精子piRNA和精子蛋白MitoPLD作为检测和预测男性不育的生物标志物的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，涉及精子pirna和精子蛋白mitopld作为检测和预测男性不育的生物标志物。
背景技术：
：不孕不育已成为世界范围内的生殖健康难题。目前在全世界已有超过15％的夫妇受到不孕不育问题困扰(1,2)。其中约有20％～30％的不孕症是单由男性因素导致，50％的不孕症与男性因素有关，而最近几年该数据呈上升趋势(2,3)，所以男性在不孕不育中扮演了重要的角色，然而现在对造成男性不育的分子机制尚不完全清晰(4,5)。目前临床生殖实验室检查项目一般包括对精液的生化检查，酸性磷酸酶、乳酸脱氢酶-x等酶类检查以及精液免疫学检查，但这些技术都存在一些缺陷，不能直接反映睾丸的生精功能和全面评价精液质量，尤其是对在男性生殖中起到至关重要作用的精子的活力这一指标，缺乏可靠检测手段，并且现有方法也难以系统性地阐释造成精子活力缺陷的分子生物学机制，所以迫切需要寻找到一种更精确的方法来评价精子活力。在2006年几个实验组几乎同时在动物生殖细胞中发现了一类新型小分子非编码rna，因为它们特异性地与piwi蛋白质相互作用，所以被命名为piwi相互作用rna(piwi-interactingrna)，简称pirna(6-9)。pirna特异性地在生殖细胞中表达，在精子的形成过程中发挥了重要的作用，pirna生成途径中的重要蛋白质也与配子形成或胚胎发育直接相关(10-12)。研究表明，pirna及piwi蛋白失活突变后，常常会导致该个体不育(10,13-15)。另外一个与初级pirna形成相关的蛋白是单链特异性核酸内切酶zuc(zucchini或mitopld)(16-18)，该蛋白突变可造成逆转座子的去甲基化、去抑制及初级pirna产生障碍，最终导致生殖障碍。我们通过对精子中的rna进行二代高通量测序，结果显示有大量的pirna存在于精子中。通过对这些pirna进行研究，有望发现一些与男性生殖功能(如精子活力等)密切相关的pirna，其有望成为检测和预测男性不育的生物标志物。同时，我们对pirna形成过程相关蛋白(如mitopld)进行研究，有望发现与男性生殖功能(如精子活力等)密切相关的蛋白，进而应用于男性生殖功能障碍的临床诊断、预测和筛查。技术实现要素：本发明的目的是通过筛查与男性精子活力密切相关的pirna的特异性变化及pirna生成相关蛋白的变化(如mitopld)，筛选出因精子活力低导致的男性不育人群和正常健康生育人群中表达差异显著的精子pirna及pirna生成相关蛋白(如mitopld)，通过检测这些pirna和pirna生成蛋白(如mitopld)，为诊断男性精子活力提供新指标和方法。目前，本发明已发现精子中能够检测到高浓度的pirna，并且发现特异性的pirna组合与精子活力密切相关，能作为男性因精子活力低导致生殖功能障碍的分子标志物，具有很高的特异性和灵敏性。同时本发明发现mitopld蛋白在活力低下的精子中表达量下降，也能作为男性因精子活力低导致生殖功能障碍的分子标志物。精子pirna和mitopld蛋白作为新的生物标志物，在检测男性精子活力方面具有重要的指导意义，能显示出分子水平的遗传信息，有助于揭示男性精子活力降低的分子机制。本发明的上述目的是采用以下技术方案来实现的：与男性生殖功能障碍相关的生物标志物，包含mitopld蛋白，该蛋白在ncbi数据库中的登录号为nm_178836.3；所述的男性生殖功能障碍为弱精症。与男性生殖功能障碍相关的生物标志物还优选包括下列pirna中的任意一种或多种：pir-hsa-28131、pir-hsa-1207、pir-hsa-23317、pir-hsa-27493、pir-hsa-2107、pir-hsa-25783、pir-hsa-2106、pir-hsa-25781、pir-hsa-18709、pir-hsa-25780。pirna对应的核苷酸序列pir-hsa-28131ggcauuggugguucagugguagaauucucgc(seqidno.1)pir-hsa-1207agcauuggugguucagugguagaauucucgc(seqidno.2)pir-hsa-23317ccgccugggaauaccgggugcuguaggcuua(seqidno.3)pir-hsa-27493gcauuggugguucagugguagaauucucac(seqidno.4)pir-hsa-2107auuggugguucagugguagaauucucgccug(seqidno.5)pir-hsa-25783uuggugguucagugguagaauucucgccugcc(seqidno.6)pir-hsa-2106auuggugguucagugguagaauucucgcc(seqidno.7)pir-hsa-25781uuggugguucagugguagaauucucgccug(seqidno.8)pir-hsa-18709uggugguucagugguagaauucucgccug(seqidno.9)pir-hsa-25780uuggugguucagugguagaauucucgccu(seqidno.10)与男性生殖功能障碍相关的生物标志物进一步优选包括mitopld蛋白及pir-hsa-1207和pir-hsa-2107。