β-葡萄糖苷酶交联聚集体催化合成红景天苷的工艺的制作方法
【专利摘要】本发明提供β-葡萄糖苷酶交联聚集体催化合成红景天苷的工艺，其中，红景天苷合成阶段的反应条件为：反应体系为1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（C4MIm·PF6）/1,4-二氧六环/缓冲溶液，β-葡萄糖苷酶交联聚集体的单位酶活为1.3~1.6U/ml，C4MIm·PF6与1,4-二氧六环的体积比为2:3~3:2，缓冲溶液的体积分数为12~18%；反应温度为48~52℃，转速为245~255rpm，反应5~9d。本发明能够大幅提高产物红景天苷的浓度，且可保持较高的β-葡萄糖苷酶交联聚集体残余相对酶活。
【专利说明】β-葡萄糖苷酶交联聚集体催化合成红景天苷的工艺
【技术领域】
[0001]本发明属于酶催化合成红景天苷领域，尤其是一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体(简称:β -葡萄糖苷酶CLEAs)催化合成红景天苷的工艺。
【背景技术】
[0002]红景天苷是具有特殊生理功能的化合物，它在抗细胞缺氧、抗肿瘤、增强机体免疫力等方面均有良好效果。由于生物合成红景天苷具有选择性高、反应条件温和、产物纯度较高、产品便于分离纯化等优点，因此受到普遍关注。
[0003]鉴于酶催化合成红景天苷的反应时间比植物组织培养和细胞培养时间都要短很多，并且，反应过程无需昂贵的糖苷供体和催化剂，避免了化学合成繁琐的反应步骤，另外，反应完成后可以方便的从反应液中提取目标产物红景天苷，未反应的底物对羟基苯乙醇可再次循环使用，降低生产成本，因此，酶催化合成红景天苷为红景天苷批量生产具有非常大的经济意义和现实意义。
[0004]由于红景天苷在糖苷酶的存在下极易被水解，而生物合成红景天苷过程中所需的酶又需要水环境来保持其活性，即保持较高的红景天苷合成效率，因此，如何实现保持酶活性与抑制红景天苷水解的平衡点，成为了一大难题。陈磊在其硕士学位论文“西梅籽β_葡萄糖苷酶的分离纯化、性质及固定化研究”一文中提到了关于β -葡萄糖苷酶交联聚集体在合成红景天苷中的应用，其结论是:以β_葡萄糖苷酶交联聚集体为催化剂催化合成红景天苷的反应中，产物红景天苷的浓度大约为0.76 g/L，仅比采用粗酶粉催化合成红景天苷的产物红景天苷浓度高0.1 g/L。王梦亮等人于2009年发表了一篇“固定化β-葡萄糖苷酶催化合成红景天苷的研究”的文章，在1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐(C4MIm WF6)离子液体/1，4- 二氧六环作为反应介质，C4MIm.PF6 /I, 4- 二氧六环为99% (ν/ν),经过条件优化后，红景天苷产物浓度可达18.57 g/L，此为现阶段国内外生物合成红景天苷领域红景天苷浓度可达到的最高值。但是，产物红景天苷的浓度依然较低，无法满足工业化生产对经济利益最大化的需求，并且，酶活`回收率较低。
【发明内容】
[0005]本发明旨在提供一种能够大幅提高产物红景天苷浓度的β_葡萄糖苷酶交联聚集体(简称:β -葡萄糖苷酶CLEAs)催化合成红景天苷的工艺，本发明反应过程无需昂贵的糖苷供体和催化剂，避免了化学合成繁琐的反应步骤，另外，反应完成后可以方便的从反应液中提取目标产物红景天苷，未反应的底物对羟基苯乙醇可再次循环使用，降低生产成本，因此，酶催化合成红景天苷为红景天苷批量生产具有非常大的经济意义和现实意义。
[0006]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
β-葡萄糖苷酶交联聚集体催化合成红景天苷的工艺，包括β -葡萄糖苷酶交联聚集体的制备和红景天苷的合成两个阶段；
β_葡萄糖苷酶交联聚集体制备阶段，包括以下步骤:(1)将沉降剂加入β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡；
