本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，更具体涉及一种与猕猴桃果实重量性状QTL位点紧密连锁的分子标记及应用。
背景技术：
猕猴桃富含维生素C、膳食纤维和多种矿物质营养，是一种深受消费者青睐的健康水果。中国是猕猴桃属植物的原始起源中心，猕猴桃资源极为丰富，形态和遗传多样性高，中国拥有全世界猕猴桃物种资源总数的96％左右。凭借丰富的自然资源，选育聚合优良性状的新品种，对猕猴桃产业的健康稳定发展起到关键作用。果实重量是影响果实品质的重要因素之一，同时也直接关系到果园的单位产量和果农的经济收益。因此，增加果实重量对改善猕猴桃果实品质至关重要，是猕猴桃育种的重要目标之一。
传统猕猴桃育种中，童期长、种植占地面积大等是影响育种效率的主要困难。随着分子生物学和测序技术的迅猛发展，对性状的选择正在逐渐由表型选择向基因型选择过渡。分子标记辅助育种能利用与目标性状基因紧密连锁或共分离的分子标记对个体进行筛选，以达到提高目标性状选择效率、缩短育种年限的目的。近年来，在苹果、梨、葡萄等果树中，已成功开发了重要农艺性状分子标记，利用分子标记进行辅助选择也日趋成熟。然而，猕猴桃重要农艺性状定位及相关分子标记开发工作比较匮乏。2013年，猕猴桃基因组草图的公布为基因组学研究和猕猴桃分子辅助育种提供了重要基础。随后，基于构建猕猴桃高密度遗传图谱，开发了3个性别鉴定标记，在育种早期进行性别鉴定，避免了人力和物力的浪费。农艺性状QTL定位就是在遗传分离群体的基础上，借助分子标记和遗传图谱，利用QTL作图软件对分离群体的数量性状表型数据进行分析，从而确定数量性状基因在染色体上的位置和效应。利用遗传连锁图谱，结合表型数据开展数量性状位点(Quantitative Trait Loci，QTL)扫描，已成为解析复杂数量遗传学规律、有效定位关键农艺性状、开发关联分子标记以及对优良性状进行早期选择的有效手段。
目前，对猕猴桃重要品质性状果实重量的QTL定位以及发掘与果实重量相关的分子标记研究尚未开展。开展猕猴桃果实重量的QTL研究，基于QTL位点信息进行分子标记筛选，有助于提高对猕猴桃果实重量性状选择的育种效率，节约育种成本，提升猕猴桃产业经济效益。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供了一种猕猴桃第7号染色体第6707727个碱基在猕猴桃果实重量筛选育种中的应用，包括针对猕猴桃第7号染色体第6707727个碱基设计的引物在猕猴桃果实重量筛选育种中的应用，包括包含有猕猴桃第7号染色体第6707727个碱基的猕猴桃序列在猕猴桃果实重量筛选育种中的应用。
本发明的目的在于提供了一种与猕猴桃果实重量性状QTL位点紧密连锁的分子标记的引物，引物为FW-F：5’-CCTGAAGGGTTGACTGGAAA-3’和FW-R：CTTGCAGGCATGAGGAAAGC。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种与猕猴桃果实重量性状QTL位点紧密连锁的分子标记的获得：
①使用果实重量小的山梨猕猴桃‘MT570001’猕猴桃和果实重量大的中华猕猴桃‘桂海4号’杂交构建F1分离群体。在该群体结果第6年，选择150株F1群体的后代单株为研究对象。
②采集群体150份单株叶片，利用CTAB法提取总DNA。根据RADseq方法构建中华猕猴桃‘桂海4号’、山梨猕猴桃‘MT570001’以及150株子代的文库并测序。
③将测序数据进行过滤，去除低质量碱基含量大于50％的序列，剔除有测序接头污染和大量重复的序列。使用软件SOAP2将符合过滤标准的测序数据比对到参考基因组，对每个样本进行位点变异检测，统计多态性位点在群体中的遗传类型。
④利用Joinmap4.0分析软件构建基于SNP标记的猕猴桃遗传图谱。将符合遗传分离规律的多态性标记位点，按Joinmap4.0软件格式导入，剔除数据缺失率在10％的位点，排除显著偏分离位点，采用Kosambi作图函数构建高密度遗传图谱。
⑤在果实成熟期，对中华猕猴桃‘桂海4号’、山梨猕猴桃‘MT570001’以及150株群体单株果实重量进行测量。每个样本随机采集40个果实，用称量天平量取果实重量，计算平均果重。
⑥将样本平均果实重量的表型数据和标记的基因型数据导入MapQTL5.0软件，选择多区间作图法，设置LOD阈值为3.0，对猕猴桃果实重量进行QTL定位分析。最终检测到与果实重量相关的主效QTL位点，对该性状的贡献率为16.24％，该位点与对应的SNP标记在连锁群上的遗传距离为64.9cM。
