一种用于检测丝状支原体山羊亚种的引物和探针的制作方法

本发明涉及一种用于检测丝状支原体山羊亚种的引物和探针，属于分子生物学领域。

背景技术：

丝状支原体山羊亚种(mycoplasmamycoidessubsp.capri,mmc)是丝状支原体簇的成员之一，是羊支原体性肺炎(mycoplasmapneumoniaofgoatsandsheep,mpgs)的病原之一。mpgs传染性强，主要通过呼吸道感染，也可垂直传播，病羊和耐过羊是该病的主要传染源(贺英等,2009;万一元等,2000)。mpgs的潜伏期平均为18-20d，最快3-6d，最长为30-40d。其临床特征主要表现为高热、咳嗽渐进性消瘦以及肺实质、小叶间质及胸膜发生浆液性和纤维素性炎症，肺部有明显的肝变为主要特征的呼吸道疾病，此外还可引起乳房炎、角膜结膜炎和败血病等。该病的发病率为19%-90%，死亡率高达40%。当前国外非洲、西班牙、意大利、美国、约旦，国内四川、贵州、内蒙古、青海、广西、福建等地均有该病发生的报道。该病给养羊业造成了严重的经济损失，因此，亟需建立一种mmc特异、敏感、简便的检测方法。

国内外关于mmc的诊断方法研究报道较少，这主要是由于mmc属于丝状支原体簇成员，丝状支原体簇成员之间同源性较高，血清学上有交叉反应。目前常用的诊断方法主要有支原体分离培养鉴定、pcr等(d’angeloetal,2010)。前者费时（需要一周以上时间）费力，后者不能定量，且后续鉴定过程繁琐。荧光pcr是在普通pcr的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光pcr检测仪来检测靶核苷酸序列的技术，具有特异性强、灵敏度高、定量准确、适用性广等优点。通过查阅文献发现，当前国内外尚未有针对丝状支原体山羊亚种检测的实时荧光定量pcr方法，但该方法已在其他羊病上如羊传染性脓疱病毒、羊痘病毒和小反刍兽疫上均已有相应的荧光定量pcr检测方法。本发明的建立可以填补该领域的空白。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于检测丝状支原体山羊亚种的引物和探针。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

用于检测丝状支原体山羊亚种的实时荧光定量pcr引物，引物的核苷酸序列为：上游引物：5’-ctagctagcatagttgttg-3’，下游引物：5’-gcttgaacaactatattgta-3’。

用于检测丝状支原体山羊亚种的探针，序列为：5’-taacacagttaaagcagacccacca-3’。

所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团（r）和荧光淬灭基团（q）的寡核苷酸。

利用本发明的引物和探针可用于检测丝状支原体山羊亚种的相应基因，尤其适用于基于荧光定量pcr技术的检测。通过对反应体系和反应条件的优化，建立一种可用于检测丝状支原体山羊亚种的荧光定量pcr方法。

具体操作方法如下：

1、引物设计：根据genbank上公布的丝状支原体山羊亚种fq377874.1基因组序列，利用primer6.0软件对mlc_1770基因序列进行引物和探针设计，探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是fam，3’端标记的荧光淬灭基团为eclipse，采用blast工具进行检索，初步验证其特异性。

2、反应体系的优化：优化出的25μl最佳反应体系为：premixextaq^tm（probeqpcr）12.5μl、上、下游引物（10μmol/l）各0.5μl、探针（5μmol/l）1μl、模板2μl、水补足至25μl。最佳反应条件为：95℃，30s预变性；95℃5s，55℃10s，72℃20s共40个循环。

3、阳性标准品的制备：以提取的丝状支原体山羊亚种dna为模板，按照常规pcr方法进行扩增，将扩增的产物经胶回收，连接到pmd19-t载体上，转化，提取质粒，得到阳性标准品。

4、标准曲线的建立：以优化的反应体系进行pcr扩增，以拷贝数为横坐标，以ct值为纵坐标建立标准曲线。

该方法可用于丝状支原体山羊亚种的病原诊断和流行病学调查，为疾病的早期预防奠定技术基础。

有益效果

本发明根据genbank登录的fq377874.1的mlc_1770基因序列，设计特异性引物和探针，于国内外首先建立丝状支原体山羊亚种的实时荧光定量pcr方法，该方法灵敏度高，最低可检测到110copies,特异性好、重复性好，可用于检测临床样品中丝状支原体山羊亚种的含量。