(2)再加入戊二醛；
(3)向混合液中加入硼氢化钠,振荡,30(T500rpm离心5~10min,收集沉淀，即为β-葡萄糖苷酶交联聚集体；
红景天苷的合成阶段，包括以下步骤:
(4)将β-D-葡萄糖和对羟基苯乙醇溶解于含β-葡萄糖苷酶交联聚集体的pH为
5.5飞.5的缓冲溶液中，再加入1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐和1，4-二氧六环，形成1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐/1，4- 二氧六环/缓冲溶液反应体系；
(5)密封，保持温度为48~52°C，转速为245~255rpm，反应5~9d，收集反应液；
其中，步骤(4)的1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐/1，4_ 二氧六环/缓冲溶液反应体系中，β-D-葡萄糖与对羟基苯乙醇的摩尔比为1: f 1:3，β-葡萄糖苷酶交联聚集体的单位酶活为1.3^1.6U/ml，1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐与1，4- 二氧六环的体积比为2:3^3:2,缓冲溶液的体积分数为12~18%。
[0007]步骤(1)中所述的沉降剂为1，4-二氧六环，其中1，4-二氧六环与β-葡萄糖苷酶液体积比为1.7: f 2.2:1，β-葡萄糖苷酶液含葡萄糖苷酶1.5~2.5mg/ml ;步骤(2)中戊二醛的终浓度为38~43mM，交联时间为8~12min ;步骤(3)中硼氢化钠的终浓度为20-25πιΜ;β-葡萄糖苷酶交联聚集体制备阶段整个反应过程的反应温度控制在4~6°C，pH为
5.0~5.5。
[0008]本发明采用β_葡萄糖苷酶交联聚集体作为合成红景天苷的催化剂，在离子液体/有机溶剂体系中催化直接糖基化反应成功合成红景天苷。本发明的技术效果在于:(1)将产物红景天苷的浓度提高至22g/L以上；(2)采用β -葡萄糖苷酶交联聚集体作为催化剂，葡萄糖苷酶交联聚集体的残余相对酶活高，制作简单，同时，葡萄糖苷酶交联聚集体通过离心即可实现高效回收，酶的回收作业简单、快捷；(3)降低了离子液体(1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐)的使用量，从而降低了生产成本。在酶催化合成红景天苷领域，由于红景天苷在糖苷酶存在下极易被水解的特性，使得提高产物红景天苷的浓度变得十分困难。
[0009]本发明能够得到如此高的产物红景天苷浓度，不仅仅在于β -葡萄糖苷酶交联聚集体在离子液体/有机溶剂体系中的酶催化效率高；还在于，本 申请人:进行无数次试验，得到了红景天苷合成过程中各个反应条件的较佳值，最终，才使得本发明的产物红景天苷浓度达到22 g/L以上，高于现有的国内外所报道的最高值(18.57g/L)，并且，β-葡萄糖苷酶交联聚集体的残余相对酶活也保持在较高的水平(90%以上)，另外，葡萄糖苷酶交联聚集体的制备过程中采用了 1，4-二氧六环，而离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐与沉降剂1，4-二氧六环的组合使用也产生了意料之外的技术效果，再加上本 申请人:通过对β-葡萄糖苷酶交联聚集体的制备过程中各个反应条件进行了优化，提高了 β -葡萄糖苷酶交联聚集体的酶活回收率。
【具体实施方式】
[0010]根据β -葡萄糖苷酶交联聚集体(简称β -葡萄糖苷酶CLEAs )催化合成红景天苷的工艺，进行实施例广实施例7。[0011]实施例1
β -葡萄糖苷酶CLEAs催化合成红景天苷的工艺，包括β -葡萄糖苷酶CLEAs的制备和红景天苷合成两个阶段；
