金黄色葡萄球菌杀白细胞素及其治疗组合物和用途的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请是申请号为201180033386.0、申请日为2011年5月5日、发明名称为“金黄色葡萄球菌杀白细胞素及其治疗组合物和用途”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为pct/us2011/035354的国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2010年5月5日，申请号为61/331,550的美国申请的优先权，其通过引用并入本文。

序列表

本申请包括了一份通过efs-web提交的序列表，其公开内容在此参考并入。所述ascii拷贝创建于2011年5月2日，并被命名为sequencelisting_staphylococcusaureusleukocidins_st25.txt，大小为102kb。

发明背景

金黄葡萄球菌或“葡萄球菌”通常可在人和动物的皮肤或鼻孔内发现。葡萄球菌一般情况下是无害的，除非其通过切口或其他伤口进入身体。在健康人身上，典型的葡萄球菌感染是很小的皮肤问题。以前，葡萄球菌感染使用广谱抗菌素，如甲氧西林进行治疗。然而，现在出现了一些耐药葡萄球菌菌株，其对甲氧西林和其他β-内酰胺类抗生素，如青霉素和头孢菌素有耐药性。它们被称为甲氧西林耐药性金黄葡萄球菌(也称多药耐药性金黄葡萄球菌，或"mrsa")。

葡萄球菌感染，包括mrsa，开始通常为类似丘疹、疖子或蜘蛛咬伤一样的小红肿包。这些肿包或缺损可能很快转化为需要外科手术排脓治疗的深度、疼痛型脓肿。有时，细菌仅限于皮肤。在有些情况下，它们可能深入到身体内部，并可能导致危及生命的人体多个组织的感染，包括皮肤、软组织、骨头、关节、外科手术伤口、血液系统、心脏瓣膜、肺部、或其他器官。因此金黄葡萄球菌感染可能变成致命性疾病，例如，坏死性筋膜炎、肺炎、心内膜炎、败血症、中毒性休克综合征以及各种形式的肺炎。在医院或医疗环境下mrsa感染是特别麻烦的，患者常常会有开放性创伤、侵入性器械和免疫系统衰弱，所以比在公共场合中有更高的感染风险。没有遵循正确卫生程序的操作人员可能将mrsa细菌从一名患者传递给另外一名患者。

金黄葡萄球菌产生一系列的不同的毒力因子和毒素，它们能使该细菌中和并抵抗各种类型免疫细胞的攻击，特别是白细胞的亚群，白细胞组成身体主要抵御系统。这些毒力因子和毒素的产生可以让金黄色葡萄球菌保持感染状态。参见nizet,j.allergyclin.immunol.120:1322(2007)。在这些毒力因子中，金黄色葡萄球菌可产生各种双组分的白细胞毒素，这些毒素通过两种非结合的蛋白或亚单位的协同作用破坏宿主防御细胞和红细胞的细胞膜。参见，supersac,等,infect.immun.61:580-7(1993)。在这些双组分的白细胞毒素中，γ-溶血素(hlgab和hlgcb)和潘通-瓦伦丁(pantone-valentine)杀白细胞素(pvl)是最具代表的。

杀白细胞素对哺乳动物细胞的毒性涉及两个组分的作用。第一个亚单位命名为s亚单位级(即，慢洗脱的亚单位)，第二个亚单位命名为f亚单位级(即，快洗脱的亚单位)。s亚单位和f亚单位协同作用可在白细胞上形成孔洞，白细胞包括单核细胞、吞噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞(统称为吞噬细胞)。参见，menestrina,等,toxicol.39:1661-1672(2001)。双组分的毒素在靶细胞膜上形成孔洞的机制还没有完全了解。这些毒素可能的作用机制包括s亚单位与靶细胞膜的结合，该结合很可能是通过一个受体，然后f亚单位结合到s亚单位上，从而形成一个低聚物，该低聚物形成了插入靶细胞膜的前孔洞(jayasinghe,等,protein.sci.14:2550-2561(2005))。双组分白细胞毒素形成的孔洞是典型的阳离子选择性的。孔洞的形成会导致细胞的裂解死亡，已有报道在白血球细胞中，其裂解死亡是由于阳离子汇集导致的渗透压不平衡所致(miles,等,biochemistry40:8514-8522(2001))。

除了pvl(即s/f-pv或luksf-pv)以及γ-溶血素(hlgab和hlgcb)，金黄色葡萄球菌产生的双组分组成中还包括杀白细胞素e/d(luked)和杀白细胞素m/f’(lukmf’)。因此，这些双组分杀白细胞素的s亚单位包括hlga、hlgc、luke、luks-pv、和lukm，f亚单位包括hlgb、lukd、lukf-pv、和lukf’-pv(menestrina,等，如上所述)。金黄色葡萄球菌的s-和f-亚单位不是杀白细胞素所特有的。即，其可以相互替换，这就使其他的双组分组合可以在白血球细胞上形成功能性孔洞，从而大大增加了杀白细胞素的组成(meyer,等,infect.immun.77:13-22(2009))。

开发对mrsa感染的有效治疗已经变得很有必要。除了对前述的甲氧西林和相关的抗生素的耐药性，mrsa还发现对大环内脂类(如，红霉素)、β-内酰胺酶抑制剂复合物(如，舒巴坦、奥格门汀)以及氟喹诺酮类(如，环丙沙星)，还有克林霉素、甲氧苄啶/磺胺甲基异噁唑(复方新诺明)和利福平具有显著的抗药性。在严重的金黄色葡萄球菌感染中，临床医生已经开始使用静脉给予万古霉素。然而，金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药已有报道。所以，有必要开发可以有效抵抗金黄色葡萄球菌感染的新型抗菌药物。

发明概述

申请人发现并鉴定了金黄色葡萄球菌天然存在的防御系统中的另外一个双组分成员。新鉴定的天然s亚单位多肽组分在本申请中被称为“luka”，其包含天然多肽及其类似物，天然多肽的类似物与天然多肽的序列有至少70％的相似性。因此，本发明的一方面涉及luka的分离和/或纯化。本发明的另一方面涉及编码luka的分离和/或纯化的多核苷酸，含有该多核苷酸的转染宿主(如，细胞)，以及通过在转染宿主中表达多核苷酸制备重组luka的方法。

新鉴定的f亚单位多肽组分在本申请中被称为“lukb”，其包含天然多肽及其类似物，天然多肽的类似物与天然多肽的序列有至少70％的相似性。因此，本发明的一方面涉及lukb的分离和/或纯化。本发明的另一方面涉及编码lukb的分离和/或纯化的多核苷酸，含有该多核苷酸的转染宿主(如，细胞)，以及通过在转染宿主中表达多核苷酸制备重组lukb的方法。

然而，本申请的另外一方面涉及治疗组合物，该组合物含有制备于药学上可接受的药物载体中的治疗有效量的luka和/或lukb，可用于抑制金黄色葡萄球菌感染的发病或对其进行治疗。因此，在一个实施方式中，治疗组合物中包括治疗有效量的luka。在另一个实施方式中，治疗组合物中包括治疗有效量的lukb。在另一个实施方式中，治疗组合物中包括治疗有效量的luka和lukb。在其他实施方式中，组合物包含luka的类似物，其缺少10c-端残基且没有毒性(本申请中称为lukaδ10c或rlukaδ10c)。这些组合物具有多种治疗用途。在一些实施方式中，组合物称为抗炎组合物，并可被用于治疗急性炎症或疾病，特别是局部急性炎症情况。

这些用途运用了申请人的其他发现，即在生理条件下(即，lukab直接由金黄色葡萄球菌产生)，lukab复合物对吞噬细胞具有特别的特异性，而对其他有核细胞则无，所述有核细胞例如上皮细胞和内皮细胞。也就是说，复合物在这些种类的细胞膜上形成孔洞，从而导致细胞死亡，这在本申请中称为“lukab介导的细胞毒性”。另外一方面，lukab对其他有核哺乳动物细胞具有相对较小或可忽略不计的特异性。因此，本发明的抗炎组合物利用了lukab对人类吞噬细胞的特异性作用，来针对性治疗急性炎症，该炎症的特点为大量吞噬细胞对炎症部位的浸润。

在其他实施方式中，治疗组合物可被称为(活性)疫苗组合物。该组合物可被用于在患者身上诱导产生中和性抗-luka和抗-lukb抗体，所述患者具有感染金黄色葡萄球菌的风险或被诊断为金黄色葡萄球菌感染，如mrsa。

本发明的其他方面涉及特异性结合luka的抗体、特异性结合lukb的抗体、包含luka和/或lukb抗体的治疗用复合物、以及使用它们治疗金黄色葡萄球菌感染。这些治疗组合物可被称为被动疫苗组合物。因此，在一个实施方式中，这些治疗组合物中包含治疗有效量的抗-luka抗体。在另一个实施方式中，这些治疗组合物中包含治疗有效量的抗-lukb抗体。在另一个实施方式中，这些治疗组合物中包含治疗有效量的抗-luka抗体和抗-lukb抗体。

本发明的被动和主动疫苗组合物运用了申请人的其他发现，即感染性的、恶性的金黄色葡萄球菌菌株，例如mrsa表达luka和lukb。大量金黄色葡萄球菌菌株间luka和lukb的保守性使本发明的疫苗可以提供全谱的治疗效果。luka、lukb、抗luka抗体、抗lukb抗体在本申请中也被称为活性剂。

本发明还进一步涉及使用lukab、luka、和/或lukb鉴定lukab介导细胞毒性抑制剂的方法。这些方法可能会利用lukab复合物本身，与吞噬细胞或吞噬细胞膜结合部分的组合。由此鉴定的抑制剂可以是候选药物用于金黄色葡萄球菌感染治疗。

本发明进一步涉及预测或评价金黄色葡萄球菌感染严重性的方法，该方法检测来自感染对象的生物样品中luka和/或lukb的存在情况及量，或检测其中luka和/或lukb的相应基因。本发明的这一方面是以申请人的进一步发现为基础的，在许多金黄色葡萄球菌产生的细胞毒素中，lukab会表现出很强的人类吞噬细胞毒性。因此，相对于对照(例如金黄色葡萄球菌菌株usa100和usa400)产生少量或无法检测到的luka和/或lukb，如检测到luka和/或lukb或其对应基因(如，金黄色葡萄球菌菌株newman、4645、和mrsa菌株usa300和usa500)的存在或具有相对高的表达量，可以指示存在严重的金黄色葡萄球菌感染。

本发明的上述和其他方面将在下文中进行详细描述。

附图简要说明

图1为luka的主要序列(命名为seqidno.:1)和来自金黄色葡萄球菌13个不同菌株对应的luka多肽(命名为seqidnos.:2-14)的氨基酸序列比对情况。

图2为lukb主要序列(命名为seqidno.:15)和来自金黄色葡萄球菌12个不同菌株对应的lukb多肽(命名为seqidnos.:16-27)的氨基酸序列比对情况。

