本发明属于生物技术领域，涉及一种引物对及利用该引物对进行扩增目的DNA的方法，具体地说是一种跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的引物对及其方法。
背景技术：
核酸体外扩增是分子生物学检测技术的基础，也是生物学分析的重要方法，通过核酸扩增可以扩增和分离目的基因，从而应用于在临床医疗诊断、分子诊断、食品安全检测及环境安全监测等领域。
随着分子生物学的发展，新的核酸扩增技术不断涌现。常见的核酸扩增技术有聚合酶链式反应（PCR）、环介导等温扩增（LAMP）以及滚环等温扩增（RCA）方法，这些方法都在微生物检测领域有广泛的应用，有成功的实践经验，是现今为止较为成熟的检测方法。但是每一种技术都有自身缺陷。
PCR方法作为最原始的体外核酸扩增技术，发展时间最长，也最为稳定。该方法首先需要一对引物引发扩增反应，然后经过“变性—退火（复性）—延伸”三个步骤不断的重复实现产物积累。PCR反应的基本原理为：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至90-95℃一定时间后，使DNA双链解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至50-60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于70-75℃，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。由此可见，在PCR实施过程中需要不断进行变温循环，这使得PCR的实施需要依赖于温度循环仪。该仪器现今为止价格依然昂贵，对于一些中小型企业，或是基层的检测机构而言，无疑增加了负担，对该方法的推广也增加了难度。
LAMP方法是由日本人Notomi在2000年发明的，其特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物（上游内引物FIP、下游内引物BIP、上游外引物F3及下游外引物B3），在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60-65℃恒温扩增，60分钟左右即可实现109-1010倍的核酸扩增，具有操作简单、灵敏度高等特点。但其引物设计复杂，而且在LAMP的操作过程中，假阳性问题十分凸显。根据报道，引起LAMP假阳性的主要有两个原因，一是由于多条引物之间的相互作用，二是由于受到气溶胶的影响。但这些问题在LAMP操作中难以真正得到解决：首先，引物之间的相互作用，由于LAMP本身需要4条引物，有时为了加快反应速率，可能会使用多达6条引物，所以引物之间的发生相互作用的几率也就更大。这也为LAMP的引物设计过程也增加的更大的难度。为找到合适的引物，需要对很多套引物分别进行试验，从中挑选适宜的引物，该过程费时费力且增加成本。另外，实验室的客观条件决定了LAMP操作过程中受到气溶胶影响的可能性，想要免除气溶胶的影响，实验室需要有良好的条件，且操作人员需要有较高的素质。这些都在一定程度上限制了LAMP的推广。
RCA方法起始于1998年，该技术模拟自然界微生物环状DNA的滚环复制过程，同样在具有链置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）作用下由一条引物即可引发沿环形DNA模板的链置换合成，实现环状DNA模板的体外等温扩增。针对于环状DNA，RCA方法展现了较好的优越性，但是对于更常见的线性DNA而言，RCA则需要首先进行一个独立步骤，获得环化的DNA。该过程依赖于锁式探针，获得含有一定长度的目的序列的环状DNA。包括探针设计以及使用探针生成环状DNA的过程，使得RCA反应需要消耗更长的时间，进行更复杂的步骤，花费更高的成本。因此现今为止，RCA方法在基层检测中并没有得到广泛应用。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题，是提供一种跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的引物对及含有该引物对的试剂盒，该引物对设计合理，特异性强，应用于跨越式滚环核酸等温扩增时，能实现引物自身不扩增而目的基因扩增的效果。
本发明的另外一个目的是，提供了跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的扩增方法，该方法简单，过程易于控制，步骤简单，成本低。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的引物对，包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物之间的连续互补碱基小于或等于4对，所述上游引物和下游引物3’端和5’端的4个碱基中任意两个碱基不互补，所述上游引物和下游引物，至少有一条引物不具有二级结构，引物的GC含量为45-55%，Tm值为55-58℃。