一种用于检测和预测男性生殖功能障碍的试剂盒，包含westernblot法和elisa法检测精子mitopld蛋白的试剂。本发明所述的试剂盒，还优选包含使用taqman探针real-timepcr法检测pir-hsa-1207和pir-hsa-2107的探针和引物。本发明所述的生物标志物在制备以精子为检测对象用于诊断和/或预测男性生殖功能障碍的检测试剂中的应用。westernblot法和elisa法检测精子mitopld蛋白的试剂在制备以精子为检测对象用于诊断和/或预测男性生殖功能障碍的检测试剂中的应用。westernblot法和elisa法检测精子mitopld蛋白的试剂以及检测pir-hsa-1207和pir-hsa-2107的taqman探针和引物在制备以精子为检测对象用于诊断和/或预测男性生殖功能障碍的检测试剂中的应用。上述pirna组合的筛选方法包括以下步骤：(1)收集精子样本，包括精子活力正常生育男性以及精子活力弱的生殖功能障碍男性的精子样本，并提取总rna；(2)采用高灵敏度、精确性和高重复性的高通量二代测序技术(high-throughputsequencingtechnology)，对上述rna进行检测，初步筛选出精子活力低下与正常生育男性精子中表达差异显著的一组pirna(精子含量高且差异显著的前10个pirna，筛选标准为精子中含量最高的前10个pirna并且在弱精症中相对正常对照降低1.5倍以上)；(3)进一步使用实时荧光定量pcr方法验证(最终确定pir-hsa-1207和pir-hsa-2107为最优化组合)。具体来说，上述筛选方法包括以下步骤：(1)分别收集正常生育男性及精子活力弱的生殖功能障碍男性的精子，并提取总rna；(2)根据pirnadatabase中已有的pirna，对上述rna进行高通量二代测序检测，检测范围为10～45个核苷酸的全部小rna，初筛出正常男性与精子活力弱男性精子中表达差异明显的一组pirna(精子含量高且差异显著的前10个pirna，筛选标准为精子中含量最高的前10个pirna并且在弱精症中相对正常对照降低1.5倍以上)；(3)从个体精子中提取rna，逆转录成cdna，采用荧光定量pcr(taqman探针法)方法进一步对初筛出的pirna进行验证，挑选出稳定、特异性变化的pirna作为检测精子活力的生物标志物(最终确定pir-hsa-1207和pir-hsa-2107为最优化组合)，特异性检测和预测弱精症男性生殖功能障碍疾病。一种与男性生殖功能障碍相关的pirna生成相关蛋白mitopld；其中，所述的男性生殖功能障碍选自弱精症。上述mitopld蛋白筛选方法包括以下步骤：(1)收集精子样本，包括精子活力正常生育男性以及精子活力弱的生殖功能障碍男性的精子样本，并提取总蛋白；(2)使用westernblot的方法检测mitopld蛋白表达差异，以β-actin作为内参；(3)使用elisa的方法检测mitopld蛋白表达差异。本发明使用的pirna检测方法可以选自：高通量二代测序技术(high-throughputsequencingtechnology)、real-timepcr方法以及生物芯片方法中的一种或几种。例如，精子中pirna分子的检测方法包括以下步骤：(1)使用trizol试剂(invitrogen公司)提取精子中总rna；(2)通过将rna逆转录得生成cdna；(3)根据人pirna序列设计引物及taqman探针，进行pcr反应对pirna进行精确定量检测；(4)比较精子活力低下男性精子相对于正常男性精子中pirna的量的变化。有益效果：本发明所述的pirna组合和单个pirna及其对应的探针组合和mitopld蛋白可应用于男性生殖功能障碍的检测中，例如为男性生殖功能障碍补充新的检测指标、用于病程监测、预后和药效评价之中。