图3：lukab是很强的葡萄球菌细胞毒素，其靶向并杀死主要的人类吞噬细胞。(a)用金黄色葡萄球菌菌株newman(野生型)及所示同基因突变株的培养物滤液(2.5％v/v)对人主要外周血单核细胞(pbmc)进行攻毒。细胞存活情况使用celltiter进行检查，使用培养基处理的细胞设置为100％。结果显示为三份重复样品的平均值+标准偏差(s.d.)。(b)用金黄色葡萄球菌菌株newman(野生型)及所示同基因突变株的培养物滤液(2.5％v/v)对人主要单核细胞、吞噬细胞、和树突状细胞(dc)进行攻毒。细胞存活情况使用前述方法进行检查。结果显示为两个供体的平均值，每一个供体的细胞都用三份独立制备的胞外蛋白制剂对其攻毒，+s.e.m。(c)用金黄色葡萄球菌菌株newman(野生型)及所示同基因突变株的培养物滤液的不同稀释液对原代人中性粒细胞(pmn)进行攻毒。细胞存活情况使用前述方法进行检查。结果显示为四名供体的pmn平均值±s.e.m.。(d)用纯化的rluka、rlukb、或rluka和rlukb组合物以所示浓度对原代人pmn细胞进行攻毒。*指的是与rluka和rlukb都具有统计上的显著性，p<0.05。对于(a-c)*指的是与野生型(wt)具有统计上的显著性，**指的是与δlukab/p有统计上的显著性，p<0.05(student’st检验，p<0.05)。

图4：lukab优先靶向人类吞噬细胞。攻毒实验：(a、c和d)pmn-hl60或(b)thp1细胞，用金黄色葡萄球菌野生型(wt)菌株newman、缺少所示基因/毒素的同基因突变株的培养物滤液的不同稀释度进行攻毒，(c)用含有空质粒的金黄色葡萄球菌wt(wt/p)，缺少lukab并含有空质粒的菌株(δlukab/p)，以及缺少lukab并含有lukab互补质粒的菌株(δlukab/plukab)的培养物滤液进行攻毒，或(d)用所示浓度的纯化重组luka(rluka)、lukb(rlukb)、或rluka和rlukb的组合(rluka+rlukb)进行攻毒。对于同时用rluka和rlukb的攻毒，总蛋白浓度为等量的rluka和rlukb(如，2.8μg的总蛋白与1.4μg的rluka和1.4μg的rlukb相等)。(e)用10μg/mlrlukab对所示人类细胞系攻毒。细胞存活情况使用celltiter进行检查，使用培养基处理的细胞设为100％。结果显示为三份重复样品的平均值±标准偏差(s.d.)。星号(*)表示与wt相比具有统计学显著性差异(单因素方差分析(one-wayanova))。

图5：lukab是不同葡萄球菌菌株中的重要毒素。(a)使用抗-lukb的多克隆抗体血清，通过免疫印迹分析不同金黄色葡萄球菌的lukb表达情况。(b)使用不同金黄色葡萄球菌胞外蛋白的稀释液对pmn-hl60细胞进行攻毒。细胞存活情况使用celltiter进行检查，其中用培养基处理的细胞设为100％存活。(c)使用毒素特异性血清，通过免疫印迹分析测定wt和lukab同基因菌株的lukb和α-毒素的表达情况。(d)来自wt菌株newman(new)和4645、以及lukab同基因菌株的胞外蛋白对pmn-hl60细胞攻毒。细胞存活测定情况见b。结果为三份重复样本的平均值+s.d.。*表示与newman(c)或wt(e)相比有统计学上的显著性(student’st检验，p<0.05)。

图6：lukab破坏目标细胞的胞质膜。(a)pmn-hl60细胞的光学显微镜照片，pmn-hl60用金黄色葡萄球菌wt菌株和同基因lukab缺陷型(δlukab)的培养物滤液进行攻毒。(b-c)wt菌株(wt/p)、同基因lukab缺陷型菌株(δlukab/p)、互补菌株(δlukab/plukab)培养物滤液的攻毒，或用培养基攻毒的模拟。细胞膜破损细胞使用sytox绿染色，使用荧光显微镜成像(c)并测定绿色荧光的强度(b)。(d)用金黄色葡萄球菌菌株newman(mssa)或usa300菌株lac(mrsa)和所示同基因突变株，以不同的感染复数(moi)对pmn细胞进行体外感染。用sytox绿检查膜破损情况。结果显示为三份重复样品的平均值±标准偏差(s.d.)。星号(*)表示与wt相比具有统计学显著性差异(student’st检验，p<0.05)。

图7：通过靶向和杀伤吞噬细胞，lukab保护金黄色葡萄球菌避免宿主介导的杀伤作用。(a)用金黄色葡萄球菌wt、lukab缺陷型菌株、和lukab缺陷型及具有lukab互补的菌株(δlukab/plukab)，以不同的感染复数(moi)对pmn-hl60细胞进行感染。如图6所示，用sytox绿检查哺乳动物细胞的细胞膜损伤。结果显示为三份重复样品的平均值±标准偏差(s.d.)。(b)所示金黄色葡萄球菌体外感染人类全血后的存活情况。结果为12名供体全血的平均值+s.e.m.。(c)所示金黄色葡萄球菌newman菌株体外感染原代人中性粒细胞(pmn)后的存活情况。结果显示为12名供体的pmn平均值+s.e.m.。(d)用wt/p、δlukab/p、和δlukab/plukab菌株培养物滤液的不同稀释度对原代人pmn的攻毒。测定ldh-释放作为细胞裂解的指标。结果显示为6名供体的pmn平均值+s.e.m.。星号(*)表示与wt菌株newman相比具有统计学显著性差异(student’st检验，p<0.05)。

图8：lukab对金黄色葡萄球菌体内发病的重要性。(a)小鼠肾的生物性发光图像，小鼠用含有pxen1或plukab.xen1的wt金黄色葡萄球菌lac菌株感染。图片显示了每组中具有代表性的代表性两只小鼠的肾。(b)小鼠肾脏回收的载菌量，小鼠用所示金黄色葡萄球菌lac菌株感染。每个数据点表示各动物每毫升组织匀浆中的菌数(cfu)虚线表示检测限。对于栏(a-c和e)*表示与wt具有统计学显著性差异，**表示与δlukab/p具有统计学显著性差异，p<0.05。

图9：lukab通过在细胞膜上形成孔洞杀伤人吞噬细胞。(a)使用rluka+rlukb对pmn-hl60细胞攻毒，通过sds-page和免疫印迹进行检测毒素结合情况，使用luka或lukb的特异抗体。(b)pmn-hl60与rlukab进行孵育，通过facs检测毒素的结合情况，使用兔抗his抗体。(c)用rlukab对pmn-hl60细胞攻毒，通过sds-page和免疫印迹进行检测质膜中lukab寡聚体的形成，使用抗-lukb抗体。(d)在有或者没有peg-400的情况下，用rlukab或皂苷攻毒处理pmn-hl60细胞。lukab孔洞用溴化乙锭进行检测。(e)pmn-hl60细胞存活情况用celltiter进行测定，用培养基处理的细胞设为100％。d和e栏中的结果为三个样品的平均值+/sem。星号(*)表示与-peg(d-e)相比具有统计学显著性差异(student’st检验，p<0.05)。

图10：lukab细胞毒可以被α-luka的多克隆抗体所中和。用5％(v/v)的金黄色葡萄球菌菌株newman的培养物滤液对pmn-hl60细胞进行攻毒，该菌株已用来自两只不同兔子不同采血的α-luka多克隆抗体或免疫前血清以所示量进行孵育。细胞存活情况使用celltiter进行检查，用培养基处理的细胞设为100％。结果显示为三份重复样品的平均值±标准偏差(s.d.)。

图11：luka的c端延伸对lukab的毒性作用是必须的，但对α-luka多克隆抗体的识别是不需要的。(a)使用lasergene软件的megalignclustalw算法对不同金黄色葡萄球菌淋巴细胞毒性s亚单位氨基酸序列(命名为seqidnos:44-49)的比对。只在luka序列中出现的n端和c端延伸使用黑框进行了强调。(b)从e.coli中纯化和用sds-page分离的2μg重组luka(rluka)、lukb(rlukb)、缺失c端延伸的luka(rlukaδ10c)和缺失n端延伸的luka(rδ33nluka)的考马斯蓝染色，以及用不同量的搭配rlukb的rluka、rlukaδ10c和rδ33nluka对pmn-hl60细胞攻毒。终蛋白浓度为等量的rluka、rlukaδ10c或rδ33nluka和rlukb的量。结果显示为三份重复样品的平均值±标准偏差(s.d.)。(c)免疫印迹显示α-luka和α-his多克隆抗体对6xhis-标记的rlukaδ10c具有相同的识别能力。

发明详述

下面的公开，按先后次序分别涉及luka多肽、lukb多肽、luka和lukb多肽、抗-luka和抗-lukb抗体，包含luka和/或lukb的治疗组合物、或抗-luka和/或抗-lukb的抗体、使用该治疗组合物的方法、lukab-介导的细胞毒的抑制剂的鉴定方法以及预测或评价金黄色葡萄球菌感染严重程度的方法。

luka多肽

来自金黄色葡萄球菌的多肽现在已被申请人分离并鉴定，其表现出已知的s亚单位杀白细胞素(例如，luks-pvl、luke和hlgc)活性谱。这些肽在本申请中被称为luka，特异性靶向和结合人类吞噬细胞(但不靶向和结合人上皮细胞或人内皮细胞、或鼠源细胞)，而且一旦结合到吞噬细胞膜上，luka就和金黄色葡萄球菌的f亚单位杀白细胞素(如，本申请中公开的lukf-pvl、lukd和hlgb、和lukb)寡聚化，且寡聚化时形成将跨膜的孔洞(统称为luka活性)。图1中的比对包含luka的主要序列(本申请中命名为seqidno.:1)以及来自13个不同的金黄色葡萄球菌菌株对应的luka多肽(本申请中命名为seqidnos.:2-14)的氨基酸序列。

每个seqidnos:1-14的n端27个氨基酸残基为天然的分泌/信号序列。因此，成熟、分泌型的luka，其为每个seqidnos:1-14序列中的28-351个残基，在本申请中可称为“luka(28-351)”或“成熟luka”。对应的，未成熟形式的luka在本申请中可称为“luka(1-351)”。