β-葡萄糖苷酶CLEAs的制备阶段，包括以下步骤:(I)将2.2ml 1，4-二氧六环加入Iml含β -葡萄糖苷酶1.5mg/ml的β -葡萄糖苷酶溶液中(1，4- 二氧六环与β -葡萄糖苷酶液的体积比为2.2:1)，振荡；(2)再加入戊二醛，至其终浓度为40mM，反应lOmin，进行交联；(3)向混合液中加入硼氢化钠(NaBH4),至NaBH4的终浓度为20 mM,进行还原，振荡后，300rpm离心8min,收集沉淀，即为β -葡萄糖苷酶CLEAs ;整个反应过程的反应温度控制在4°C, pH为5.5 ;收集沉淀，测得β -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率为81.65%。
[0012]红景天苷的合成阶段，包括以下步骤:(4)将0.110 g β-D-葡萄糖和0.169 g对羟基苯乙醇(β-D-葡萄糖与对羟基苯乙醇的摩尔比为1:2)溶解在含β-葡萄糖苷酶CLEAs的pH为6.5的缓冲溶液中，再加入376 μ L 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐(C4MIm.PF6)和564 μ L I, 4_ 二氧六环(C4MIm.PF6与I, 4- 二氧六环的体积比为2:3),形成C4MIm.PF6/1, 4- 二氧六环/缓冲溶液反应体系，在C4MIm.PF6/1, 4- 二氧六环/缓冲溶液反应体系中，β -葡萄糖苷酶CLEAs的单位酶活为1.47U/ml，缓冲溶液的体积分数为15% ；
(5)密封，保持温度为52°C，转速为245~255 rpm，反应8d，收集反应液。测得反应液中红景天苷的浓度为24.52g/L ;将反应液离心，收集沉淀，测得反应后β -葡萄糖苷酶CLEAs的残余相对酶活为92.07%。
[0013]β-葡萄糖苷酶CLEAs的回收处理方式为:反应液离心后，将收集得到的葡萄糖苷酶CLEAs沉淀以缓冲溶液(pH为6.0的柠檬酸-Na2HPO4缓冲溶液)洗涤3次，再分别加入ImL缓冲溶液(pH为6.0的柠檬酸-Na2HPO4缓冲溶液)并振荡使之成为悬浊液，取样测定葡萄糖苷酶CLEAs的酶活。以不经沉降剂、交联剂处理的酶液的酶活为100%，计算β -葡萄糖苷酶CLEAs制备阶段得到的β -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率。以红景天苷合成阶段前葡萄糖苷酶的相对水解活力为100%，计算收集得到的反应液沉淀中β-葡萄糖苷酶的残余相对酶活。
[0014]β -葡萄糖苷酶的酶活测定方法为:分别取100 μ L待测β -葡萄糖苷酶CLEAs溶液与10 mM的2 mL对硝基苯基-β -D-葡萄糖苷(pNPG)溶液，二者混合后50°C水浴精确保温10 min，之后立即加入I M的碳酸钠溶液2 mL以终止反应，振荡均匀后室温静置5 min,适当稀释后以紫外分光光度计测定样本在波长410 nm处的吸光值，代入pNP标准曲线计算可得PNP生成量。酶活力单位定义为:每分钟内催化pNPG生成IymoL pNP的酶量。其中，PNP标准曲线制作过程为本领域常见的标准曲线制作方法，在此不做赘述。
[0015] 红景天苷浓度的测定方法为:将含有红景天苷的上清液，以孔径0.45 μ m的有机滤膜过滤，滤液以甲醇稀释一定倍数后以高效液相色谱仪对样本中红景天苷含量进行测定。所测定的红景天苷峰面积代入红景天苷标准曲线中加以计算即可得样本中红景天苷浓度。其中，红景天苷标准曲线制作过程为本领域常见的标准曲线制作方法，在此不做赘述。
[0016]实施例2
β -葡萄糖苷酶CLEAs催化合成红景天苷的工艺，包括β -葡萄糖苷酶CLEAs的制备和红景天苷合成两个阶段；