一种跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的试剂盒，即含有所述引物对的试剂盒。
本发明还提供了一种跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的扩增方法，它按照如下的步骤顺序依次进行：
（1）从样品中提取DNA为模板；
（2）利用上述的引物对或者上述的试剂盒中引物对作为扩增的引物，进行SRCA扩增，得到扩增产物；
（3）检测扩增产物，做出判断。
作为上述扩增方法的限定，所述SRCA的反应体系如下：
上游引物 1μL；
下游引物 1μL；
dNTPs 2.5mmol/L each 5μL；
MgSO4 20mmol/L 1μL；
10×reaction buffer 3μL；
Bst DNA聚合酶8U/μL 1μL；
模板DNA 1μL；
二甲基亚砜 0.2μL；
ddH2O 6.8μL
作为上述扩增方法的进一步限定，所述SRCA扩增包括三个阶段：
预变性阶段： 将权利要求4所述体系中除Bst DNA聚合酶外的其它物质加入离心管中，于94℃下加热3 min，然后立即取出离心管，冰浴2 min，冰浴结束后混匀离心管中液体；
扩增阶段：向上述离心管中加入Bst DNA聚合酶，将离心管置于孵育器中，于60-65℃下，反应90min；
终止阶段：将孵育器温度升高至80 ℃并加热5 min，使酶失活，终止反应。
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
1.费用低：与PCR技术相比，本发明提供的扩增方法，在60-65℃的温度下就可以完成扩增过程，因此不需要价格较高的精密仪器-温度循环仪，只需要恒温水浴锅即可；
2.特异性强：引物对的特异性强，可以特异性的识别目标序列，对于非目标序列不发生扩增反应，避免了引物自身扩增，使其能够应用于分子生物学检测领域；
3.快速高效、方法简便：本发明所提供的扩增方法于恒温下进行扩增反应，整个扩增反应在1.5h内即可完成，与RCA相比，SRCA反应扩增线性DNA不需要环化和连接酶连接，因此SRCA方法更加简便、省时。；
4.稳定性好：与LAMP方法相比较，SRCA方法更少受到气溶胶的影响，且只需要一对引物，引物之间发生相互结合的可能性更小，因此假阳性现象不明显；
5.结果易判定：SRCA方法可以通过肉眼可直接观测反应结果，在不具备电泳设备的实验室，可以通过添加荧光染料或是离心观察沉淀对反应结果进行判定， 更适合现场快速检测，更适应基层单位应用。
本发明适用于对目的DNA进行扩增。
本发明下面将结合具体实施例作进一步详细说明。
附图说明
图1为实施例7中琼脂糖凝胶电泳法的结果图谱；
图中：M-DNA Marker，1-阴性结果，2-阳性结果。
具体实施方式
下述实施例所用的方法及试剂，如无特殊说明，均采用现有的方法及试剂。
实施例1 一种跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的引物对
本实施例所提供的引物对包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物之间的连续互补碱基小于或等于4对，上游引物和下游引物3’端和5’端的4个碱基中任意两个碱基不互补，上游引物和下游引物，至少有一条引物不具有二级结构，引物的GC含量为45-55%，Tm值为55-58℃。
实施例2 一种试剂盒
本实施例所提供的试剂盒含有实施例1中所述的引物对。
实施例3 一种跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的扩增方法
本实施例为一种跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的扩增方法，它按照如下的步骤顺序依次进行：
（1）从样品中提取DNA为模板；
（2）利用实施例1的引物对或者实施例2的试剂盒中引物对作为扩增的引物，进行SRCA扩增，得到扩增产物；
扩增的过程中，SRCA的反应体系如下：
上游引物 1μL；
下游引物 1μL；
dNTPs 2.5mmol/L each 5μL；
MgSO4 20mmol/L 1μL；
10×reaction buffer 3μL；
Bst DNA聚合酶8U/μL 1μL；
模板DNA 1μL；
二甲基亚砜 0.2μL；
ddH2O 6.8μL
SRCA扩增包括三个阶段：