基于seqidnos:2-14(相对天然的金黄色葡萄球菌是不全面的)的luka共有序列，包含了luka最少64个位点的变异性(其中连续的变异位点为x¹-x⁶⁴)，指的是如下位点：8(x¹＝l或f)、16(x²＝a或v)、17(x³＝i或l)、24(x⁴＝t或n)、26(x⁵＝q或e)、31(x⁶＝h或n)、38(x⁷＝n或t)、46(x⁸＝s或a)、50(x⁹＝e或d)、55(x¹⁰＝t或n)、56(x¹¹＝n或d)、61(x¹²＝s或t)、62(x¹³＝t或p)、63(x¹⁴＝a、g或v)、73(x¹⁵＝i或v)、78(x¹⁶＝e或v)、77(x¹⁷＝t或s)、80(x¹⁸＝v或e)、83(x¹⁹＝e或k)、84(x²⁰＝e或k)、105(x²¹＝v或i)、124(x²²＝k或r)、125(x²³＝e或n)、127(x²⁴＝k、t或n)、129(x²⁵＝s或a)、130(x²⁶＝n或s)、135(x²⁷＝k或q)、146(x²⁸＝r或s)、148(x²⁹＝r或p)、173(x³⁰＝s或n)、174(x³¹＝s或l)、181(x³²＝t或v)、184(x³³＝i或v)、195(x³⁴＝t或s)、202(x³⁵＝n或k)、208(x³⁶＝s或i)、214(x³⁷＝w或r)、221(x³⁸＝i或v)、229(x³⁹＝g或n)、231(x⁴⁰＝v或i)、237(x⁴¹＝e或d)、239(x⁴²＝l或f)、243(x⁴³＝n或t)、246(x⁴⁴＝i或l)、247(x⁴⁵＝a或s)、278(x⁴⁶＝l或i)、283(x⁴⁷＝s或t)、285(x⁴⁸＝e或d)、288(x⁴⁹＝q或r)、299(x⁵⁰＝i或v)、303(x⁵¹＝r或k)、309(x⁵²＝a或g)、310(x⁵³＝p或q)、315(x⁵⁴＝k或q)、318(x⁵⁵＝d或e)、322(x⁵⁶＝l或f)、325(x⁵⁷＝t或v)、338(x⁵⁸＝v或i)、339(x⁵⁹＝d或e)、342(x⁶⁰＝s或t)、344(x⁶¹＝d、e或q)、347(x⁶²＝p或s)、348(x⁶³＝y或f)、和349(x⁶⁴＝k或r)。

lukb多肽

来自金黄色葡萄球菌的多肽现在已被申请人鉴定，其表现出已知的f亚单位杀白细胞素(例如，lukf-pvl、lukd和hlgb)活性谱。这些多肽在本申请中被称为lukb，其与金黄色葡萄球菌s亚单位杀白细胞素特异性聚合(如，本申请中公开的luks-pvl、luke和hlgc、和luka)，其可结合到人吞噬细胞上；且在寡聚化时在吞噬细胞上形成一个跨膜的孔洞(本申请中统称为lukb活性)。图2中所示的比对包含lukb的主要序列(本申请中命名为seqidno.:15)以及来自12个不同金黄葡萄球菌菌株对应的lukb多肽(本申请中命名为seqidnos.:16-27)的氨基酸序列。

每个seqidnos:15-27的n端的29个氨基酸残基为分泌/信号序列。这样，成熟、分泌型的lukb，其为每个seqidnos:16-27序列中的30-339个残基，可被称为“lukb(30-339)”或“成熟lukb”。对应的，未成熟形式的lukb可称为“luka(1-339)”。

基于seqidnos:15-28(相对于天然的金黄色葡萄球菌lukb是不全面的)的lukb共有序列，包含了luka最少49个位点的变异性(其中连续的变异位点为x¹-x⁴⁹)，指的是如下位点：5(x¹＝l或v)、6(x²＝c或y)、13(x³＝s或t)、15(x⁴＝a或t)、16(x⁵＝l或i)、19(x⁶＝a或t)、20(x⁷＝l或f)、23(x⁸＝f或l)、26(x⁹＝s或t)、28(x¹⁰＝y或f)、34(x¹¹＝e或k)、36(x¹²＝k或t)、37(x¹³＝q、t或a)、46(x¹⁴＝d或e),59(x¹⁵＝s或t)、60(x¹⁶＝q或e)、62(x¹⁷＝n或k)、64(x¹⁸＝t或s)、75(x¹⁹＝p或k)、95(x²⁰＝k或r)、98(x²¹＝n、d或e)、126(x²²＝s或删除)、159(x²³＝r或q)、163(x²⁴＝t或p)、170(x²⁵＝s或k)、187(x²⁶＝l或i)、190(x²⁷＝s或p)、192(x²⁸＝s或t)、193(x²⁹＝s或t)、193(x²⁹＝h或n)、197(x³⁰＝g或a)、204(x³¹＝s或l)、222(x³²＝d或n)、224(x³³＝t或v)、247(x³⁴＝n或d)、270(x³⁵＝n或k)、272(x³⁶＝k或e)、276(x³⁷＝r、q或k)、287(x³⁸＝d或e)、290(x³⁹＝l或i)、294(x⁴⁰＝k或r)、309(x⁴¹＝q或k)、327(x⁴²＝d或n)、329(x⁴³＝l或f)、330(x⁴⁴＝i或v)、332(x⁴⁵＝t或v)、333(x⁴⁶＝f、i或l)、336(x⁴⁷＝k或n)、和338(x⁴⁸＝k或q)。

就一个或多个其他氨基酸的插入、替换或删除而言，luka和lukb杀白细胞素不同于序列分别为seqidnos:2-14和16-27的天然多肽，例如，seqidnos:2-14或16-27的一个或多个氨基酸残基可能被另外一个具有相似极性的氨基酸取代，具有相似极性的氨基酸以功能性等价物发挥作用，从而产生沉默变化。也就是说，相对于天然序列的变化不能明显减小天然luka和lukb的基本特征。例如seqidnos:1和15。luka或lukb的任何此类类似物都可按照本申请中公开的实验方案进行检测(例如，细胞毒性实验和膜损伤实验)，以确定其是否维持了天然的luka或lukb活性。这些杀白细胞素内的替换可以从这些氨基酸所属类别中的其他成员中选择。例如，非极性(疏水性的)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。阳离子(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。

在其他实施方式中，非保守型变化(例如，一个或多个氨基酸替换、删除和/或增加)可用于luka和lukb的失活或减毒。在一个实施方式中，非毒性luka类似物c端342-351位的氨基酸被删除，因此与天然多肽不同。除了seqidnos:4-6(在这些位点包含9个氨基酸)，类似物缺少了10个c-端氨基酸残基。这些类似物统称为lukaδ10c。减毒的luka和lukb可用于本申请所述的活性疫苗组合物中。分子修改可以通过本领域内熟知的方法进行，包括在质粒模板上引物延伸，可使用单链模板(kunkel,proc.acad.sci.,usa82:488-492(1985))、双链dna模板(papworth,等,strategies9(3):3-4(1996))、以及pcr克隆(braman,j.(ed.),invitromutagenesisprotocols,2nded.humanapress,totowa,n.j.(2002))。确定luka或lukb上特定分子的变化是否降低lukab毒性的方法，在本申请中有描述。

因此，根据上文所述及本发明的目的，luka可以以seqidnos:1-14(例如，seqidno:2，其为来自于金黄色葡萄球菌newman菌株的luka多肽)中的任何一个进行更加广泛地描述，或者是与其有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列相似性的多肽(天然的或非天然的)。

类似的，鉴于上文所述及本发明的目的，lukb可以以seqidnos:15-27(例如，seqidno:27，其为来自金黄色葡萄球菌newman菌株的lukb多肽)中的任何一个进行更加广泛地描述，或者是与其有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列相似性的多肽(天然的或非天然的)。

因此，除非有相反说明，无论是天然luka和lukb的未成熟和成熟形式、以及与天然的luka有小于100％序列相似性的序列(即，天然序列和类似物一样，本申请中统称为“luka”和“lukb”)可被用于本发明的组合物和方法中，以及用于制备本发明中的抗luka和抗lukb的抗体。

编码luka和lukb的多核苷酸以及合成或分离luka和lukb的方法

luka和lukb杀白细胞素可通过本领域内熟知的重组dna的方法进行合成。例如，下文将描述编码金黄色葡萄球菌(newman)(seqidno:2)luka多肽的核酸序列(命名为seqidno:28)。编码这一多肽的简并序列(degeneratesequence)(例如，考虑密码子偏好性时，在选择用于重组表达的宿主时有用)、以及编码其他本领域内是熟知的luka多肽的多核苷酸，或可以由本领域内的专业技术人员进行设计。

下文将描述编码金黄色葡萄球菌(newman)(seqidno:27)lukb多肽的核酸序列(本申请中命名为seqidno:29)。编码这一多肽的简并序列(例如，考虑密码子偏好性时，在选择用于重组表达的宿主时有用)、以及编码其他本领域内熟知的lukb多肽的多核苷酸，或可以由本领域内的专业技术人员进行设计。

luka-和lukb-编码的多肽可以在宿主中表达后分离和纯化，宿主例如细菌(e.coli)、植物和/或酵母。或者，luka和lukb杀白细胞素可以按照标准技术从金黄色葡萄球菌中分离(例如，newman菌株)。这样，就可以分离到这些杀白细胞素(从天然或非天然环境中)。它们也可被纯化，如此它们基本上与其他蛋白和细胞组分分离，所述其他蛋白和细胞组分在天然状态下(即，金黄色葡萄球菌细胞中存在的蛋白和细胞组分)或非天然状态下(即，重组细胞宿主的蛋白和细胞组分)与金黄葡萄球菌luka和lukb相关。适合的纯化方案，典型地包含至少两个连续步骤的组合，且为本领域内熟知的。参见，deutscher，methodsinenzymology，182(1990)；以及scopes,proteinpurification:principlesandpractice,springer-verlag,n.y.(1982)，这些文献使用两个或多个标准技术组合的方法，标准技术例如亲和柱层析和离子交换液相色谱。

抗-luka抗体和抗-lukb抗体

本发明的一些方面涉及特异结合luka的抗-luka抗体、和特异结合lukb的抗-lukb抗体、包含这些抗体的治疗用组合物及其使用方法。本发明中，术语“抗体”包含单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、以及这些抗体的基因工程形式、及其组合物。更具体的，术语“抗体”，可与“免疫球蛋白”替换使用，包含全长(即，天然存在的或常规免疫球蛋白基因片段重组方法形成的)免疫球蛋白分子(例如，igg抗体)及其免疫活性片段(即，包含全长免疫球蛋白分子的特异性结合部分)，同样其可以是天然存在的或合成的。据此，术语“抗体片段”包括抗体的一个部分，例如f(ab')2、f(ab)2、fab'、fab、fv、scfv等。不论结构如何，抗体片段可以结合全长抗体可以识别的相同抗原，在本发明中特别是指结合luka、lukb或lukab复合物。制备和检测抗体片段的方法在本领域内是熟知的。

在一些实施方式中，本发明的抗-luka抗体可能会和其他葡萄球菌杀白细胞素s亚单位，例如higc、luks-pvl、hlga、luks-i、luke、lukev和lukm有一定程度的交叉反应。类似的，在一些实施方式中，本发明的抗-lukb抗体可能会和其他葡萄球菌杀白细胞素f亚单位，例如lukf’-pv、lukf-pv、lukdv、lukd、lukf-i和hlgb有一定程度的交叉反应。抗-luka和/或抗-lukb抗体可分别抑制和降低luka活性和lukb活性。在一些实施方式中，抗luka和/或抗lukb抗体分别中和(例如，基本消除)luka和lukb的活性。

天然存在的抗体通常有两条相同的重链和两条相同的轻链，每条轻链通过链间的二硫键共价结合到重链上，以及通过多个二硫键进一步使重链彼此连接。各链可以折叠为具有相似大小的结构域(110到125个氨基酸)和结构，但功能可以不同。轻链由一个可变区(vl)和/或一个恒定区(cl)组成。重链也包括一个可变区(vh)和/或3个或4个恒定区(ch1、ch2、ch3和ch4)，这依赖于抗体的类型或同种型的不同而不同。人类中，同种型为iga、igd、ige、igg和igm，其中iga和igg还可进一步分为亚类或亚型(iga1-2个，igg1-4)。

