氮运输基因OsNPF7.4在水稻选育中的应用的制作方法

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及氮运输基因osnpf7.4在水稻选育中的应用。

背景技术：

植物通过吸收土壤中的氨、硝酸根、氨基酸、可溶性肽等来获得氮素；氮的吸收和转运主要依靠铵根运输蛋白（amt）、硝酸根运输蛋白（nrt）、氨基酸运输蛋白（aat）、肽运输蛋白（ptr）等运输蛋白来完成（williamsl,millera.transportersresponsiblefortheuptakeandpartitioningofnitrogenoussolutes.annualreviewofplantphysiologyandplantmolecularbiology,2001,52:659-688.）。铵通过植物amt吸收后再通过谷氨酰胺合成酶（gs）和谷氨酸合酶（gogat）合成谷氨酰胺和谷氨酸，后者再进一步形成其它氨基酸（sonoday,ikedaa,saikis,etal.feedbackregulationoftheammoniumtransportergenefamilyamt1byglutamineinrice.plantcellphysiology,2003,44:1396-1402.）。植物可通过高亲和转运系统（hats）的nrt2和低亲和转运系统（lats）的nrt1吸收环境中的硝酸盐，由硝酸还原酶（nr）和亚硝酸还原酶（nir）还原形成铵，再进一步形成氨基酸（paungfoo-lonhiennec,lonhiennetg,rentschd,etal.plantscanuseproteinasanitrogensourcewithoutassistancefromotherorganisms.proceedingsofthenationalacademyofsciences,2008,105:4524-4529.）。

氮运输npf家族包括nrt1和ptr亚家族，不同成员在植株不同部位运输硝酸根、寡肽或氨基酸等，在植株生长发育上起不同的作用（rentschd,schmidts,tegederm.transportersforuptakeandallocationoforganicnitrogencompoundsinplants.febsletters,2007,581:2281-2289.）。osnpf2.2介导了木质部硝酸根的卸载，影响水稻生长和种子灌浆结实（liy,ouyangj,wangyy,etal.disruptionofthericenitratetransporterosnpf2.2hindersroot-to-shootnitratetransportandvasculardevelopment.scientificreports,2015,5:9635.）。osnpf7.2对硝酸根有低亲和运输，能够影响植株生长（hur,qiud,cheny,etal.knock-downofatonoplastlocalizedlow-affinitynitratetransporterosnpf7.2affectsricegrowthunderhighnitratesupply.frontiersinplantscience,2016,7.）。

虽然已知氮营养可以促进植物生长发育，但是氮营养影响了植株什么类型的生长发育目前还没有系统的了解。另外水稻npf家族有80多个成员，氮营养是通过npf基因家族什么成员进行响应，在什么部位介导了氮营养运输，从而影响了植株什么类型的生长发育，目前也几乎未知。所以，挖掘出npf家族中可能具有氮高效运输基因，特别是能够控制水稻株型的氮运输关键基因，将有利于水稻高产品种的培育。本发明通过长期研究后发现，npf家族osnpf7.4基因对水稻分蘖有重要的负调控作用，该基因通过干扰和基因敲除后，可培育出无转基因标记的水稻，直接应用于植物株型改良，从而使水稻增产。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供氮运输基因osnpf7.4在水稻选育中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明以水稻的氮运输基因osnpf7.4为对象，从水稻中花11中克隆了osnpf7.4的cdna序列。通过rnai技术构建osnpf7.4基因干扰表达载体，采用农杆菌eha105介导的遗传转化方法，将干扰表达载体导入正常粳稻品种中花11中，得到osnpf7.4基因表达量下降的干扰植株，干扰植株的分蘖数、有效穗数和灌浆粒数与对照野生型中花11相比显著提高。同时构建了osnpf7.4基因超表达载体，将超表达载体导入中花11中，得到osnpf7.4基因超表达植株，其分蘖数、有效穗数和灌浆粒数与中花11相比显著降低。这些结果表明，通过降低osnpf7.4基因表达，可以使正常的水稻分蘖数、每株有效穗数增加，每株灌浆粒数增加，从而提高水稻产量。

基于本发明发现的osnpf7.4基因的功能，其可用于水稻选育中。所述的水稻选育为提高水稻分蘖数、有效穗数和灌浆粒数，从而提高水稻产量。具体可通过rnai技术降低osnpf7.4基因的表达或用crispr等基因编辑技术敲除osnpf7.4基因，使水稻分蘖数、有效穗数和灌浆粒数增加，达到提高水稻产量的目的。所述的osnpf7.4基因编码的osnpf7.4蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示；所述的osnpf7.4基因的cdna序列优选如seqidno.2所示。

应该理解为，在不影响osnpf7.4蛋白活性的前提下（即不在蛋白的活性中心），本领域技术人员可对seqidno.1所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。因此，osnpf7.4蛋白还包括seqidno.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸获得的具有同等活性的蛋白质。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明的优点和效果：

（1）本发明克隆的osnpf7.4基因干扰表达后使水稻分蘖能力增强，说明osnpf7.4基因对提高水稻分蘖数有明显影响，因此，通过基因工程技术降低osnpf7.4基因的表达能够提高植物产量。这不仅有助于通过正常施氮条件下培育高产水稻，还可以通过结合基因编辑技术和分子育种进行植物的品种改良。