本发明具有以下几个方面的有益效果：第一，精子pirna及精子mitopld蛋白检测方便易行，精子样本相对其它组织较易获得，与睾丸活检或者睾丸穿刺相比，属于无创性检查，极大地方便了医疗人员的使用，减轻了患者的痛苦；精子pirna及精子mitopld蛋白的测试方法属于医院检验科常规技术，无特别高的技术门槛和应用障碍，利于推广；第二，精子中的pirna和mitopld蛋白反映的是整个生精过程中的病理和生理状况，其检测结果更具有临床指导意义；第三，精子pirna和mitopld蛋白检测能在分子水平上反映精子发生中的状态，提高了检测的准确水平，并为男性生殖功能障碍尤其是生精功能障碍的治疗提供了潜在靶点；第四，pirna的3’端被甲基化修饰，相对其它未被修饰过的rna更加稳定，这为样本处理及检测提供了方便，即靶标分子受环境及外界因素影响较小，利于实际应用的展开；第五，pirna及mitopld蛋白组合检测精子的活力的优点，在于通过多个pirna同时检测，同时偶联pirna相关蛋白检测，通过核酸和蛋白二个生物层面上同时鉴定，显著提高了检测的准确性。综上所述，检测精子中的pirna和mitopld蛋白，简单易行且效果突出，从精子pirna的特异性变化和mitopld蛋白表达差异这一新角度出发，发现精子活力并且区分男性生殖功能障碍，从而建立起一种检测生精功能障碍的新技术。该技术仅仅需要病人的精子而不需要任何其它组织，通过简单的pirna组合和单个pirna及mitopld蛋白来预测男性精子活力强弱及预测生殖功能障碍发生的可能性。由此可见，检测精子pirna水平和mitopld蛋白水平能评估精子活力及由精子活力引起的男性生殖功能障碍，这些精子pirna和mitopld蛋白的表达水平有望成为诊断男性精子活力的重要标志分子，具有极重要的临床应用价值。附图说明图1本发明的主要流程图；图2高通量二代测序显示正常与弱精症样本中总pirna拷贝数的变化及筛选出的10个代表性下降的pirna；图3taqman探针real-timepcr法测定pirna(pir-hsa-1207和pir-hsa-2107)在弱精患者与正常对照精子样本中的差异性变化。如图所示pir-hsa-1207和pir-hsa-2107在弱精患者精子中相对正常对照均出现显著降低，因此pir-hsa-1207和pir-hsa-2107是可以区分精子活力的特异性生物标志物pirna；图4westernblot检测mitopld蛋白在弱精患者与正常对照精子样本中的表达差异。如图所示，mitopld蛋白在弱精患者精子中相对正常对照均出现显著降低，因此mitopld蛋白是可以区分精子活力的特异性生物标志物。a：单个样本检测；b：混合样本检测；c：统计结果。具体实施方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。本发明通过研究男性因精子活力而造成生殖功能障碍过程中精子pirna及mitopld蛋白的特异变化，筛选出在疾病及正常生理状态下表达差异显著的一组精子pirna及pirna生成相关蛋白mitopld，将它们应用于男性精子活力检测，以提高诊断男性精子活力的准确性。实施例1：高通量二代测序筛选特异性变化的pirna作为男性精子活力的生物标志物(1)研究对象为结婚后未采取任何避孕措施2年内不育者，以年龄匹配的已育不超过两年的男性为正常对照，所有受试者禁欲3～5天后留取精液，用wljy-9000伟力彩色精子质量检测系统(北京伟力公司)进行精子质量和功能分析。分析标准均按世界卫生组织标准进行(who人类精液检查和处理实验室手册(第5版))。待精液分析后将其1000g离心10分钟，收集精子。(2)收集正常生育者、弱精的精子标本分别10例和10例，将组中的标本分别混合。分别提取各组混合精子中的rna，具体方案为：利用trizol试剂(invitrogen公司)提取总rna。(3)对两组精浆中总rna进行高通量二代测序分析(康成生物)。(4)pirna表达谱分析。高通量二代测序后得到了小rna的序列和登录号，和pirna核酸数据库比对后，在正常组精子中测到pirna17657种，拷贝数为8245354；弱精组精子中测到15742种，拷贝数4220714，弱精组相对正常组呈现pirna显著下降的趋势(见图2a)。实施例2：从测序结果中筛选出差异显著的10个pirna根据精子中含量高低及变化幅度大小两个原则，设立筛选条件：精子中含量最高的前10个pirna，并且在弱精症中相对正常对照降低1.5倍以上。基于此筛选条件，筛出以下10个pirna：pir-hsa-28131、pir-hsa-1207、pir-hsa-23317、pir-hsa-27493、pir-hsa-2107、pir-hsa-25783、pir-hsa-2106、pir-hsa-25781、pir-hsa-18709、pir-hsa-25780；其降低幅度见下表，图2b。实施例3：taqman探针real-timepcr法测定pirna在精浆子中表达及特异性变化的pirna作为精子活力的生物标志物针对pir-hsa-1207和pir-hsa-2107这两个pirna，进行单个样本的taqman探针real-timepcr定量检测，以rnu6-6p作为内参；并进一步确定特异性变化的pirna作为精子活力的生物标志物。