通常来讲，不同抗体间的可变区氨基酸具有很高的变异性，特别是在抗原结合位点。在每个vl和vh中都有三个称为高变区或互补决定区(cdr)的区域，其由称为框架可变区的低变区域支撑。发明的抗体包括igg单克隆抗体，但本发明的抗体也包含抗体片段或其工程形式。例如，它们是fv片段或蛋白，其中示例性抗体的cdr和/或可变区被构建为单链的抗原结合蛋白。

组成vl和vh结构域的抗体部分称为fv(可变片段)并构成了抗原结合位点。单链fv(scfv或sca)为在一条多肽链上包含vl和vh结构域的抗体片段，其中一个结构域的n端和另一个结构域的c端通过柔性连接相连接。用于生成单链抗体的连接肽是典型的柔性肽，其被选择用以保证vl和vh结构域进行正确的三维折叠。连接体通常为10到50个氨基酸残基，在某些情况下可以更短，例如，约10到30个氨基酸残基，或12到30个氨基酸残基，或者甚至是15到25个氨基酸残基。这种连接肽的例子包括四个重复的甘氨酸残基，其后接丝氨酸残基。

单链抗体缺乏完整抗体的部分或全部的恒定结构域。因此，他们能克服完整抗体使用中的一些相关问题。例如，重链恒定区和其他生物分子间的相互作用是不希望发生的，而单链抗体则易于克服这个问题。另外，单链抗体比完整抗体要小很多，可以比完整抗体有更强的渗透能力，使其可以更有效地定位和结合到目标抗原结合位点。另外，单链抗体比起完整抗体相对较小，使其不大可能在受体中引起不希望的免疫反应。

fab(片段，抗原结合)指的是由vl、cl、vh和ch1结构域组成的抗体片段。木瓜蛋白酶消化后产生的片段可以简单地称为fab，且不保留重链铰链区。胃蛋白酶消化后，可产生保留重链铰链区的各种fab。保留了完整的链间二硫键的片段称为f(ab')2，而二硫键未保留的为单fab'。f(ab')2片段比单价的fab片段对抗原有更高的亲和力。

fc(片段结晶)是指包括配对的重链恒定区的抗体部分或片段。在igg抗体中，例如，fc包括ch2和ch3结构域。iga或igm抗体的fc还包含ch4结构域。fc与fc受体的结合、补体介导的细胞毒性和抗体依赖的细胞毒性(adcc)的活化相关。对于iga和igm等的抗体，其为多个igg样蛋白的复合物，复合物的形成需要fc恒定区。

最后，铰链区将抗体的fab和fc部分分离开，使fab之间和与fc间能相对运动，也包括用于两条重链共价连接的多个二硫键。

抗体“特异性”指的是抗体对特定抗原表位的选择性识别。术语“表位”包括任何的蛋白决定簇，其能够特异结合免疫球蛋白或t细胞受体或与其他分子的相互作用。表位决定簇通常由分子，例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链的化学活性表面基团组成，且通常有特定的三维结构特点，以及特定的电荷特点。表位可以是“线性的”或“构象性的”。在线性表位中，蛋白和相互作用分子(例如抗体)间相互作用的所有点都是沿着蛋白的主要氨基酸序列以线性方式出现的。在构象表位中，相互作用点出现在蛋白的彼此不相邻的各氨基酸残基上，即，非相邻的氨基酸通过蛋白的三级折叠并列在一起。相邻氨基酸形成的表位通常在暴露于变形剂时会被保留，然而通过三级折叠形成的表位通常在用变形剂处理时会丢失。典型的表位在唯一的空间构象中，包含至少3个、通常更多的、至少5个或8-10个氨基酸。设别相同表位的抗体可在简单的免疫试验中进行验证，该试验表明一个抗体具有阻止另一个抗体结合到目标抗原上的能力。

本发明的单克隆抗体可以是鼠源的、人源的、人源化的或嵌合的。人源化的抗体是重组蛋白，其中一个物种来源的抗体cdr；物种例如，鼠、兔、狗、羊、马、或鸡的抗体(或任何其他合适的动物抗体)，从鼠抗体的重链和轻链的可变链转移到人的重链和轻链可变区。抗体分子的恒定区来源于人类抗体的恒定区。制备人源抗体的方法在本技术领域内是熟知的。嵌合抗体优选地含有基本或完全来源于人抗体的恒定区，以及基本或完全来源于非人类的哺乳动物可变区序列的可变区。通过用人的对应序列替代鼠源(其他非人哺乳动物)抗体的可变区，而不是高变区或互补决定区(cdr)，嵌合过程可被更有效的进行。可变区，而非cdr，也被称为可变框架区(fr)。然而，本发明的其他单克隆抗体是双特异的，即他们对luka和lukb都有特异性。双特异性的抗体优选人的或人源化的。

上述抗体可以通过标准的技术流程而获得。例如，luka、lukb(本发明中使用的这些术语，包括其非毒性的类似物，例如lukaδ10c)或可被给予至对象(例如，人或小鼠等哺乳动物)的luka、lukb免疫活性片段。杀白细胞素可以被单独用作免疫原或可以连接到载体蛋白或其他物体，例如像凝胶珠之类的珠。哺乳动物产生抗体后，产生抗体的细胞的混合物，细胞例如脾脏细胞，被分离出来，从中可以获得多克隆抗体。单克隆抗体的产生可从通过将单独的抗体产生细胞从混合细胞中分离，并将其进行永生化处理，通过例如与骨髓瘤细胞等肿瘤细胞融合。生成的杂交瘤可保存于培养基中，且从培养上清中可以获得单克隆抗体。

制备重组单克隆抗体的方法在本技术领域内是熟知的。重组多克隆抗体的制备可通过类似美国申请公开号2002/0009453中描述的使用luka、lukb或lukab为抗原的方法进行。

治疗组合物

luka和lukb可制备成一种治疗组合物，用作治疗急性炎症，包括局部急性炎症的抗炎剂。luka和lukb也可被制备成治疗组合物用作主动疫苗。抗luka和抗lukb的抗体也可被制备成治疗组合物用作被动疫苗。被动和主动疫苗可被预防性地用于抑制金黄色葡萄球菌感染的发生，或治疗性地用于治疗金黄色葡萄球菌感染，尤其对于像mrsa这样的难于治愈的金黄色葡萄球菌感染、或者在特定对象身上传统的抗生素疗法已经验证难以治疗的金黄色葡萄球菌感染。

在用作主动疫苗的治疗组合物的实施方式中，luka和/或lukb可被改变以降低毒性。分子变化前文已有描述。像lukaδ10c这样的非毒性类似物就可以使用。申请人认为，在应答非毒性抗原时产生的抗体可以中和毒性的、天然的luka或lukb。其他以降低luka和lukb毒性为目的的变化包括化学处理(例如，特定氨基酸的修饰)或连接另外一个分子(例如，连接至其它细菌抗原，例如细菌多糖或细菌糖蛋白)。以灭活或脱毒(或减毒)为目的对其他金黄色葡萄球菌毒素进行的化学变化是熟知的。对于给定的变化是否会降低luka或lukb毒性的鉴定方法在本技术领域内是熟知的，和/或在本文中有描述。

本发明的治疗用组合物可以通过luka和lukb、或者抗luka和抗lukb抗体的配置而制备，使用药用的载体和辅料(如果需要)。本文中使用的术语“药用的载体”和“药用的辅料”(例如，像填充剂、免疫刺激剂、佐剂、抗氧化剂、防腐剂和增溶剂的添加剂)是指在使用的剂量和浓度下对暴露的细胞或哺乳动物无毒性的。例如药用载体包括水，例如使用磷酸盐、柠檬酸盐和另外的有机酸进行缓冲的水。可用于本发明的药用辅料的代表性实例包括像抗坏血酸这样的抗氧化剂；低分子量(小于10个残基)的多肽；像血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白这样的蛋白；佐剂(选择没有诱导毒性的佐剂，例如美国专利6,355,625中描述的β-葡聚糖、或粒细胞集落刺激因子(gcsf))；亲水性聚合物，如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖，和其它碳水化合物(包括葡萄糖，甘露糖或糊精)，螯合剂如edta；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；反离子的盐，如钠；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(peg)、和

与本文中其他所述一样，本发明的治疗组合物可以进一步包括至少一种其他的活性剂。

本发明的治疗组合物的制备存储可以通过将具有所需纯度的一种或多种活性组分和药学上可接受的载体，以及可选地，辅料和/或其他活性剂混合，制备成冻干制剂或水性溶液的形式。

治疗组合物的用途---适应症

急性炎症

炎症通常可被理解为保护性生物学反应以去除有害入侵刺激物，例如致病菌(例如，细菌和病毒)、损伤的细胞和刺激物，并启动伤口愈合。炎症还可被更具体的理解为针对创伤的血管化的活体组织的反应。因此，炎症是一个针对生理、化学或生物剂导致的创伤或异常刺激而产生的、受影响的血管和邻近组织的细胞和化学反应的基础常规复合过程。炎症通常会导致体液和血细胞在创伤部位的累积，这通常为一个愈合过程。如果没有炎症过程，伤口和感染将不能愈合，而且组织的渐进性损伤可能会威胁生命。急性炎症指的是身体对入侵刺激物的初始响应，这涉及血浆和白血球细胞(白血球)在创伤或感染组织部位的募集。长期炎症，也称为慢性炎症，涉及炎症部位存在的免疫细胞类型的渐进性变换，且其特点是炎症过程中同时存在组织的破坏和愈合。

然而，炎症有时会导致损伤，通常是炎症正常过程的紊乱导致的。炎症疾病是指那些与炎症有关的、有炎症特点的、导致炎症的、由炎症产生的、或受炎症影响的疾病。本文中使用的术语“急性炎症”，根据常规的医疗用语，指的是发生快速并伴有严重症状的炎症。发病的持续时间，从患者的正常状态到炎症症状非常明显的状态，通常会持续达72小时。急性炎症与慢性炎症相反，慢性炎症是一个长期的炎症状态，这指的是一种变化很小或进展缓慢的疾病。对医学领域内人员而言急性和慢性的区别是熟知的。

参与炎症急性期以及急性炎症疾病的主要免疫细胞包括单核细胞(例如，单核白细胞，其响应炎症反应后分化成吞噬细胞)、树突状细胞、和中性粒细胞(其迁移到炎症部位)。这些免疫细胞通过释放免疫介质，例如组胺、γ-干扰素、il-8、白三烯b4、一氧化氮等以及通过消化细菌、病毒和细胞碎片(称为吞噬作用的过程)来促进炎症反应。在本领域内这些细胞统称为吞噬细胞。