β -葡萄糖苷酶CLEAs的制备阶段，包括以下步骤:(I)将1.7ml I, 4- 二氧六环加入Iml含β -葡萄糖苷酶2.5mg/ml的β -葡萄糖苷酶溶液中(1，4- 二氧六环与β -葡萄糖苷酶液的体积比为1.7:1)，振荡；(2)再加入戊二醛，至其终浓度为38mM，反应12min，进行交联；(3)向混合液中加入硼氢化钠(NaBH4)，至NaBH4的终浓度为25mM，进行还原，振荡后，500rpm离心5min,收集沉淀，即为β -葡萄糖苷酶CLEAs ;整个反应过程的反应温度控制在6°C,pH为5.2 ;收集沉淀，测得β -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率为81.71%。
[0017]红景天苷的合成阶段，包括以下步骤:(4)将0.220 g β-D-葡萄糖和0.169 g对羟基苯乙醇(β-D-葡萄糖与对羟基苯乙醇的摩尔比为1:1)溶解在含葡萄糖苷酶CLEAs的pH为5.5的缓冲溶液中，再加入470 μ L C4MIm.PF6和470 μ L 1，4-二氧六环(C4MIm.PF6与I, 4- 二氧六环的体积比为1:1)，形成C4MIm.PF6/1, 4- 二氧六环/缓冲溶液反应体系，在C4MIm.PF6/1, 4- 二氧六环/缓冲溶液反应体系中，β _葡萄糖苷酶CLEAs的单位酶活为1.35U/ml，缓冲溶液的体积分数为18% ; (5)密封，保持温度为48°C，转速为245^255 rpm,反应9d，收集上清液。测得反应液中红景天苷的浓度为22.91 g/L ;将反应液离心，收集沉淀，测得反应后β -葡萄糖苷酶CLEAs的残余相对酶活为90.01%。
[0018]实施例3
β -葡萄糖苷酶CLEAs催化合成红景天苷的工艺，包括β -葡萄糖苷酶CLEAs的制备和红景天苷合成两个阶段；
β-葡萄糖苷酶CLEAs的制备阶段，包括以下步骤:(I)将2.0ml 1，4-二氧六环加入Iml含β -葡萄糖苷酶1.5mg/ml的β -葡萄糖苷酶溶液中(1，4- 二氧六环与β -葡萄糖苷酶液的体积比为2:1)，振荡；(2)再加入戊二醛，至其终浓度为43mM，反应8min，进行交联；(3)向混合液中加入硼氢化钠(NaBH4),至NaBH4的终浓度为23 mM,进行还原，振荡后，300rpm离心IOmin,收集沉淀，即为β -葡萄糖苷酶CLEAs ;整个反应过程的反应温度控制在4~6°C，pH为5.0 ;收集沉淀，测得β -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率为80.59%。
`[0019]红景天苷的合成阶段，包括以下步骤:(4)将0.110 g β-D-葡萄糖和0.254 g对羟基苯乙醇(β-D-葡萄糖与对羟基苯乙醇的摩尔比为1:3)溶解在含β-葡萄糖苷酶CLEAs的pH为6.0的缓冲溶液中，再加入564 μ L C4MIm^PFdPSTeyL 1，4-二氧六环(C4MIm *PF6与1，4- 二氧六环的体积比为3:2)，形成C4MIm *PF6/1, 4- 二氧六环/缓冲溶液反应体系，在C4MIm.PF6/1, 4- 二氧六环/缓冲溶液反应体系中，β _葡萄糖苷酶CLEAs的单位酶活为1.64U/ml，缓冲溶液的体积分数为12% ; (5)密封，保持温度为50°C，转速为250rpm,反应5d,收集反应液。测得反应液中红景天苷的浓度为24.11 g/L,离心,收集沉淀,测得反应后β -葡萄糖苷酶CLEAs的残余相对酶活为90.38%。
[0020]实施例4
β -葡萄糖苷酶CLEAs催化合成红景天苷的工艺，包括β -葡萄糖苷酶CLEAs的制备和红景天苷合成两个阶段；