具体步骤为：提取单个样本精子中总rna。针对每一种pirna，设计一个含相同茎环结构的特异性反向引物，利用pirna特异性反向引物进行逆转录，得到含共同茎环结构但属于特定pirna的cdna。进行基于taqman探针的real-timepcr反应，将每种pirna扩增并记录荧光信号，仪器使用的是roche480荧光定量pcr仪。数据处理方法为相对定量法，以rnu6-6p作为内参，计算出正常对照与弱精患者精子中pirna的相对含量。结果显示弱精组中pir-hsa-1207和pir-hsa-2107相对正常组呈现显著下降的趋势(见图3)。实施例4：westernblot法测定精浆子中mitopld的特异性表达差异作为精子活力的生物标志物针对mitopld蛋白的检测，提取单个样本精子中总蛋白或提取混合精子的总蛋白，测定蛋白浓度后进行westernblot检测，以β-actin作为内参，然后根据结果使用灰度分析及统计数据。单个样本结果见图4a，混合样本(各10例样本)结果见图4b检测，可见mitopld蛋白在弱精症患者和正常人精子中差异表达，mitopld蛋白能够作为精子活力的生物标志物。参考文献1.sharlipid,jarowjp,belkeram,lipshultzli,sigmanm,thomasaj,etal.bestpracticepoliciesformaleinfertility.fertilsteril2002；77:873-82.2.agarwala,mulgunda,hamadaa,chyattemr.auniqueviewonmaleinfertilityaroundtheglobe.reproductivebiologyandendocrinology:rb&e2015；13:37.3.inhornmc,patriziop.infertilityaroundtheglobe:newthinkingongender,reproductivetechnologiesandglobalmovementsinthe21stcentury.humreprodupdate2015；21:411-26.4.okadah,tajimaa,shichirik,tanakaa,tanakak,inouei.genome-wideexpressionofazoospermiatestesdemonstratesaspecificprofileandimplicatesart3ingeneticsusceptibility.plosgenet2008；4:e26.5.huangs,lih,dingx,xiongc.presenceandcharacterizationofcell-freeseminalrnainhealthyindividuals:implicationsfornoninvasivediseasediagnosisandgeneexpressionstudiesofthemalereproductivesystem.clinchem2009；55:1967-76.6.girarda,sachidanandamr,hannongj,carmellma.agermline-specificclassofsmallrnasbindsmammalianpiwiproteins.nature2006；442:199-202.7.launc,setoag,kimj,kuramochi-miyagawas,nakanot,barteldp,kingstonre.characterizationofthepirnacomplexfromrattestes.science2006；313:363-7.8.grivnast,beyrete,wangz,linh.anovelclassofsmallrnasinmousespermatogeniccells.genes&development2006；20:1709-14.9.aravina,gaidatzisd,pfeffers,lagos-quintanam,landgrafp,iovinon,etal.anovelclassofsmallrnasbindtomiliproteininmousetestes.nature2006；442:203-7.10.ishizuh,siomih,siomimc.biologyofpiwi-interactingrnas:newinsightsintobiogenesisandfunctioninsideandoutsideofgermlines.genedev2012；26:2361-73.11.quenerch'due,ananda,kait.thepirnapathwayisdevelopmentallyregulatedduringspermatogenesisindrosophila.rna2016；22:1044-54.12.zhaos,goult,zhangm,zuld,huamm,huay,etal.pirna-triggeredmiwiubiquitinationandremovalbyapc/cinlatespermatogenesis.devcell2013；24:13-25.13.coxdn,chaoa,bakerj,changl,qiaod,linh.anovelclassofevolutionarilyconservedgenesdefinedbypiwiareessentialforstemcellself-renewal.genesdev1998；12:3715-27.14.carmellma,girarda,vandekanthj,bourc'hisd,bestorth,derooijdg,hannongj.miwi2isessentialforspermatogenesisandrepressionoftransposonsinthemousemalegermline.devcell2007；12:503-14.15.kuramochi-miyagawas,kimurat,ijiritw,isobet,asadan,fujitay,etal.mili,amammalianmemberofpiwifamilygene,isessentialforspermatogenesis.development2004；131:839-49.16.ipsarojj,haasead,knottsr,joshua-torl,hannongj.thestructuralbiochemistryofzucchiniimplicatesitasanucleaseinpirnabiogenesis.nature2012；491:279-u151.17.nishimasuh,ishizuh,saitok,fukuharas,kamatanimk,bonnefondl,etal.structureandfunctionofzucchiniendoribonucleaseinpirnabiogenesis.nature2012；491:284-u157.18.saitok,inagakis,mituyamat,kawamuray,onoy,sakotae,etal.aregulatorycircuitforpiwibythelargemafgenetrafficjamindrosophila.nature2009；461:1296-u135。<110>南京优智源医药科技有限公司<120>精子pirna和精子蛋白mitopld作为检测和预测男性不育的生物标志物<160>10<210>1<211>31<212>rna<213>人类<220><223>pir-hsa-28131<400>1ggcauuggugguucagugguagaauucucgc31<210>2<211>31<212>rna<213>人类<220><223>pir-hsa-1207<400>2agcauuggugguucagugguagaauucucgc31<210>3<211>31<212>rna<213>人类<220><223>pir-hsa-23317<400>3ccgccugggaauaccgggugcuguaggcuua31<210>4<211>30<212>rna<213>人类<220><223>pir-hsa-27493<400>4gcauuggugguucagugguagaauucucac30<210>5<211>31<212>rna<213>人类<220><223>pir-hsa-2107<400>5auuggugguucagugguagaauucucgccug31<210>6<211>32<212>rna<213>人类<220><223>pir-hsa-25783<400>6uuggugguucagugguagaauucucgccugcc32<210>7<211>31<212>rna<213>人类<220><223>pir-hsa-2106<400>7auuggugguucagugguagaauucucgcc29<210>8<211>30<212>rna<213>人类<220><223>pir-hsa-25781<400>8uuggugguucagugguagaauucucgccug30<210>9<211>29<212>rna<213>人类<220><223>pir-hsa-18709<400>9uggugguucagugguagaauucucgccug29<210>10<211>29<212>rna<213>人类<220><223>pir-hsa-25780<400>10uuggugguucagugguagaauucucgccu29当前第1页12