申请人已经发现lukab能靶向并杀死人类吞噬细胞，而且这些lukab介导的细胞毒性基本针对这些细胞而不是其他的哺乳动物有核细胞。不限于任何特定的工作原理，申请人相信luka/lukb复合物可在浸润吞噬细胞的质膜形成孔洞，导致细胞死亡，从而减少炎症反应。因此，不管导致炎症的原因如何，例如，任何的细菌或病毒感染，且在优选的实施方式中为局部的急性炎症，本发明的抗炎症组合物在治疗人类，例如哺乳动物中的急性炎症是很有用的，。这一状态的其他例子包括过敏性接触性皮炎、急性超敏反应、急性神经炎症损伤(例如，由急性感染所导致的)、急性心肌梗塞、心肺搭桥手术导致的急性神经元损伤、以及由细菌或病毒感染导致的急性局部抗炎症。

在优选的实施方式中，急性炎症是一种皮肤或软组织的感染性创伤。适用于本发明治疗的创伤可以是活组织的刺穿、切割或撕裂形式。皮肤伤口可以渗透到上皮、真皮或全层伤口、皮下组织。因此，可用本发明的治疗组合物治疗的伤口包括深层的胸骨伤口，例如，开放性心脏手术后的伤口和腹部及任何形式的手术后的术后伤口。其他伤口为枪击、刀具、或任何其他能够造成皮肤切口或撕裂的物体导致的创伤。本发明的治疗适用于作为药物副作用的伤口或各种病理症状的伤口(例如，卡波西氏肉瘤相关的褥疮)，以及内部伤口(如，肛裂和胃肠道伤口或损伤，例如胃部或肠道溃疡)。

其他适合用本发明治疗组合物治疗的急性炎症包括结膜炎、虹膜炎、葡萄膜炎、中心性视网膜炎、外耳炎、急性化脓性中耳炎、乳突炎、迷路炎、慢性鼻炎、急性鼻炎、鼻窦炎、咽炎、扁桃体炎、接触性皮炎、皮肤神经机能病(dermonecrosis)、糖尿病性多发性神经炎、多肌炎、骨化性肌炎、退化性关节炎、类风湿关节炎、肩周炎和变形性骨炎。

金黄色葡萄球菌感染

本发明还提供了一种通过给所需的哺乳动物对象给予抗体组合物而抑制金黄色葡萄球菌感染的发病或对其进行治疗的方法，本发明的目标对象人群包括哺乳动物，如感染或有感染金黄色葡萄球菌风险的人类。在一些实施方式中，将接受治疗的对象感染了金黄色葡萄球菌，包括mras，和/或已经使用抗生素或其他治疗制剂而治疗失败的对象。

治疗有效量

在关于急性炎症治疗的描述中，luka和lukb的剂量是有治疗有效的是指，治疗能够获得任何一个或多个症状数量的减少、至少一种症状的严重程度降低、或至少一种症状的进一步恶化延迟、或甚至急性炎症的总体缓解。

在关于治疗组合物作为金黄色葡萄球菌感染的被动或主动疫苗的描述中，治疗有效量的luka和lukb、或抗luka和抗lukb抗体也是预防性有效是指，给予这些组合物可以获得下述中的一种或多种效果：在有风险感染金黄色葡萄球菌，和感染了金黄色葡萄球菌的哺乳动物对象中金黄色葡萄球菌感染得到抑制或预防、症状数量的减少、至少一个症状严重程度的减轻、或至少一个症状恶化的延缓、或甚至感染总体得到减轻。

广义上讲，luka、lukb和抗luka和抗lukb抗体的治疗有效量可以按照标准程序进行确定，这要将许多因素都考虑进来，包括，例如，组合物中的活性剂浓度、给予的方式和频次、要治疗(或预防)的急性炎症或金黄色葡萄球菌感染的严重程度、以及对象的详细情况，例如年龄、体重和总体健康和免疫情况。通用指南可以在，例如internationalconferenceonharmonization和remington'spharmaceuticalsciences(马克出版公司1990)的出版中找到。医务人员可以给予luka和lukb或抗luka和抗lukb抗体，直到这样的剂量即能提供预期的或需要的预防或治疗效果。这一治疗过程通过常规实验可以很容易地进行监控。

治疗有效量的luka和lukb的典型范围可以是每次剂量或每天的luka和lukb均为1-400μg。优选的，luka和lukb的量是基本相同的。治疗有效量的抗体组合物典型地为每公斤体重至少50mg组合物(mg/kg)，这包括每次剂量或每天至少100mg/kg、至少150mg/kg、至少200mg/kg、至少250mg/kg、至少500mg/kg、至少750mg/kg和至少1000mg/kg。单克隆抗体组合物剂量可能会更低，例如大概是非单克隆抗体组合物的十分之一，例如至少约5mg/kg、至少约10mg/kg、至少约15mg/kg、至少约20mg/kg、或至少约25mg/kg。给予方式

给予前，本发明的治疗组合物可以是无菌制剂，其可以在冻干和配制前后，通过无菌滤膜过滤而轻松实现。治疗组合物可置于具有无菌接口的容器中，例如，具塞的静脉注射溶液袋或瓶，塞可被皮下注射针头刺穿。

抗炎组合物可以按照可接受的医疗实践以任何数量的给予途径进行给予。优选的方式包括使用本领域内熟知的技术进行静脉、肌内、皮下和经皮给予。也可以考虑其他的给予途径。在局部急性炎症中，非系统性的给予可能是优选的，这种情况下治疗组合物给予急性炎症部位或其周围。

联合治疗

在一些实施方式中，治疗组合物是作为和其它活性剂联合治疗的一部分进行给予的，这取决与急性感染的本质或要治疗的金黄色葡萄球菌感染的性质。这些其它活性剂包括抗感染药物、抗生素、和抗微生物药物。本发明中有用的代表性抗感染药物包括万古霉素和溶葡球菌酶。本发明中有用的代表性抗生素和抗微生物药物包括耐青霉素酶青霉素，头孢菌素和碳青霉烯，包括万古霉素，溶葡球菌酶，青霉素g，氨苄西林，苯唑西林，萘夫西林，邻氯青霉素，双氯青霉素，头孢噻吩，头孢唑林，头孢氨苄，头孢拉定，头孢孟多，头孢西丁，亚胺培南，美罗培南，庆大霉素，替考拉宁，林可霉素和氯林可霉素。这些抗生素的剂量在本领域内是熟知的。参见，例如，merckmanualofdiagnosisandtherapy,第13节,第157章,100^thed(beers&berkow,eds.,2004)。抗炎症、抗感染、抗生物和/或抗微生物剂可与本发明的创新性治疗组合物在给予前进行组合合，或同时给予(作为相同组分或不同组分)或相继给予。

在一些实施方式中，抗luka和/或抗lukb抗体组合物是多价的，这样其也包含可特异结合其他细菌性抗原的抗体(以及可选地，可以中和其他细菌性抗原的抗体)。抗体可特异性结合任何本发明在关于疫苗组合物中所述的抗原。因此，例如，其他抗体可特异结合多糖或糖蛋白，包括金黄色葡萄球菌5型、金黄色葡萄球菌8型、金黄色葡萄球菌336、杀白细胞素组分，例如pvl(包括单独的pvl亚单位、luks-pv和lukf-pv)γ-溶血素亚单位(hlga、hlgb、和hlgc)、来自金黄色葡萄球菌的luke或lukd、来自金黄色葡萄球菌的lukm或lukf'-pv、脂磷壁酸(lta)和识别粘附性基质分子(mscramm)蛋白的微生物表面组分。

治疗方案

本发明的治疗组合物可以单剂量给予、或按照多剂量的方案给予。例如，相对小剂量的治疗组合物进行给予，如一次或两次给予。在包括传统抗生素治疗的实施方式中，传统治疗通常包括数天或数周时间的多剂量，抗生素可以每天服用一次、两次或三次或更多次，持续一段时间，如至少5天、10天或甚至14天或更多天，而抗体组合物通常仅给予一次或两次。然而，本领域普通技术人员可以选择和调整不同的给药剂量、给药时间和治疗组合物和抗生素的相对量。

lukab介导的细胞毒性抑制剂的鉴定方法和毒性降低的luka和lukb的变化形式

抗-luka和抗-lukb抗体及其片段、以及其他潜在的治疗部分(例如，有机小分子)可用于不同的方法(包括区分或筛选试验)中，以评价其抑制lukab介导的细胞毒性的能力。如下所述，这些方法是设计用于鉴别某些物质，所述物质可以抑制导致lukab介导的细胞毒性或人类吞噬细胞裂解的级联事件的某些方面。这些方法也设计用于鉴别luka和lukb的变化形式，这些变化形式相对于天然物质具有较小的毒性。作为级联反应一部分的目标事件包括，例如，luka结合到吞噬细胞膜上、lukb结合到luka上(lukab寡聚化)、以及阻止lukab低聚体形成膜孔洞。区分试验通常需要人类吞噬细胞(或lukab膜结合部分)、适宜的培养基、以及纯化的luka或纯化的luka和lukb。

技术人员应理解，如下的实验方案只是示例性的，且各种操作参数，例如反应条件、检测标记以及装置(例如检测和定量仪器)的选择是可以进行适当变化的。

下面的方法基本涉及lukab细胞毒性抑制剂的鉴别方法，而不需要揭示出级联过程中哪个具体的事件受到了影响。

为了鉴别lukab细胞毒性抑制剂，人类吞噬细胞(例如，pmn-hl60细胞)可以终体积为50μl的rpmi(gibco)中，5×10³个细胞/孔的密度铺于384孔的黑色净底组织培养处理平板(康宁)，补充10％的热灭活胎牛血清(fbs)。细胞然后和测试化合物/分子接触/混合/反应/处理(～5μl/不同浓度下)，然后用luka和lukb攻毒，其在优选的实施方式中基本被纯化(5μl的～0.001–2μm的溶液)，优选一起加入，在培养状态下使luka和lukb攻毒吞噬细胞，例如5％co2、37℃进行1小时。作为对照，细胞可以用培养基处理(100％存活)，以及用0.1％v/vtritonx100(100％死亡)。

在这些实施方式中，上述处理的细胞随后可以与染料进行孵育，以监测细胞的存活，例如用celltiter(promega)(其能通过测定吸收值量化细胞代谢活性而计量培养基中存活细胞数目，从而确定细胞存活情况)，且额外孵育一段时间(例如，5％co2下37℃大约进行2小时)。然后可以确定细胞存活，例如通过读板器，例如envision2103multi-labelreader(perkin-elmer)测定294nm处比色反应。细胞存活百分比可通过如下公式进行计算：％存活率＝100×(ab492样品-ab492tritonx)/(ab492组织培养液)。百分存活率的增加提示lukab细胞毒性的抑制。

将一检测的变体被称为膜破损实验。在这些实施方式中，细胞使用如上方法处理(例如，按照或包括用测试化合物/分子处理细胞，然后使用纯化的luka攻毒细胞，其后使用不能透过细胞的荧光染料如sytox绿孵育(0.1μm；invitrogen)(按照说明书)并孵育，例如在室温避光继续孵育15分钟。荧光，作为膜破损的指示剂，可以使用读板器，例如envision2103multilabelreader(perkin-elmer)在激发波长485nm、发射波长535nm处进行测定。荧光降低提示lukab细胞毒性受到抑制。