⑦提取猕猴桃第7号染色体第6707727个碱基上下游各100bp的序列，按照设计引物原则，开发设计SNP标记引物。正向引物FW-F为5’-CCTGAAGGGTTGACTGGAAA-3’，反向引物FW-R为5’-CTTGCAGGCATGAGGAAAGC-3’。扩增产物大小为154bp。
本发明的保护范围包括：猕猴桃第7号染色体第6707727个碱基在猕猴桃果实重量筛选育种中的应用，或者基于猕猴桃第7号染色体第6707727个碱基设计的引物在猕猴桃果实重量筛选育种中的应用，或是SEQ ID NO.3所示序列在猕猴桃果实重量筛选育种中的应用。
以上所述的应用，可利用现有技术，对待检猕猴桃的第7号染色体的第6707727个碱基进行检测，实现对猕猴桃果实重量筛选进行早期育种的目的。
本发明的积极效果：
本发明首次定位了猕猴桃中控制果实重量的主效QTL位点，可解释16.24％的表型方差。在常规育种方法中，猕猴桃果实重量表型鉴定要等到成熟期，浪费大量时间和精力，且选择效率低下，而通过检测与果实重量主效位点连锁的分子标记，可以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率。本发明中猕猴桃果实重量的主效基因位点位置明确，分子标记位点的检测方法方便快捷，不受环境影响。通过检测与果实重量性状相关的分子标记，即可预测猕猴桃果实重量，进而准确快速筛选果实重量较大的优良单株。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，为常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
与猕猴桃果实重量主效QTL及开发连锁的分子标记的获得：
①本实施例中使用果实重量小的山梨猕猴桃‘MT570001’猕猴桃和果实重量大的中华猕猴桃‘桂海4号’杂交构建F1分离群体。在该群体结果第6年，选择150株F1群体的后代单株为研究对象。
②采集群体150份单株叶片，利用CTAB法提取总DNA。根据RADseq方法构建中华猕猴桃‘桂海4号’、山梨猕猴桃‘MT570001’以及150株子代的文库并测序。
③将测序数据进行过滤，去除低质量碱基含量大于50％的序列，剔除有测序接头污染和大量重复的序列。使用软件SOAP2将符合过滤标准的测序数据比对到参考基因组，对每个样本进行位点变异检测，统计多态性位点在群体中的遗传类型。
④利用Joinmap4.0分析软件构建基于SNP标记的猕猴桃遗传图谱。将符合遗传分离规律的多态性标记位点，按Joinmap4.0软件格式导入，剔除数据缺失率在10％的位点，排除显著偏分离位点，采用Kosambi作图函数构建高密度遗传图谱。
⑤在果实成熟期，对中华猕猴桃‘桂海4号’、山梨猕猴桃‘MT570001’以及150株群体单株果实重量进行测量。每个样本随机采集40个果实，用称量天平量取果实重量，计算平均果重。
⑥将样本平均果实重量的表型数据和标记的基因型数据导入MapQTL5.0软件，选择多区间作图法，设置LOD阈值为3.0，对猕猴桃果实重量进行QTL定位分析。最终检测到与果实重量相关的主效QTL位点，对该性状的贡献率为16.24％，该位点与对应的SNP标记在连锁群上的遗传距离为64.9cM。
⑦提取猕猴桃第7号染色体第6707727个碱基上下游各100bp的序列，按照设计引物原则，开发设计SNP标记引物。正向引物FW-F为5’-CCTGAAGGGTTGACTGGAAA-3’，反向引物FW-R为5’-CTTGCAGGCATGAGGAAAGC-3’。扩增产物大小为154bp。
在中华猕猴桃‘桂海4号’中扩增的序列为SEQ ID NO.3所示；
在山梨猕猴桃‘MT570001’中扩增的序列为SEQ ID NO.4所示。
⑧利用高分辨率溶解曲线(HRM)技术对果实重量进行分型。按照Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus),ROX plus试剂盒说明，设计20uL反应体系：5ng·uL-1猕猴桃基因组DNA模板2ul，2×SYBR Premix 10ul，50×ROX Dye II 0.4ul，10uM FW-F和FW-R各0.8ul，双蒸水补足余量。扩增程序为：95℃预变性5s，60℃退火1min；95℃变性5s，60℃退火30s，进行35个循环。溶解程序为：95℃15s；60℃1min，再从60-95℃连续升温，每升高0.3℃收集1次荧光，95℃15s，最后降温至40℃。在Gene Scanning软件中自动生成扩增产物溶解曲线。
