＝R5＝H，R3＝R5＝OH；8)3α，3β-二羟基蒿甲醚，R1＝R2＝OH，R3＝R5＝H；R4＝-OCH39)3β，10α-二羟基蒿甲醚，R1＝R5＝H，R2＝R3＝OH，R4＝-OCH310)3α，10α-二羟基蒿甲醚，R1＝R3＝OH，R2＝R5＝H，R4＝-OCH3。
全文摘要
本发明公开了用浅灰色链霉ATCC13273微生物对青蒿素、双氢青蒿素或蒿甲醚进行羟基化生物转化的方法,从发酵液中共分得12个羟基化转化产物,其中3个为青蒿素的羟基化转化产物、4个为双氢青蒿素的羟基化转化产物、5个为蒿甲醚的羟基化转化产物,其中10个为母核如下的新化合物。
文档编号C12P17/18GK1382805SQ02112750
公开日2002年12月4日 申请日期2002年3月12日 优先权日2002年3月12日
发明者余伯阳, 陈有根, 吴志峰 申请人:中国药科大学