β-葡萄糖苷酶CLEAs的制备阶段，包括以下步骤:(I)将4.0ml 1，4-二氧六环加入Iml含β -葡萄糖苷酶1.25mg/ml的β -葡萄糖苷酶溶液中(1，4- 二氧六环与β -葡萄糖苷酶液的体积比为4:1)，振荡；(2)再加入戊二醛，至其终浓度为30mM，反应lOmin，进行交联；(3)向混合液中加入硼氢化钠(NaBH4)，至NaBH4的终浓度为30mM，进行还原，振荡后，400rpm离心5min,收集沉淀，即为β -葡萄糖苷酶CLEAs ;整个反应过程的反应温度控制在5°C，pH为5.0 ;收集沉淀，测得β -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率为74.37%。[0021]红景天苷的合成阶段，包括以下步骤:(4)将0.110 g β-D-葡萄糖和0.254 g对羟基苯乙醇(β-D-葡萄糖与对羟基苯乙醇的摩尔比为1:3)溶解在含β-葡萄糖苷酶CLEAs的pH为6.0的缓冲溶液中，再加入564 μ L C4MIm^PFdPSTeyL 1，4-二氧六环(C4MIm *PF6与1，4- 二氧六环的体积比为3:2)，形成C4MIm *PF6/1, 4- 二氧六环/缓冲溶液反应体系，在C4MIm.PF6/1, 4- 二氧六环/缓冲溶液反应体系中，β _葡萄糖苷酶CLEAs的单位酶活为1.64U/ml，缓冲溶液的体积分数为12% ; (5)密封，保持温度为50°C，转速为250rpm,反应5d，收集反应液。测得反应液中红景天苷的浓度为23.24 g/L,离心，收集沉淀，测得反应后β -葡萄糖苷酶CLEAs的残余相对酶活为90.62%。
[0022]实施例5
β -葡萄糖苷酶CLEAs催化合成红景天苷的工艺，包括β -葡萄糖苷酶CLEAs的制备和红景天苷合成两个阶段；
β -葡萄糖苷酶CLEAs的制备阶段，包括以下步骤:(I)将1.5mll, 4-二氧六环加入Iml含β -葡萄糖苷酶3.0mg/ml的β -葡萄糖苷酶溶液中(1，4- 二氧六环与β -葡萄糖苷酶液的体积比为1.5:1)，振荡；(2)再加入戊二醛，至其终浓度为20mM，反应12min，进行交联；
(3)向混合液中加入硼氢化钠(NaBH4),至NaBH4的终浓度为15mM，进行还原，振荡后，500rpm离心8min，收集沉淀，即为β -葡萄糖苷酶CLEAs ;整个反应过程的反应温度控制在4°C，pH为5.0 ;收集沉淀，测得β -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率为69.57%。
[0023]红景天苷的合成阶段，包括以下步骤:(4)将0.110 g β-D-葡萄糖和0.169 g对羟基苯乙醇(β-D-葡萄糖与对羟基苯乙醇的摩尔比为1:2)溶解在含β-葡萄糖苷酶CLEAs的pH为6.0的缓冲溶液中，再加入470 μ L C4MIm.PF6和470 μ L 1，4-二氧六环(C4MIm *PF6与1，4- 二 氧六环的体积比为1:1)，形成C4MIm *PF6/1, 4- 二氧六环/缓冲溶液反应体系，在C4MIm.PF6/1, 4- 二氧六环/缓冲溶液反应体系中，β _葡萄糖苷酶CLEAs的单位酶活为1.47U/ml，缓冲溶液的体积分数为15% (v: v); (5)密封，保持温度为50°C，转速为255 rpm，反应8d，收集反应液。测得反应液中红景天苷的浓度为22.97 g/L，离心，收集沉淀，测得反应后β -葡萄糖苷酶CLEAs的残余相对酶活为91.32%。
[0024]实施例6
β -葡萄糖苷酶CLEAs催化合成红景天苷的工艺，包括β -葡萄糖苷酶CLEAs的制备和红景天苷合成两个阶段；
β -葡萄糖苷酶CLEAs的制备阶段，包括以下步骤:(I)将4.0ml异丙醇加入Iml含β -葡萄糖苷酶1.25mg/ml的β -葡萄糖苷酶溶液中(1，4- 二氧六环与β -葡萄糖苷酶液的体积比为4:1)，振荡；(2)再加入戊二醛，至其终浓度为30mM，反应lOmin，进行交联；(3)向混合液中加入硼氢化钠(NaBH4),至NaBH4的终浓度为30mM，进行还原，振荡后，400rpm离心5min，收集沉淀，即为β-葡萄糖苷酶CLEAs ;整个反应过程的反应温度控制在5 °C，pH为
