本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种红景天液体深层发酵生产红景天苷的方法。
背景技术：
红景天(rhodiola)属植物以全草入药，性寒，味甘涩。植株富含矿物质，化学成分独特，药用价值高，已被列为珍惜药用植物。红景天具有类似中医的“扶本固正”的“适应原”样作用和抗寒冷、抗微波辐射、抗缺氧、抗疲劳、益智等作用，无毒无成瘾性等优良性质，国内对红景天的需求逐渐较大，年采挖红景天干燥根茎需求量超过1000吨。随着科学技术的发展和人民生活水平的提高，红景天系列产品日益受到人们的青睐，对红景天的需求量日益增大，充分利用红景天这种天然绿色野生资源，激活红景天中天然活性成分，研制与开发营养健康绿色红景天系列药品、保健食品和化妆品等，尤其是适应于高山、深海、沙漠、微波辐射等特殊环境下的防护产品将为红景天资源的开发利用开辟一条新的道路，对红景天的研究具有广阔的应用前景和十分重要的意义。
红景天中的主要有效和活性成分是红景天苷及其苷元，常以其总含量的高低作为衡量红景天属植物原药材及其制剂质量的标准。二者的化学结构和药理作用明确，但在红景天中的含量不高。现有的大多数研究是通过添加前体物和一些酶催化剂合成红景天苷，或者用愈伤组织和细胞培养来增加红景天苷和苷元含量。但细胞培养红景天的次生代谢物产量通常较低，化学合成路线长、产率低，操作繁琐，这使其经济价值受到质疑。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种红景天液体深层发酵生产红景天苷的方法，其培养基配方原料常见、价格低廉，所得红景天苷纯度高、产量高。
具体地，本发明提供一种红景天液体深层发酵生产红景天苷的方法，所述方法采用如下液体发酵培养基，按重量百分比计，所述液体发酵培养基由包括以下原料制备而成：葡萄糖6-10％、豆饼粉2-6％、红景天粉2.4-5％、mgso4·3h2o0.04-0.15％、cacl20.04-0.15％、k2hpo4·3h2o0.2-0.5％、kh2po40.2-0.45％、余量为水。上述水合物原料的含量以含水重量计。
优选地，按重量百分比计，所述液体发酵培养基由包括以下原料制备而成：葡萄糖8％、豆饼粉3.2％、红景天粉4.8％、mgso4·3h2o0.06％、cacl20.06％、k2hpo4·3h2o0.39％、kh2po40.3％、余量为水。上述水合物原料的含量以含水重量计。
优选地，所述液体发酵培养基在使用前进行灭菌处理。
优选地，所述液体发酵培养基的ph值可由本领域技术人员根据本领域常规知识进行调整，在此，本发明不做特别限定。
优选地，所述红景天粉为红景天药材粉碎过80-100目筛后的细粉。所述红景天药材为常规市售产品。
在本发明所述的液体发酵培养基中，菌株生产红景天苷质量浓度由最初的9.0g/l提到18.1g/l，提高了近2倍。
该液体发酵培养基原料常见、价格低廉，选用微生物与红景天原药材共发酵，提高了红景天苷和总有效成分的含量，发酵周期短，条件温和，为工业化生产提供了理论依据，更为红景天等川藏中药材的保护性开发和利用开辟了一条新途径。
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)取红曲霉菌种，接种于液体种子培养基中，摇床培养，即得种子培养液；
(2)将步骤(1)制得的所述种子培养液接种到含有红景天的液体发酵培养基中，摇床发酵培养，得到发酵培养液；
(3)对步骤(2)制得的所述发酵培养液进行脱色、超滤以及除盐，收集滤液后，冻干，即得所述红景天苷。
所述红曲霉(monascuspurpureuswent)可通过市售购得，例如，可购自济南久益生物工程有限公司或通派(上海)生物科技有限公司。其中，红曲霉菌种还可通过紫外诱变、筛选，得到产量更高的菌种，在此，本发明不做特别限定。
优选地，按重量百分比计，所述液体种子培养基由包括以下原料制备而成：蛋白胨1.2-2％、葡萄糖2.5-3.5％、mg2so4·3h2o0.3-1.0％、余量为水。