（2）osnpf7.4基因的成功克隆，进一步证实了npf家族在氮吸收过程中的重要作用，对阐明氮运输家族的生物学功能有重要的意义，另外对进一步了解植物氮代谢途径，提高氮吸收效率有极大的推动作用。

（3）尽管目前已克隆到了一些提高植物产量的基因，但对植物增产的分子机制仍不清楚。而本发明克隆的osnpf7.4基因能够提高水稻的分蘖数、有效穗数和灌浆粒数，对确定植物增产的关键因素有极大的推动作用。

附图说明

图1是对照中花11、osnpf7.4基因超表达植株2个株系和osnpf7.4基因干扰植株2个株系的整株表型图。

图2是对照中花11、osnpf7.4基因超表达植株2个株系和osnpf7.4基因干扰植株2个株系分蘖数的统计柱状图，数据采用spss软件进行变量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，不同组别星号（*）表示与对照相比具有差异显著。

图3是对照中花11、osnpf7.4基因超表达植株2个株系和osnpf7.4基因干扰植株2个株系有效穗数的统计柱状图，数据采用spss软件进行变量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，不同组别星号（*）表示与对照相比具有差异显著。

图4是对照中花11、osnpf7.4基因超表达植株2个株系和osnpf7.4基因干扰植株2个株系的每株种子灌浆粒数表型图。

图5是对照中花11、osnpf7.4基因超表达植株2个株系和osnpf7.4基因干扰植株2个株系的每株种子灌浆粒数统计图，数据采用spss软件进行变量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，不同组别星号（*）表示与对照相比具有差异显著。

图6是对照中花11、osnpf7.4基因超表达植株2个株系和osnpf7.4基因干扰植株2个株系表达量的统计柱状图，数据采用spss软件进行变量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，不同组别星号（*）表示与对照相比具有差异显著。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术（参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约）完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1osnpf7.4基因干扰植株的构建

提取水稻中花11的rna，并将其反转录成cdna，利用引物对：

f1：5'-ggtaccacgccatggagagaggccagca-3'（kpni），

r1：5'-ggatccaggtgaccagcaccatgccca-3'（bamhi）；

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r2：5'-gagctcaggtgaccagcaccatgccca-3'（saci）；

各自pcr扩增出osnpf7.4基因的cdna片段，通过相应的限制性内切酶酶切后连入ptck303载体，构建出osnpf7.4基因的干扰表达载体osnpf7.4-ptck303。采用农杆菌eha105介导的遗传转化方法，将干扰表达载体导入正常粳稻品种中花11中。

将得到的所有转基因小苗移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待小苗长高约10cm时，种于大田中，待苗长大后，提取基因组dna通过pcr对转基因植株进行检测，检测引物对为：

f3：5'-gatgttggcgacctcgtatt-3'，

r3：5'-tcgttatgtttatcggcacttt-3'。

若扩增出517bp的片段，则说明转基因植株为阳性植株。阳性植株单株收种并种植，直至t2代鉴定出纯合的转基因植株，即得到osnpf7.4基因干扰植株。osnpf7.4基因干扰植株的分蘖数、有效穗数远多于对照中花11植株，差异显著，如图1、2、3所示；且干扰植株的每株灌浆粒数比对照显著增加，如图4和图5所示。

取osnpf7.4基因干扰植株叶片，提取叶片rna并将其反转录成cdna，通过实时荧光定量pcr检测osnpf7.4基因在干扰植株的表达量，结果显示（图6）干扰植株中osnpf7.4基因的表达量比对照中花11降低。实时荧光定量pcr所用引物对：

f4：acgccatggagagaggccagca，

r4：accaggttcgtggcaatgccgt。

实施例2osnpf7.4基因超表达植株的构建

提取水稻中花11的rna，并将其反转录成cdna，利用引物对：

f5：5'-ggtaccatggacgccggcgacgccatggag-3'（kpni），

r5：5'-tctagatgacacgaccgtcttcaccttgta-3'（xbai）；

通过pcr扩增osnpf7.4基因的cdna后，通过kpni和xbai连入pcambia-1306载体（pcambia-1306载体购自cambia公司），构建出osnpf7.4基因的超表达载体osnpf7.4-p1306。采用农杆菌eha105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常水稻品种中花11中。

将得到的所有转基因小苗移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待小苗长高约10cm时，种于大田中，待苗长大后，提取基因组dna通过pcr对转基因植株进行检测，检测引物对为：

f3：5'-gatgttggcgacctcgtatt-3'，

r3：5'-tcgttatgtttatcggcacttt-3'；

若扩增出517bp的片段，则说明转基因植株为阳性植株。阳性植株单株收种并种植，直至t2代鉴定出纯合的转基因植株，即得到osnpf7.4基因超表达植株。osnpf7.4基因超表达植株的分蘖数、有效穗数远少于对照中花11植株，差异显著，如图1、2、3所示；且超表达植株的每株灌浆粒数比对照显著减少，如图4和图5所示。

取osnpf7.4基因超表达植株叶片，提取rna并将其反转录成cdna，通过实时荧光定量pcr检测osnpf7.4基因在超表达植株的表达量，操作同实施例1，结果显示（图6）超表达植株中osnpf7.4基因的表达量远远高于对照中花11。

上述结果表明，osnpf7.4基因可以通过表达量的降低，提高水稻的分蘖数、有效穗数及灌浆粒数，最终提高水稻产量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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<110>武汉生物工程学院

<120>氮运输基因osnpf7.4在水稻选育中的应用

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