总之，这些试验有助于抑制或减少lukab对人类吞噬细胞毒性作用的化合物鉴定。

还可单独或和如上方法一起使用其他方法，特别是如果上述方法发现有抑制活性时，其可使本领域内的专业人员更精确地确定生化级联反应中的哪个事件受到该物质的影响或被靶向。这些级联反应事件包括，例如，luka结合到吞噬细胞膜上、lukb结合到luka上(lukab寡聚化)、以及阻止lukab低聚体形成膜孔洞。

luka结合目标细胞的抑制剂的筛选

为了筛选可以阻止或减少luka与目标细胞结合的抑制剂，这被认为是攻毒过程的第一步，人类吞噬细胞(例如，pmn-hl60细胞)可以终体积为50μl的rpmi(gibco)中2.5×10³个细胞/孔的密度铺于384孔的黑色净底组织培养处理平板(康宁)，补充10％的热灭活胎牛血清(fbs)。然后细胞用测试化合物/分子(～5μl/不同浓度)进行处理，并使用纯化的荧光标记的luka攻毒(例如，fitc、cy3、cy5、apc、pe)，5ul～0.01–2μm溶液在37℃、5％co2条件下处理1小时。为了评价测试化合物/分子的效力，可通过测定细胞相关荧光来作为luka与细胞结合的指示剂，，例如，使用用于高通量筛选和高含量分析能力的自动荧光显微成像系统(例如，cellomicsarrayscanhcsreader(thermoscientific)(激发波长485nm,发射波长535nm))。

luka-lukb寡聚化/相互作用抑制剂的筛选

为了筛选可以阻止或减少luka/lukb相互作用的抑制剂，luka/lukb相互作用被认为是攻毒过程的第二步，人类吞噬细胞(例如，pmn-hl60细胞)可以终体积为50μl的rpmi(gibco)中2.5×10³个细胞/孔的密度铺于384孔的黑色净底组织培养处理平板(康宁)，补充10％的热灭活胎牛血清(fbs)。然后细胞可使用测试化合物/分子进行处理，然后用纯化的luka和纯化的lukb的混合物进行攻毒，其中lukb荧光标记了荧光分子，如fitc、cy3、cy5、apc、和pe，且可使其持续到攻毒过程完成(例如，37℃，5％co2进行1小时)。为了评价测试化合物/分子的效力，可测定细胞引关的lukb-fitc荧光作为luka/lukb-fitc相互作用的指示剂，例如，使用用于高通量筛选和高含量分析的自动荧光显微成像系统(例如，cellomicsarrayscanhcsreader(thermoscientific)(激发波长485nm,发射波长535nm))。

lukab孔洞形成的抑制剂筛选

为了筛选可以阻止或抑制lukab孔洞形成的抑制剂，也即是导致细胞裂解的效应分子，人类吞噬细胞(例如，pmn-hl60细胞)可以终体积50μl的rpmi(gibco)中2.5×10³个细胞/孔的密度铺于384孔的黑色净底组织培养处理平板(康宁)，补充10％的热灭活胎牛血清(fbs)。然后细胞使用测试化合物/分子进行处理(～5μl，包含不同浓度)，然后使用纯化的lukab(～0.001–2μm)于37℃，5％co2条件下处理10分钟。用培养基处理(阴性对照)以及用0.1％v/vtritonx100的处理(阳性处理)的pmn-hl60细胞作为对照。

为了评价宿主细胞表面的lukab孔洞，可以使用溴化乙锭(eb)流入实验。eb是小分子阳离子染料，其不能渗透进入健康宿主细胞。当lukab形成阳离子孔洞时，eb可进入细胞并结合到dna上，由此发出荧光。这种方式处理的细胞然后使用eb(5μm)在室温下避光继续孵育5分钟。为了评价测试化合物/分子在抑制lukab孔洞形成方面的效力，可以使用读板器测定荧光作为孔洞形成指示，读板器例如envision2103multilabelreader(perkin-elmer)，激发波长为530nm，发射波长为590nm。该实验有助于鉴定那些能阻止或抑制lukab孔洞形成的分子，这些分子将可缓解lukab介导的毒性。

为预测感染严重程度，测定lukab由临床分离的金黄色葡萄球菌的产生的方法

本发明的另一方面还涉及预测或评价金黄色葡萄球菌感染严重程度的方法，该方法包括在感染对象获得的生物样品中，检测luka和/或lukb的存在情况及数量或检测其对应基因。作为对照(例如金黄色葡萄球菌菌株usa100和usa400)，仅产生少量或无法检测到的luka和/或lukb，如果相对于对照检测到luka和/或lukb的存在与或检测到相对高的量，或者检测到其对应的基因(如，金黄色葡萄球菌菌株newman、4645和mrsa菌株usa300和usa500)的存在，则提示存在严重的感染。对于luka和/或lukb存在或相对量的检测，可参见图4a的说明。该方法的示例性实施方式如下有述。

免疫印迹分析测定luka和lukb的水平

为了测定lukab的水平(即，lukab的量)，可从感染对象身上获取生物样品，例如体液(如，血液)或组织样本，随后让样本暴露于适宜的培养条件下，使得金黄色葡萄球菌生长，获取培养上清，从中分离细菌蛋白，鉴别luka和/或lukb，以及随后对luka和/或lukb进行定量。更具体地，在一个实施方式中，可以选择临床分离的菌株并使其生长于合适的培养基上，例如royalparkmemorialinstitute的培养基1640(rpmi；invitrogen)，补充1％的酪蛋白氨基酸(rpmi+cas)，在合适的培养条件下培养，例如37^οc180rpm振摇培养12-18小时。然后通过离心使细菌沉底，并收集上清进行培养。培养上清(～30μl)然后和10μl的sds-laemmli缓冲液混合，在95℃下煮10分钟。然后进行蛋白分离，例如，使用15％sds-page胶，然后转移到固相支持物上，例如消化纤维素膜。然后将膜和抗luka或lukb的抗体(例如，兔多克隆抗体)进行孵育，可以通过使用结合到荧光团上的二抗(例如，结合alexafluor-680的抗兔抗体；invitrogen)检测抗体-luka/抗体-lukb复合物方法，对是否存在luka和lukb进行观察。然后，将膜进行干燥和扫描，例如使用odyssey红外成像系统(li-corbiosciences)检测luka和lukb的量。

检测luka和/或lukb基因存在的聚合酶链式反应(pcr)

为了测定编码lukab基因的存在，从感染对象身上获得的生物样品，暴露于适合的培养条件下，使得金黄色葡萄球菌生长，从培养的金黄色葡萄球菌中提取核酸，然后使用pcr或其他合适的扩增方法进行至少一轮的核酸扩增，其中使用luka和/或lukb特异引物，并检测luka和/或lukb。因此，在一个示例性的实施方式中，初期的样品制备后，将临床分离的菌株在固体培养基，例如1.5％琼脂凝固的胰化蛋白大豆培养基(tsb)上于37℃进行培养。然后挑选金黄色葡萄球菌进行酶消化，例如，使用tsm缓冲液(100mmtrisph7，500mm蔗糖，10mmmgcl2)中的2mg/ml溶葡球菌酶(ambiproductsllc)于37℃处理10分钟。然后将样品离心，弃上清，使用100μl的无菌水悬浮沉淀，然后在100℃煮沸5分钟并离心。上清为扩增反应，例如使用luka和/或lukb特异的引物的pcr提供了起始原料和dna模板。

本申请还涉及以下实施方式：

实施方式1.用于抑制金黄色葡萄球菌感染的发病或对其进行治疗的活性剂，所述活性剂包括至少以下一种：a)治疗有效量的luka多肽，其具有seqidnos:1-14中任意一个所示的氨基酸序列，或者与seqidnos:1-14任意一个所示的氨基酸序列具有至少70％序列相似性的序列(“luka”)；b)治疗有效量的lukb多肽，其具有seqidnos:15-27任意一个所示的氨基酸序列，或者与seqidnos:15-27任意一个所示的序列具有至少70％序列相似性的序列(“lukb”)；c)治疗有效量的抗-luka抗体，其与luka特异性结合；或者d)治疗有效量的特异性结合lukb的抗体。

实施方式2.根据实施方式1所述的活性剂，其中a)是成熟的luka多肽。

实施方式3.根据实施方式1所述的活性剂，其中a)包含缺乏氨基酸残基的luka多肽，所述氨基酸残基对应于seqidnos:1-14任意一个的342-351位置。

实施方式4.根据实施方式1所述的活性剂，其中b)是成熟的lukb多肽。

实施方式5.抑制金黄色葡萄球菌感染的发病或对其进行治疗的治疗组合物，所述治疗组合物包括如实施方式1所述的活性剂，和药学上可接受的载体。

实施方式6.根据实施方式5所述的治疗组合物，所述治疗组合物包括治疗有效量的抗-luka抗体、治疗有效量的抗-lukb抗体、或治疗有效量的抗-luka抗体和抗-luk-b抗体。

实施方式7.抑制金黄色葡萄球菌感染的发病或对其进行治疗的方法，所述方法包括向所需的哺乳动物对象给予如实施方式5所述的治疗组合物。

实施方式8.根据实施方式7所述的方法，其中所述炎症是急性的。

实施方式9.根据实施方式8所述的方法，其中所述急性炎症是局部的。

实施方式10.根据实施方式8所述的方法，其中所述急性炎症是皮肤或软组织感染性创伤。

实施方式11.根据实施方式7所述的方法，其中所述金黄色葡萄球菌感染是mrsa感染。

实施方式12.鉴定lukab-介导的细胞毒性的抑制剂的方法，所述方法包括a)在反应介质中将人吞噬细胞和至少一个浓度的测试化合物相接触，随后在允许luka和lukb对吞噬细胞进行攻毒的条件下加入luka和lukb；b)将a)中的吞噬细胞与可透过细胞或不可透过细胞的检测标记相接触；以及c)检测吞噬细胞摄入的透过性标记的量，将所述量作为b)中的吞噬细胞活力的函数，其中所述标记的量相对于至少一种对照增加，表明细胞活力增强且测试化合物能抑制lukab介导的细胞毒性，或c')检测吞噬细胞的膜损伤，将其作为不透过性标记的量的函数，其中所述标记的量相对于至少一种对照减少，表明所述测试化合物抑制lukab介导的细胞毒性。

实施方式13.鉴定luka抑制剂与人吞噬细胞结合的方法，所述方法包括a)在反应介质中将人吞噬细胞和至少一个浓度的测试化合物相接触，随后在允许luka与吞噬细胞结合的条件下加入带有可检测标记的luka；以及b)检测所述标记的量，将所述量作为luka与吞噬细胞结合的函数，其中所述标记的量相对于至少一种对照减少，表明所述测试化合物抑制luka与人吞噬细胞结合。

实施方式14.鉴定lukab寡聚化的抑制剂的方法，所述方法包括：a)在反应介质中将人吞噬细胞和至少一个浓度的测试化合物接触，随后在允许luka与吞噬细胞结合以及允许luka和lukb寡聚化的条件下加入luka和带有可检测标记的lukb；以及b)检测所述标记的量，将所述量作为luka和lukb寡聚化的函数，其中所述标记的量相对于至少一种对照减少，表明所述测试化合物抑制luka和lukb的寡聚化。