附图说明

图1丝状支原体山羊亚种实时荧光定量pcr方法的扩增曲线。

图2为丝状支原体山羊亚种的实时荧光定量pcr的标准曲线。

具体实施方式

实施例1丝状支原体山羊亚种的荧光定量pcr方法的建立

一、材料：

山羊支原体山羊肺炎亚种由中国农业科学院兰州兽医研究所储岳峰馈赠，大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌等由福建省农业科学院畜牧兽医研究所禽病实验室程龙飞研究员馈赠；丝状支原体山羊亚种、绵羊肺炎支原体、羊口疮病毒为本科室分离、保存。

二、步骤

1、仪器与试剂：mastercyclereprealplex荧光定量pcr仪购自eppendorf公司；premixextaq^tm（probeqpcr）、pmd19-t载体、dl2000marker均购自宝生物工程（大连）有限公司；荧光定量pcr管购自axygen；胶回收试剂盒购自康宁生命科学（吴江）有限公司；质粒小量抽提试剂盒购自omegabio-tek公司。

2.引物和探针的特异性

引物和探针的特异性是本实验所建立方法的最重要因素。根据genbank登录的fq377874.1的mmlc_1760基因序列，通过比对分析，设计引物和探针。

3、阳性标准品的制备

利用设计的特异性引物对mmcfj-gt株的dna进行mlc_1770基因的pcr扩增。20μlpcr扩增体系为：premixtaq^tmversion2.0plusdye10μl、上下游引物(10μmol/μl)各1μl、模板2μl、无菌去离子水补足至20μl。反应条件：94℃2min；94℃30s、55℃15s、72℃15s，37个循环；72℃10min。pcr产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收目的片段连接至pmd19-t载体上，并转化至大肠杆菌dh5a感受态细胞，挑取阳性克隆进行扩增培养，用小量质粒提取试剂盒提取后，分别进行pcr鉴定和酶切鉴定，并送至宝生物工程（大连）有限公司进行测序。经鉴定正确的阳性重组质粒作为标准品，命名为mmc-1770，置于-70℃冰箱保存备用。

4.反应条件的优化

采用25μl反应体系premixextaq^tm（probeqpcr）12.5μl，pcr上游引物（10μmol/l）0.5μl，pcr下游引物（10μmol/l）0.5μl，探针（5μmol/l）1μl，倍比稀释后的阳性标准品2μl，补水至终体积25μl，以出现最高荧光值及最小的ct值为指标，分别对退火温度（51～60℃）和引物浓度（0.2～1.0μmol/l）进行优化。

5、建立标准曲线

用easydilution将构建的标准品梯度稀释(10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、copies/μl)作为模板，以优化的条件进行扩增，以拷贝数为横坐标，以ct值为纵坐标建立标准曲线。

对阳性标准品的扩增曲线和标准曲线显示，荧光定量pcr方法对丝状支原体山羊亚种的最低检测限为110copies,且ct与拷贝数在1.1×10⁴～1.1×10⁸拷贝/μl，反应范围内有很好的线性关系，相关系数r²为0.998，扩增效率为103%。扩增曲线见图1，标准曲线见图2。

6特异性检测

6.1特异性检测

用优化的条件分别对丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊肺炎亚种、大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、副猪嗜血杆菌、绵肺炎支原体、羊口疮病毒核酸样品进行检测，对该方法的特异性进行评价。检测结果显示，只有丝状支原体山羊亚种核酸样品为阳性，其余核酸样品检测结果均为阴性。

6.2可重复性及再现性评估

对同一阳性标准品设3个重复管，用实时荧光定量pcr进行检测，评价其重复性，计算组内变异系数；将阳性标准品置于-20℃保存，分别于第7、14、21d重检，评价其再现性，计算其组间变异系数。计算得组内变异系数为0.60%～1.52%，组间变异系数为0.49%～0.78%，可重复性好。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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<110>福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120>一种用于检测丝状支原体山羊亚种的引物和探针

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