⑨对该分子标记的扩增产物溶解曲线进行分析，40个杂交后代分为两类基因型。线型分组1(与亲本中华猕猴桃‘桂海4号’的溶解曲线相同)中，18个后代单株平均果重为84.7克；线型分组2(与亲本山梨猕猴桃‘MT570001’的溶解曲线相同)中，22个后代单株平均果重为72.9克。对40个杂交子代的平均果重进行显著性检测，分析显示两类基因型个体的平均果重差值为11.8克，差异极其显著(P<0.005)。因此，通过对果实重量的测定和HRM分析结果分析，证明该特异分子标记可以检测猕猴桃果实重量的差异。
实施例2：
一种与猕猴桃果实重量性状QTL位点紧密连锁的分子标记在猕猴桃育种中的应用，其步骤是：
(1)以具有抗寒性高、抗病性好但果实重量小的山梨猕猴桃做为母本，果实风味佳且果实重量大的中华猕猴桃为父本杂交得到F1代，选取F1代群体中60个单株为研究对象。
(2)在果实成熟期，采集F1代群体60个单株的果实，每株采40个果实，用称量天平量取果实重量，计算平均果重。
(3)提取F1代60个单株的总DNA，按照Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)，ROX plus试剂盒说明，设计20uL反应体系：5ng·uL-1猕猴桃基因组DNA模板2ul，2×SYBR Premix 10ul，50×ROX Dye II 0.4ul，10uM FW-F和FW-R各0.8ul，双蒸水补足余量。扩增程序为：95℃预变性5s，60℃退火1min；95℃变性5s，60℃退火30s，进行35个循环。溶解程序为：95℃15s；60℃1min，再从60-95℃连续升温，每升高0.3℃收集1次荧光，95℃15s，最后降温至40℃。在Gene Scanning软件中自动生成扩增产物溶解曲线。
对该分子标记的扩增产物溶解曲线进行分析，60个杂交后代分为两类基因型。线型分组1(与亲本中华猕猴桃‘桂海4号’的溶解曲线相同)中，24个后代单株平均单果重为82.3克；线型分组2(与亲本山梨猕猴桃‘MT570001’的溶解曲线相同)中，36个后代单株平均单果重为73.7克。对60个杂交子代的平均果重进行显著性检测，分析显示两类基因型个体的平均单果重差值为8.6克，差异极其显著(P<0.005)。因此，通过对果实重量的测定和HRM分析结果分析，说明通过分子标记辅助选择果实重量位点，可以明显提高选择效率。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院武汉植物园
<120> 一种与猕猴桃果实重量性状QTL位点紧密连锁的分子标记及应用
<130> 一种与猕猴桃果实重量性状QTL位点紧密连锁的分子标记及应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cctgaagggt tgactggaaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cttgcaggca tgaggaaagc 20
<210> 3
<211> 154
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cctgaagggt tgactggaaa ttacctagca acctgttcaa atcacgtggc ctcaccacaa 60
agctgcttgg aaactttctc ctatcaagag agaggtgttg tatgtcgggt tcaatgttgc 120
aagtaatcca ataggctttc ctcatgcctg caag 154
<210> 4
<211> 154
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cctgaagggt tgactggaaa ttacctagca acctgttcaa atcacgtggc ctcaccacaa 60
agctgcttgg aaactttctc ctatcaagag aaaggtgttg tatgtcgggt tcaatgttgc 120
aagtaatcca ataggctttc ctcatgcctg caag 154