优选地，按重量百分比计，所述液体种子培养基由包括以下原料制备而成：蛋白胨1.5％、葡萄糖3％、mg2so4·3h2o0.5％、余量为水。该液体种子培养基原料常见、价格低廉，营养充足。
优选地，所述液体种子培养基的ph值可由本领域技术人员根据本领域常规知识进行调整，在此，本发明不做特别限定。
优选地，步骤(1)中，所述摇床培养的温度为28-30℃，优选为28℃；培养时间为10-24小时，优选为12-15小时，更优选为12小时。该条件下的摇床培养能产生大量的菌体，使得菌体处于对数生长期。
本发明中的步骤(2)和步骤(2)中可以采用本领域常规的接种量进行接种，优选地，步骤(1)中，所述接种的接种量3-10％，优选为5％。
优选地，步骤(2)中，所述接种的接种量3-10％，优选为5％。即接种量为每升液体发酵培养基接种30-100ml(优选50ml)种子培养液。该接种量下，能够加快生长繁殖的速度，可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。
优选地，步骤(2)中，所述摇床发酵培养的温度为28-30℃，优选为28℃；培养时间为36-55小时，优选为42-50小时，更优选为48小时。该条件下的摇床发酵培养能够产生大量的次级代谢产物。
优选地，所述摇床培养和/或所述摇床发酵培养的转速为160-220r/min，优选为180r/min；
优选地，步骤(3)中，采用活性炭进行所述脱色。
优选地，所述脱色的脱色时间为42-60分钟，优选为45-50分钟，更优选为45分钟；脱色温度为68-72℃，优选为70℃；脱色ph值为4-5，优选为4；所述活性炭的用量为1％(g/100ml)-1.5％(g/100ml)，优选为1.5％(g/100ml)。
优选地，步骤(3)中，采用聚丙烯腈(pan)中空纤维膜进行所述超滤。更优选地，所述聚丙烯腈(pan)中空纤维膜为截留分子量为100kda的聚丙烯腈(pan)中空纤维膜。该超滤的产品截留率能够达到98％，超滤使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。
优选地，步骤(3)中，所述除盐为分子筛除盐；优选地，采用葡聚糖凝胶g-100进行所述分子筛除盐。
优选地，步骤(3)中，所述冻干在冷冻干燥机中进行，具体的干燥条件可采用常规选择，本发明对此不作特别限定。
作为本发明的一个优选的实施方案，本发明所述的红景天液体深层发酵生产红景天苷的方法包括以下步骤：
(1)取红曲霉菌种以3-10％的接种量接种于液体种子培养基中，在28-30℃的温度下摇床培养12-15小时，得种子培养液；其中，按重量百分比计，所述液体种子培养基由如下原料制备而成：蛋白胨1.2-2％、葡萄糖2.5-3.0％、mg2so4·3h2o0.3-1.0％、余量为水；
(2)将步骤(1)制得的所述种子培养液以3-10％的接种量接种到所述液体发酵培养基中，在28-30℃的温度下摇床发酵培养42-50小时，得到发酵培养液；按重量百分比计，所述液体发酵培养基由如下原料制备而成：葡萄糖6-10％、豆饼粉2-6％、红景天粉2.4-5％、mgso4·3h2o0.04-0.15％、cacl20.04-0.15％、k2hpo4·3h2o0.2-0.5％、kh2po40.2-0.45％、余量为水；
(3)在68-72℃的温度下，采用活性炭对步骤(2)制得的所述发酵培养液脱色45-60分钟；随后采用截留分子量为100kda的聚丙烯腈(pan)中空纤维膜进行超滤；然后采用葡聚糖凝胶g-100进行所述分子筛除盐，收集冻干，即得所述红景天苷。
本发明所述的红景天液体深层发酵生产红景天苷的方法具有以下优点：
1、微生物与红景天原药材共发酵，提高了红景天苷与总有效成分的含量，发酵周期短，条件温和，操作简单；
2、采用膜分离技术与葡聚糖凝胶分子筛层析技术相结合对发酵液进行分离纯化，能够以高收率得到高纯度的红景天苷。
附图说明
图1为实施例1的发酵过程中红景天苷产量及ph的变化曲线。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下各实施例中的原料均为常规市售产品，其中红景天药材购自太极集团四川德阳荣升药业有限公司；红曲霉购自济南久益生物工程有限公司。