5.0 ;收集沉淀，测得β -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率为72.53%。
[0025]红景天苷的合成阶段，包括以下步骤:(4)将0.110 g β-D-葡萄糖和0.254 g对羟基苯乙醇(β-D-葡萄糖与对羟基苯乙醇的摩尔比为1:3)溶解在含β-葡萄糖苷酶CLEAs的pH为6.0的缓冲溶液中，再加入564 μ L C4MIm^PFdPSTeyL 1，4-二氧六环(C4MIm *PF6与1，4- 二氧六环的体积比为3:2)，形成C4MIm *PF6/1, 4- 二氧六环/缓冲溶液反应体系，在C4MIm.PF6/!, 4- 二氧六环/缓冲溶液反应体系中，β _葡萄糖苷酶CLEAs的单位酶活为1.64U/ml，缓冲溶液的体积分数为12% ; (5)密封，保持温度为50°C，转速为250rpm,反应5d，收集反应液。测得反应液中红景天苷的浓度为22.01 g/L,离心，收集沉淀，测得反应后β -葡萄糖苷酶CLEAs的残余相对酶活为89.12%。
[0026]实施例7
β -葡萄糖苷酶CLEAs催化合成红景天苷的工艺，包括β -葡萄糖苷酶CLEAs的制备和红景天苷合成两个阶段；
β-葡萄糖苷酶CLEAs的制备阶段，包括以下步骤:(I)将1.5ml 1，4-二氧六环加入Iml含β -葡萄糖苷酶3.0mg/ml的β -葡萄糖苷酶溶液中(1，4- 二氧六环与β -葡萄糖苷酶液的体积比为1.5:1)，振荡；(2)再加入戊二醛，至其终浓度为20mM，反应8min，进行交联；(3)向混合液中加入硼氢化钠(NaBH4)，至NaBH4的终浓度为15mM，进行还原，振荡后，400rpm离心5min,收集沉淀，即为β -葡萄糖苷酶CLEAs ;整个反应过程的反应温度控制在6°C，pH为5.0 ;收集沉淀，测得β -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率为69.57% ；
红景天苷的合成阶段，包括以下步骤:(4)将0.110 g β-D-葡萄糖和0.169 g对羟基苯乙醇(β-D-葡萄糖与对羟基苯乙醇的摩尔比为1:2)溶解在含β-葡萄糖苷酶CLEAs的pH为6.0的缓冲溶液中，再加入855 μ L C4MIm.PF6和85 μ L I，4-二氧六环(C4MIm.PF6与1，4- 二氧六环的体 积比为10:1)，形成C4MIm.PF6/1, 4- 二氧六环/缓冲溶液反应体系，在C4MIm.ΡΡ6/1，4- 二氧六环/缓冲溶液反应体系中，β _葡萄糖苷酶CLEAs的单位酶活为
1.47U/ml，缓冲溶液的体积分数为15% ;(5)密封，保持温度为50°C，转速为250 rpm，反应8d，收集反应液。测得反应液中红景天苷的浓度为18.31 g/L，离心，收集沉淀，测得β-葡萄糖苷酶CLEAs的残余相对酶活为87.43%。
[0027]上述实施例7的步骤(4)中的C4MIm *PF6: 1，4_ 二氧六环为10:1 (V: V),远远高于实施例1飞的步骤(4)中C4MIm.PF6/1, 4-二氧六环(V: V)的比值,而对于本领域普通技术人员来说，一般认为C4MIm -PF6的浓度越高，底物的溶解性越好，糖苷酶(即β -葡萄糖苷酶)的热稳定性或是有机溶剂耐受性就越好，因此，产物红景天苷的浓度也就越高，因此，现有技术中C4MIm.PF6: 1，4-二氧六环均在4:1 (v: V)以上,但是,本 申请人:突破常规思维，降低了 C4MIm ^PF6所占的比例，得到了未意料到的技术效果，不仅提高了产物红景天苷的浓度，维持了较高的葡萄糖苷酶CLEAs的残余相对酶活，并且，还大大降低了生产成本。另外，实施例6与实施例4的不同之处在于:步骤(1)中沉降剂为异丙醇，而非实施例4的1，4- 二氧六环，从实施例6与实施例4的试验结果可看出:在其他条件不变的情况下，选用1，4-二氧六环作为沉降剂时，β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率更高，并且，由于在葡萄糖苷酶CLEAs的制备阶段中，β-葡萄糖苷酶对1，4-二氧六环产生了耐受，使得实施例4中所得到的反应液的红景天苷浓度和β -葡萄糖苷酶CLEAs的残余相对酶活相对于实施例6分别提高了 1.23 g/L和1.5%。