实施方式15.鉴定人吞噬细胞膜上lukab孔洞形成的抑制剂的方法，所述方法包括：a)在反应介质中将人吞噬细胞和至少一个浓度的测试化合物接触，随后在允许luka和lukb对吞噬细胞进行攻毒的条件下加入luka和lukb；b)使luka与吞噬细胞结合，以及luka和lukb寡聚化；将a)中的吞噬细胞与可检测标记接触，所述可检测标记不可透过非攻毒的吞噬细胞；以及c)检测吞噬细胞摄入所述标记的量，将所述量作为在吞噬细胞膜上lukab介导孔洞形成程度的函数，其中所述标记的量相对于至少一种对照减少，表明所述测试化合物抑制人吞噬细胞膜上的lukab孔洞形成。

实施方式16.根据实施方式13-15中任意一项所述的方法，其中所述可检测标记是荧光染料。

实施方式17.根据实施方式16所述的方法，其中所述荧光染料选自fitc、cy3、cy5、apc和pe。

实施方式18.根据实施方式15所述的方法，其中所述可检测标记是溴化乙锭。

实施方式19.预测金黄色葡萄球菌感染严重程度的方法，所述方法包括：a)通过来自感染对象的体液或组织样品，培养来自所述感染对象的金黄色葡萄球菌；以及b)从培养的金黄色葡萄球菌中的luka和/或lukb进行提取和定量；其中相对于几乎不产生luka和/或lukb或产生的量不可检测的对照而言，检测到b)中的luka和/或lukb存在或检测的量相对较高，提示对象感染严重。

实施方式20.含有活性剂的组合物，所述活性剂包括作为药物的以下至少一种：a)治疗有效量的luka多肽，其具有seqidnos:1-14任意一个所示的氨基酸序列，或者与seqidnos:1-14任意一个所示的序列具有至少70％序列相似性的序列(“luka”)；b)治疗有效量的lukb多肽，其具有seqidnos:15-27任意一个所示的氨基酸序列，或者与seqidnos:15-27任意一个所示的序列具有至少70％序列相似性的序列(“lukb”)；c)治疗有效量的抗-luka抗体，其与luka特异性结合；以及d)治疗有效量的特异性结合lukb的抗体。

工作实施例

参考如下的非限制性实施例对发明进行描述。除非另有特别说明，所有部分均按重量计。

实施例1：自然条件下重组luka和lukb的表达和纯化：pmal表达系统

使用taq聚合酶从金黄色葡萄球菌dna中扩增luka和lukb基因，使用标准的pcr设置，退火温度为55℃，使用的引物如下：luka引物5’-ccc-gtcgac-tta-tccttctttataaggtttattgtc-3’(seqidno:30)和5'-ccc-gaaggatttcacatcatcatcatcatcacaattcagctcataaagactctc-3’(seqidno:31)，lukb引物5’-ccccgaaggatttcacatcatcatcatcatcacaagattaattctgaaatcaaacaag-3’(seqidno:32)和5’-ccc-gtcgac-tta-tttcttttcattatcattaagtactt-3’(seqidno:33)。luka和lukb基因产物使用nde1和sall(newenglandbiolabs)消化并连接到pmal-c4x载体上(newenglandbiolabs)。构建物转化到e.coli菌株dh5α中，质粒插入情况通过测序进行确认。转化株在terrificbroth培养基中于37℃培养直至培养物的a600为～0.5，terrificbroth培养基中含100ug/ml氨苄西林和t0.2％的葡萄糖。6-his-标记的mbp-luka或6-his-标记的mbp-lukb的表达使用0.3mm的异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷于16℃过夜180rpm转速下进行诱导表达。

诱导后，通过4000rpm4℃离心20分钟收集细胞，将其悬浮于冰冷的上柱缓冲液(columnbuffer)(20mmtris-hcl，200mmnacl和1mmedta)中，其中补充了不含edta的蛋白酶抑制剂(roche)。细菌细胞在冰上超声1分钟(脉冲10秒钟)。样品于10,000rpm4℃离心30分钟，收集上清后上直链淀粉树脂柱。用上柱缓冲液将柱洗两次，纯化后的6-his-标记的mbp-luka或6-his-标记的mbp-lukb用10等份补充了10mm麦芽糖的上柱缓冲液进行洗脱。

实施例2：重组活性luka、lukaδ10c、δ33nluka和lukb毒素的表达和纯化：pet14b表达系统

使用vent聚合酶(newenglandbiolabs)从金黄色葡萄球菌dna中扩增luka、lukaδ10c、δ33nluka和lukb基因，使用标准的pcr设置，退火温度为55℃，使用的引物如下：luka引物为5'-cccc-ctcgag-aattcagctcataaagactctcaag-3’(seqidno:34)和5'-cccc-ggatcc-tta-tccttctttataaggtttattgtc-3’(seqidno:35)；lukaδ10c引物为5'-cccc-ctcgag-aattcagctcataaagactctcaag(seqidno:34)和5'-cccc-ggatcc-tta-atatttatcaacgactttaactg(seqidno:36)；δ33nluka引物为5'-cccc-ctcgag-tcaacagcaccggatgatattg(seqidno:37)和5'-cccc-ggatcc-tta-tccttctttataaggtttattgtc(seqidno:35)。lukb引物为5'-cccc-ctcgag-aagattaattctgaaatcaaacaag-3’(seqidno:38)和5'-cccc-ggatcc-tta-tttcttttcattatcattaagtacttt-3’(seqidno:39)。基因产物使用xho1和bamh1(newenglandbiolabs)消化并连接到pet14b载体(novagen)上，将组氨酸标记的编码序列融合到基因的5端。表达质粒转化到e.coli菌株dh5α中，质粒插入情况通过测序进行确认。质粒纯化后，转化到e.coli表达菌株t7lysy/lq(newenglandbiolabs)中。

为了在变性条件下进行纯化，转化株在terrificbroth培养基(含100μg/ml氨苄西林)中于37℃生长，直至培养物的a600为～0.5。6-his-标记的luka或6-hislukb的表达使用0.4mmiptg在37℃、180rpm振摇条件下诱导3小时。诱导后，4000rpm4℃离心15分钟收集菌体，然后悬浮于1xtbs(50mmtris，150mmnacl，ph7.5)中。细菌细胞在冰上超声2分钟(脉冲10秒钟)。超声后的细菌于50,000rpm超速离心30分钟。沉淀重悬于裂解缓冲液(100mmnah2po4，10mmtris，8m尿素，ph8.0)中，并在旋转混匀仪(rotisserie)中室温孵育30分钟。样品于13,000rpm离心30分钟，上清上ni-nta离子柱(qiagen)。柱子用冲洗缓冲液(100mmnah2po4、10mmtris、8m尿素、ph6.3)冲洗两次，使用ph5.9和ph4.5的洗脱缓冲液(100mmnah2po4、10mmtris、8m尿素)将蛋白从柱上洗脱下来。收集含有纯化蛋白的部分，纯化蛋白通过sdspage测定，将其合并，在tris缓冲液(tbs；500mmtris、1.5mnacl、ph7.5)中1:1稀释，tbs中4℃透析过夜除去尿素，并使其重新折叠。纯化的6-his-标记的luka和lukb使用thermoscientificpiercebca蛋白检测试剂盒进行定量。

为了在自然条件下进行纯化，转化株在luria-bertani肉汤培养基(含100μg/ml氨苄西林)中于37℃生长，直至培养物的a600为～0.5。6-his-标记的luka、6-his-标记的lukaδ10c、6-his-标记的δ33nluka或6-hislukb使用0.05-0.1mmiptg在25-30℃、220rpm振摇条件下诱导3小时。诱导后，4000rpm4℃离心15分钟收集菌体，然后用1xtbs(50mmtris、600mmnacl、ph7.5)重悬，其中含10mm异吡唑和halt不含edta的蛋白酶抑制剂混合物(thermoscientific)。细菌细胞在冰上进行超声。超声后的细菌于20,000rpm超速离心20分钟。上清与ni-nta树脂(qiagen)在旋转混匀仪(rotisserie)中4℃孵育1小时。样品上柱，并使用含25mm的异吡唑的冲洗缓冲液1xtbs(50mmtris、600mmnacl、ph7.5)进行冲洗。使用50-500mm异吡唑的洗脱缓冲液1xtbs(50mmtris、600mmnacl、ph7.5)将蛋白从柱上洗脱下来。收集含有纯化蛋白的部分，纯化蛋白通过sdspage测定，将其合并，用1xtbs(50mmtris、150mmnacl、ph7.5)1:1进行稀释，tbs中4℃透析过夜除去尿素。纯化的6-his-标记的luka和lukb使用thermoscientificpiercebca蛋白检测试剂盒进行定量。

实施例3：变性重组蛋白luka和lukb的表达和纯化

使用vent聚合酶(newenglandbiolabs)从金黄色葡萄球菌dna中扩增luka和lukb基因，使用标准的pcr设置，退火温度为55℃，使用的引物如下：luka引物为5’-ggg-catatg-aattcagctcataaagactctcaa-3’(seqidno:40)和5’-ccc-gtcgac-tccttctttataaggtttattgtc-3’(seqidno:41)，lukb引物为5’-ggg-catatg-aagattaattctgaaatcaaacaag-3’(seqidno:42)和5’-ccc-gtcgac-tttcttttcattatcattaagtactt-3’(seqidno:43)。luka和lukb基因产物使用nde1和sall(newenglandbiolabs)消化并连接到pet41b载体(novagen)上。构建物先被转化到dh5α细胞中，然后转化到e.coli表达菌株er2566(newenglandbiolabs)中。转化体在terrificbroth培养基(含有25ug/ml卡那霉素)中于37℃培养2.5小时，luka和lukb使用0.3mm的iptg在37℃、180rpm振摇条件下诱导表达2小时。沉淀细胞并重悬于1xtbs(500mmtris、1.5mnacl、ph7.5)，并在冰上超声处理1分钟(10秒脉冲)。超声后的细菌用50,000rpm超速离心30分钟。

为了在变性条件下纯化c端6-his-标记luka和lukb，沉淀重悬于裂解液(100mmnah2po4、10mmtris、8m尿素、ph8.0)中，并在旋转混匀仪(rotisserie)中室温孵育30分钟。样品13,000rpm离心30分钟，上清液上ni-nta柱。柱子用冲洗缓冲液(100mmnah2po2、10mmtris、8m尿素、ph6.3)冲洗两次，使用ph5.9和ph4.5的洗脱缓冲液(100mmnah2po4、10mmtris、8m尿素)将luka和lukb从柱上洗脱下来。纯化的6-his-标记的luka和lukb使用bioraddc蛋白检测试剂盒进行定量。

实施例4：抗luka和抗lukb多克隆抗体的生产

在弗氏完全佐剂(fca)中乳化的变性重组luka(250μg)注射到新西兰白兔体内。在第21天和第49天用在弗氏完全佐剂(fca)中乳化的重组luka(125μg)对动物进行加强免疫。

在弗氏完全佐剂(fca)中乳化的变性重组lukb(250μg)注射到新西兰白兔体内。在第21天和第49天用在弗氏完全佐剂(fca)中乳化的重组lukb(125μg)对动物进行加强免疫。