实验例1
本实验例对所述红景天液体深层发酵生产红景天苷的方法中，不同的发酵时间进行实验，以确定合理的发酵时间。除发酵时间外，其他的发酵条件等均采用本发明提出的优选实验条件。具体地，本实验例采用以下步骤：
(1)取红曲霉菌种，接种于装有液体种子培养基的三角瓶中(菌种接种量为5％)，装量50ml/250ml，在28℃的温度下，以180r/min的转速摇床培养14小时，得种子培养液；其中，按重量百分比计，所述液体种子培养基由如下原料制备而成：蛋白胨1.5％、葡萄糖3％、mg2so4·3h2o0.5％、余量为水；
(2)将步骤(1)制得的所述种子培养液接种到液体发酵培养基中(接种量为每升液体发酵培养基接种50ml种子培养液)，在28℃的温度下，以180r/min的转速摇床发酵培养48小时，得到发酵培养液；其中，发酵培养过程中，每6小时取样一次，对ph、产量进行测定，确定产红景天苷的发酵过程，结果见图1；其中，按重量百分比计，所述液体发酵培养基由如下原料制备而成：葡萄糖5％、豆饼粉2％、mg2so4·3h2o0.06％、cacl20.06％、k2hpo4·3h2o0.39％、kh2po40.3％、红景天粉4.8％、余量为水；
(3)在70℃的温度下，采用活性炭对步骤(2)制得的所述发酵培养液脱色45分钟；随后采用截留分子量为100kda的聚丙烯腈(pan)中空纤维膜进行超滤；然后采用葡聚糖凝胶g-100进行所述分子筛除盐，收集滤液后，于冷冻干燥机中冻干，即得所述红景天苷。
试验结果表明，在36-42小时红景天苷生成量增长最快，在48小时后达到最多，然后平稳到55小时后有所下降。由图1可知选择42-50小时停止发酵比较合适，而48小时显示出最大的发酵量，因此后面实验统一采取48小时；发酵液的ph值随着红景天苷产量的变化而变化，红景天苷大量产生时，发酵液的ph值为5.5，可以由发酵液的ph变化了解红景天苷发酵过程，以便于发酵的测定。
实施例1
本实施例提供了一种红景天液体深层发酵生产红景天苷的方法。具体地，所述方法包括以下步骤：
(1)取红曲霉菌种，接种于液体种子培养基中(菌种接种量为5％)，装量50ml/250ml，在28℃的温度下摇床培养13小时，得种子培养液；其中，按重量百分比计，所述液体种子培养基由如下原料制备而成：蛋白胨1.5％、葡萄糖3％、mg2so4·3h2o0.5％、余量为水；
(2)将步骤(1)制得的所述种子培养液接种到1l液体发酵培养基中(接种量为每升液体发酵培养基接种50ml种子培养液)，在28℃的温度下摇床发酵培养48小时，得到发酵培养液；按重量百分比计，所述液体发酵培养基由如下原料制备而成：葡萄糖8％、豆饼粉3.2％、红景天粉4.8％、mgso4·3h2o0.06％、cacl20.06％、k2hpo4·3h2o0.39％、kh2po40.3％、余量为水。
(3)在70℃的温度下，采用活性炭对步骤(2)制得的所述发酵培养液脱色45分钟；随后采用截留分子量为100kda的聚丙烯腈(pan)中空纤维膜进行超滤；然后采用葡聚糖凝胶g-100进行所述分子筛除盐，收集滤液后，在冷冻干燥机中冻干，即得所述红景天苷。
本实施例中所制得的红景天苷的质量为18.1g。
实施例2
本实施例提供了一种红景天液体深层发酵生产红景天苷的方法。具体地，所述方法包括以下步骤：
(1)取红曲霉菌种，接种于液体种子培养基中(菌种接种量为5％)，装量50ml/250ml，在30℃的温度下摇床培养14小时，得种子培养液；其中，按重量百分比计，所述液体种子培养基由如下原料制备而成：蛋白胨1.5％、葡萄糖3％、mg2so4·3h2o0.05％、余量为水；
(2)将步骤(1)制得的所述种子培养液接种到1l液体发酵培养基中(接种量为每升液体发酵培养基接种50ml种子培养液)，在30℃的温度下摇床发酵培养12小时，得到发酵培养液；按重量百分比计，所述液体发酵培养基由如下原料制备而成：葡萄糖10％、豆饼粉4％、红景天粉2.4％、mg2so4·3h2o0.06％、cacl20.06％、k2hpo4·3h2o0.39％、kh2po40.3％、余量为水。