[0028]本发明能够得到如此高的产物红景天苷浓度，不仅仅在于β -葡萄糖苷酶交联聚集体在离子液体/有机溶剂体系中的酶催化效率高；还在于，本 申请人:进行无数次的试验，得到了红景天苷合成过程中各个反应条件的较佳值，最终，才使得本发明的产物红景天苷浓度达到22 g/L以上，高于现有的国内外所报道的最高值(18.57g/L)，并且，β-葡萄糖苷酶交联聚集体的残余相对酶活也保持在较高的水平(89%以上)；另外，β-葡萄糖苷酶交联聚集体的制备过程中采用了 1，4-二氧六环，而离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐与沉降剂1，4-二氧六环的组合使用也产生了意料之外的技术效果；再加上本 申请人:通过对β_葡萄糖苷酶交联聚集体的制备过程中各个反应条件进行了优化，提高了 β_葡萄糖苷酶交联聚集体的酶活回收率。
[0029]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范·围。
【权利要求】
1.β-葡萄糖苷酶交联聚集体催化合成红景天苷的工艺，其特征在于:包括β-葡萄糖苷酶交联聚集体的制备和红景天苷的合成两个阶段； β -葡萄糖苷酶交联聚集体制备阶段，包括以下步骤: (1)将沉降剂加入β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡； (2)再加入戊二醛； (3)向混合液中加入硼氢化钠,振荡,30(T500rpm离心5~10min,收集沉淀，即为β-葡萄糖苷酶交联聚集体； 红景天苷的合成阶段，包括以下步骤: (4)将β-D-葡萄糖和对羟基苯乙醇溶解于含β-葡萄糖苷酶交联聚集体的pH为5.5飞.5的缓冲溶液中，再加入1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐和1，4-二氧六环，形成1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐/1，4- 二氧六环/缓冲溶液反应体系； (5)密封，保持温度为48~52°C，转速为245~255rpm，反应5~9d，收集反应液； 其中，步骤(4)的1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐/1，4_ 二氧六环/缓冲溶液反应体系中，β-D-葡萄糖与对羟基苯乙醇的摩尔比为1: f 1:3，β-葡萄糖苷酶交联聚集体的单位酶活为1.3^1.6U/ml，1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐与1，4- 二氧六环的体积比为2:3^3:2,缓冲溶液的体积分数为12~18%。
2.根据权利要求1所述的一种β_葡萄糖苷酶交联聚集体催化合成红景天苷的工艺，其特征在于:步骤(1)中所述的沉降剂为1，4-二氧六环，其中1，4-二氧六环与β-葡萄糖苷酶液体积比为1.7: f 2.2:1，β-葡萄糖苷酶液含葡萄糖苷酶1.5~2.5mg/ml ;步骤(2)中戊二醛的终浓度为38~43mM，交联时间为8~12min ;步骤(3)中硼氢化钠的终浓度为20-25 πΜ；β-葡萄糖苷酶交联聚集体制备阶段整个反应过程的反应温度控制在4-6?，pH为 5.0~5.5。
【文档编号】C12P19/44GK103710412SQ201310664189
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】石贤爱, 薛原楷 申请人:福州大学