预变性阶段： 将上述反应体系中除了Bst DNA聚合酶外的其它物质加入离心管中，于94℃下加热3 min，然后立即取出离心管，冰浴2 min，冰浴结束后混匀离心管中液体；
扩增阶段：向上述离心管中加入Bst DNA聚合酶，将离心管置于孵育器中，于60℃下，反应90min；
终止阶段：将孵育器温度升高至80 ℃并加热5 min，使酶失活，终止反应。
（3）检测扩增产物，做出判断。
实施例4-6 一种跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的扩增方法
本实施例分别为一种跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的扩增方法，扩增方法与实施例3相似，不同之处仅在于：SRCA扩增阶段的反应温度不同，具体为：实施例4温度为62℃，实施例5温度为65℃，实施例6温度为64℃。
实施例7 SRCA方法在检测志贺氏菌中的应用
一、所需仪器：
1. 上海格利斯牧畜科技有限公司恒温孵育器K30；
2. 苏州双天公司超净无菌工作台SW-CJ-2FU；
3. 太仓市科教器材厂旋涡混合器 WH-861；
4. 北京六一仪器厂电泳仪DYY-8C；
5. 离心机；
6. 移液枪。
二、所需试剂及试剂盒：
1. 大连宝生物科技有限公司Bst DNA聚合酶，所购酶中附带Bst DNA聚合酶Buffer及MgSO4溶液；
2. 北京全式金生物公司dNTPs mixture；
3. 北京华大公司合成的上游引物及下游引物；
4. 大连宝生物公司细菌DNA提取试剂盒；
5. 北京陆桥公司营养肉汤。
三、菌株：福氏志贺氏菌（CMCC 51571）；
四、引物：上游引物：5'-GGACATTGCCCGGGATAAA-3'；
下游引物：5'-ACGGCAGTGAAGAGCTGAA-3'
五、扩增方法：
1. 提模板：首先将福氏志贺氏菌标准菌株在营养肉汤中37 ℃下过夜培养，培养后取1mL，利用宝生物公司的细菌DNA提取试剂盒提取细菌DNA，此提取的DNA即为扩增反应的模板；
2. 加体系：使用150μL的离心管，用移液枪向离心管中添加4μL dNTPs（浓度为2.5 mM each）、 2μL l0 × Bst Buffer、3μL MgSO4 (浓度为20mM)，1 μL上游引物（浓度为10μM）及1μL下游引物（浓度为10μM），1μL模板（阴性对照不加模板，以水代替），最后反应体系加入无菌去离子水补足至19μL（该步骤所加体系不包含Bst DNA聚合酶，该酶需要在预变性过程之后进行添加，防止温度过高导致酶失活）；
3. 混匀：将步骤2 中的体系在涡旋混匀器上涡旋10 s，之后移至离心机中3000转离心10s（涡旋和离心是为了将体系混匀，同时将管壁上的液体集中到离心管底部）；
4. 预变性：将离心管放入孵育器中，在94℃下加热3min，然后迅速将离心管放置到冰上，冰浴2 min；冰浴结束后加入1μL 的Bst DNA聚合酶（酶活性为8U）；
4. 混匀：重复步骤3；
5. 扩增：将孵育器设置62℃，将反应体系放置到孵育器中，反应90 min；
6. 终止：扩增结束后，将孵育器温度升高至80℃加热5min，使酶失活，从而终止反应；
7. 观察反应结果：在反应结束后，可以通过下述3种方式对反应结果进行判定。
方法①：制作2%琼脂糖凝胶，通过凝胶电泳后在紫外凝胶成像仪中观察反应结果，反应中获得的不同长度的扩增产物将在琼脂糖凝胶电泳上展现出梯形条带，阴性对照由于模板不进行扩增，因此没有任何条带，即：阳性结果出现梯形条带，阴性结果无条带，本实施例中的结果如图1所示；
方法②：向最终的反应体系中添加1 μL1000 × SYBR Green І，然后肉眼观察反应结果，反应中获得的双链DNA，可以通过向体系中添加SYBR Green І，进行显色，该染料与双链DNA结合后激发绿色荧光，而阴性结果由于没有扩增出双链DNA，保持染料原始的橙色不变，即：阳性结果出现绿色荧光，而阴性结果保持染料原来的橙色；
方法③：将最终反应体系在离心机中12000转离心2 min后肉眼观察沉淀，判断反应结果，在反应的过程中，dNTPs键合到核酸链上时，形成焦磷酸根离子，焦磷酸根离子与反应体系中的镁离子结合后形成不溶性产物焦磷酸镁，该产物可以在反应结束后通过离心进行沉淀，从而通过观察沉淀判断反应结果，即：阳性结果出现白色沉淀，阴性结果无沉淀产生。
实施例1-6，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明所作的其它形式的限定，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但凡是未脱离本发明权利要求的技术实质，对以上实施例所作出的简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明权利要求保护的范围。