(3)在30℃的温度下，采用活性炭对步骤(2)制得的所述发酵培养液脱色45分钟；随后采用截留分子量为100kda的聚丙烯腈(pan)中空纤维膜进行超滤；然后采用葡聚糖凝胶g-100进行所述分子筛除盐，收集滤液后，在冷冻干燥机中冻干，即得所述红景天苷。
本实施例中所制得的红景天苷的质量为16.4g。
实施例3
本实施例提供了一种红景天液体深层发酵生产红景天苷的方法。具体地，所述方法包括以下步骤：
(1)取红曲霉菌种，接种于液体种子培养基中(菌种接种量为5％)，装量50ml/250ml，在30℃的温度下摇床培养15小时，得种子培养液；其中，按重量百分比计，所述液体种子培养基由如下原料制备而成：蛋白胨1.5％、葡萄糖3％、mg2so4·3h2o0.5％、余量为水；
(2)将步骤(1)制得的所述种子培养液接种到1l液体发酵培养基中(接种量为每升液体发酵培养基接种50ml种子培养液)，在30℃的温度下摇床发酵培养48小时，得到发酵培养液；按重量百分比计，所述液体发酵培养基由如下原料制备而成：葡萄糖6％、豆饼粉6％、红景天粉3.6％、mg2so4·3h2o0.15％、cacl20.06％、k2hpo4·3h2o0.39％、kh2po40.3％、余量为水；
(3)在70℃的温度下，采用活性炭对步骤(2)制得的所述发酵培养液脱色45分钟；随后采用截留分子量为100kda的聚丙烯腈(pan)中空纤维膜进行超滤；然后采用葡聚糖凝胶g-100进行所述分子筛除盐，收集滤液后，在冷冻干燥机中冻干，即得所述红景天苷。
本实施例中所制得的红景天苷的质量为16.45g。
实施例4
本实施例提供了一种红景天液体深层发酵生产红景天苷的方法。具体地，所述红景天液体深层发酵生产红景天苷的方法包括以下步骤：
(1)取红曲霉菌种，接种于液体种子培养基中(菌种接种量为5％)，装量50ml/250ml，在28℃的温度下摇床培养15小时，得种子培养液；其中，按重量百分比计，所述液体种子培养基由如下原料制备而成：蛋白胨1.5％、葡萄糖3％、mg2so4·3h2o0.5％、余量为水；
(2)将步骤(1)制得的所述种子培养液接种到1l液体发酵培养基中，在28℃的温度下摇床发酵培养46小时，得到发酵培养液；具体地，按重量百分比计，所述液体发酵培养基由如下原料制备而成：葡萄糖10％、豆饼粉4％、红景天粉6％、mgso4·3h2o0.06％、cacl20.06％、k2hpo4·3h2o0.39％、kh2po40.3％、余量为水；
(3)在70℃的温度下，采用活性炭对步骤(2)制得的所述发酵培养液脱色45分钟；随后采用截留分子量为100kda的聚丙烯腈(pan)中空纤维膜进行超滤；然后采用葡聚糖凝胶g-100进行所述分子筛除盐，收集滤液后，在冷冻干燥机中冻干，即得所述红景天苷。
本实施例中所制得的红景天苷的质量为15.09g。
实施例5
本实施例提供了一种红景天液体深层发酵生产红景天苷的方法。具体地，所述红景天液体深层发酵生产红景天苷的方法包括以下步骤：
(1)取红曲霉菌种，接种于液体种子培养基中(菌种接种量为5％)，装量50ml/250ml，在28℃的温度下摇床培养12小时，得种子培养液；其中，按重量百分比计，所述液体种子培养基由如下原料制备而成：蛋白胨1.5％、葡萄糖3％、mg2so4·3h2o0.5％、余量为水；
(2)将步骤(1)制得的所述种子培养液接种到1l液体发酵培养基中(接种量为每升液体发酵培养基接种50ml种子培养液)，在28℃的温度下摇床发酵培养50小时，得到发酵培养液；按重量百分比计，所述液体发酵培养基由如下原料制备而成：葡萄糖6％、豆饼粉4％、红景天粉2.4％、mgso4·3h2o0.06％、cacl20.06％、k2hpo4·3h2o0.39％、kh2po40.3％、余量为水；
(3)在70℃的温度下，采用活性炭对步骤(2)制得的所述发酵培养液脱色45分钟；随后采用截留分子量为100kda的聚丙烯腈(pan)中空纤维膜进行超滤；然后采用葡聚糖凝胶g-100进行所述分子筛除盐，收集滤液后，在冷冻干燥机中冻干，即得所述红景天苷。
本实施例中所制得的红景天苷的质量为15.80g。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。