实施例5：通过破坏细胞膜结构的细胞毒素介导人类吞噬细胞杀伤主要由杀白细胞素a/b引起

所使用的细胞系

作为一个研究lukab如何靶向和杀伤人类吞噬细胞的模型，试验使用了hl-60细胞(atccccl-240，人类早幼粒细胞细胞系)。hl-60细胞生长rpmi培养基(gibco)和37℃、5％co2的条件下，培养基中补充了10％热灭活胎牛血清(fbs)。为了分化hl-60细胞为中性粒细胞样细胞(pmn-hl60)，培养基中补充1.5％(v/v)的二甲亚砜(dmso)并生长4天。

使用的方法/试验

细胞毒性实验

为了评价金黄色葡萄球菌杀白细胞素ab(lukab)攻毒哺乳动物细胞后的细胞存活情况，将pmn-hl60细胞在终体积为100ul的rpmi(gibco)(补充了10％热灭活胎牛血清(fbs))中以1×10⁵个细胞/孔的细胞密度铺于96-孔平底组织培养平板(康宁)上。细胞在37℃、5％co2的条件下用20％到0.16％v/v范围的金黄色葡萄球菌newman培养物滤液的2倍系列梯度稀释液攻毒2小时，各浓度重复三份。实验使用来自野生株的胞外蛋白和来自lukab缺陷株(突变株)的胞外蛋白。100％存活的对照中包括20％v/v的组织培养基(rpmi+10％热灭活的胎牛血清)，以及20％v/v金黄色葡萄球菌生长培养基(rpmi+酪蛋白氨基酸)。使用0.1％v/vtritonx100作为100％细胞死亡的对照组。攻毒后，每个孔中加入10μl的celltiter(promega)并在37℃、5％co2中继续孵育3小时。celltiter可监测有代谢活跃的细胞(颜色变化)，死亡的细胞中没有该特点。使用perkinelmerenvision2103multilabelreader测定492nm处的比色反应。百分存活细胞使用如下公式进行计算：％存活率＝100x(ab492样品-ab492tritonx)/(ab492组织培养基)。

膜破损实验

测定lukab介导细胞毒性的一个替代性实验是评价宿主细胞膜的完整性。为此，使用sytox绿(invitrogen)渗透性实验。sytox绿对健康细胞不具有渗透能力，可是一旦细胞膜完整性受到破坏该染料就具有了渗透能力。在细胞内，sytox绿可结合到dna上，并发出很强的荧光。

为了评价用lukab攻毒后或体外感染金黄色葡萄球菌后的宿主细胞的完整性，将pmn-hl60细胞在终体积为100ul的rpmi(gibco)(补充10％热灭活胎牛血清(fbs))中以1x10⁵细胞/孔的密度铺于96-孔平底组织培养平板(康宁)上。细胞既可以用20％到0.16％v/v范围的金黄色葡萄球菌株newman培养物滤液的稀释液进行攻毒，也可以使用1-100范围的感染复数(moi)感染，试验在5％co2，37℃条件下进行2小时，每个样品制备三复孔。实验使用野生株和lukab缺陷株(突变株)。背景荧光对照中包括20％v/v的组织培养基(rpmi+10％热灭活的胎牛血清)，以及20％v/v金黄色葡萄球菌生长培养基(rpmi+酪蛋白氨基酸)。攻毒或感染后，细胞被转移到96孔v底平板(康宁)中，并1500rpm离心5分钟。去除上清，沉淀用100ul的pbs+sytox绿(0.1μm；invitrogen)重悬。随后细胞被转移到96孔净底黑色组织培养物处理板(康宁)上，避光室温孵育10分钟。用perkinelmerenvision2103multilabelreader(激发波长485nm，发射波长535nm)测定荧光。

结果

lukab靶向和杀伤人类主要吞噬细胞

用金黄色葡萄球菌株newman过滤的培养物上清攻毒人类主要外周血单核细胞(pbmc)(图3a)、单核细胞、吞噬细胞、树突状细胞(图3b)和多形核粒细胞(pmn)(图3c)，这导致了显著的细胞死亡，正如细胞毒性试验(图3a-c)所测结果。使用缺失溶血素(hla)、γ-溶血素(hlg)、杀白细胞素e/d(luked)或杀白细胞素a/b(lukab)的金黄色葡萄球菌newman的过滤培养物上清对这些细胞攻毒，结果表明hla-、hlg-、和luked-阴性菌株的胞外蛋白同newman野生型(wt)菌株一样都有细胞毒性(如细胞毒性试验所测结果)，提示newman产生的前述白细胞毒素都不会导致细胞介导的这些细胞的杀伤(图3a-c)。相对的，当细胞用newmanlukab缺陷型(δlukab)菌株的胞外蛋白攻毒时，很少观察到细胞死亡。newmanlukab缺陷型菌株缺失的细胞毒性可以通过质粒上的反式lukab回补(δlukab/plukab)(图3c)。重要的是，使用纯化重组蛋白luka和lukb攻毒pmn的测定结果说明，该表型完全依赖lukab。单独的亚单位对pmn没有表现出可检查到的细胞毒性(图3d)。相反，两个亚单位的组合会导致对这些细胞产生显著的、剂量依赖性的细胞毒性(图3d)。总之，这些结果表明金黄色葡萄球菌靶向和杀伤人类主要吞噬细胞、保护宿主免受感染剂影响所需的关键性免疫细胞是由lukab引起。lukab优先杀死人类吞噬细胞

用金黄色葡萄球菌newman菌株的过滤的培养物上清攻毒中性粒细胞样细胞系(pmn-hl60)和吞噬细胞样细胞系(thp1+pma)，可以导致显著的细胞死亡，如细胞毒性试验所示(图3)。使用金黄色葡萄球菌wt和同型细胞毒素突变株(hla、hlgabc、luked、和lukab)的过滤的培养上清对这些细胞的攻毒表明，lukab是金黄色葡萄球菌能够杀死这些细胞的原因，如细胞毒性试验所测结果(图4a和4b)。newmanlukab缺陷型菌株缺失的细胞毒性可以通过向newmanlukab缺陷菌株转化表达lukab的质粒(δlukab/plukab)而恢复(图4c)。这一菌株的胞外蛋白对pmn-hl60细胞和thp-1+pma细胞具有极强的毒性，这也是lukab是能靶向和杀伤人类细胞的强力的葡萄球菌毒素的强有力的证据。

为了进一步排除金黄色葡萄球菌培养上清中其他因子的作用，使用纯化的重组luka和lukb对pmn-hl60细胞进行攻毒。单独的亚单位对pmn-hl60没有表现出可检查到的细胞毒性(图3d)。相反，两个亚单位的组合会导致对这些细胞产生显著的、剂量依赖性的细胞毒性(图3d)。除了pmn-hl60和thp-1+pma细胞，其他多种人类细胞系，包括分化出pmn-hl60的髓样前体细胞(hl60)、分化出thp-1+pma的单核细胞祖细胞(thp-1)、淋巴细胞(hut和jurkat细胞)以及上皮细胞(293t和hepg2)也用重组lukab进行攻毒(图4e)。这些结果表明lukab优先靶向和杀死人类吞噬细胞，且对人类淋巴细胞或上皮细胞没有影响。总结起来，这些结果表明lukab在金黄色葡萄球菌介导的吞噬细胞杀伤作用中扮演着重要角色。

lukab由临床相关的金黄色葡萄球菌产生

lukb多克隆抗体的免疫印迹分析表明，一系列的葡萄球菌都可产生lukb，包括医院-和社区获得性感染相关的mrsa菌株(usa300、400、和500；图5a)。重要的是，lukb水平和这些菌株的毒性表型有关(图5a和5b)。产生lukb水平比较高的菌株(例如，newman、4645、usa500、和usa300)比产生lukb水平较低或检查不到的菌株(例如，usa100和usa400)，对pmn-hl60具有更高的细胞毒性(图5b)。为了研究lukab在mrsa菌株中的作用，在临床分离的usa型300la克隆中构建了lukab同型突变株(图5c)。与菌株newman相同，缺失lukab的菌株usa300的胞外蛋白比其亲代菌株细胞毒性明显更低(图5d)。这些数据表明lukab是mrsa菌株产生的重要细胞毒素。

lukab破坏人类吞噬细胞细胞膜

用金黄色葡萄球菌的胞外蛋白攻毒pmn-hl60，会导致细胞变圆和核肿胀，其为lukab依赖的表型(图6a)。如细胞膜破损实验测定结果所示(图6b和6c)，这一细胞变圆和肿胀表型同细胞膜渗透性增加是有关的。重要的是，lukab阴性菌株的胞外蛋白对细胞膜渗透性的影响很小甚至无影响，这一表型可以通过产生lukab的质粒进行回补(图6b)，而且导致剂量依赖型的细胞膜损伤的是重组的lukab而不是单个的毒性亚单位(图6c)。另外，受甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(mssa)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)usa300菌株感染原代人类pmn，都能导致lukab依赖的细胞膜损伤(图6d)。这一结果表明体外感染中，lukab会损伤宿主细胞膜。

通过靶向至和杀伤吞噬细胞，lukab保护金黄色葡萄球菌免受宿主杀伤作用。

金黄色葡萄球菌wt、δlukab和具有lukab表达质粒的δlukab(δlukab/plukab)对pmn-hl60细胞的感染表明，在葡萄球菌-吞噬细胞相互作用过程中，lukab对于金黄色葡萄球菌扰乱吞噬细胞细胞膜的能力是必需的(图7a)，正如膜破损实验结果所示。重要的是，金黄色葡萄球菌过度表达lukab(δlukab/plukab)可以表现出比wt菌株更强的膜损伤能力(图7a)，这表明lukab可以强效破坏宿主细胞膜。人全血(图7b)和纯化的原代人中性粒细胞(pmn；图7c)的感染表明，lukab阴性葡萄球菌比wt菌株更容易被杀灭(图7b和7c)。重要的是，δlukab-阴性葡萄球菌减弱的表型可以用lukab表达质粒得到回补(图7b和7c)。用金黄色葡萄球菌wt、δlukab、和包含lukab表达质粒的δlukab突变株的培养物滤液对原代人pmn细胞的攻毒表明，lukab靶向和杀死原代人pmn细胞(图7d)。这些数据强力表明lukab是强效的葡萄球菌细胞毒素，其通过膜扰乱靶向至和杀死pmn，因此保护了金黄色葡萄球菌免受pmn介导的杀伤。

lukab参与金黄色葡萄球菌体内的发病

小鼠眼球后感染金黄色葡萄球菌，该菌包含融合了lukab启动子的荧光素酶报告构建子(plukab-xen1)，在肾脏脓肿中表现出lukab启动子活性，其中无启动子的报告基因(pxen1)没有表现出活性(图8a)。这些数据表明，lukab的体内表达主要在肾脏脓肿感染模型中。另外，小鼠眼球后感染金黄色葡萄球菌wt的显示出广泛的肾脏定植，而缺失lukab的金黄色葡萄球菌则没有。在lukab阴性菌株中观察到的定植缺陷通过给予反式lukab可以恢复到wt的水平(图8b)。这些数据一起表明，lukab是重要的葡萄球菌细胞毒素，其有助于细菌的发病机理。

聚乙二醇可以阻止lukab在靶细胞膜上形成孔洞

用重组lukab(rlukab)对pmn-hl60的攻毒表明，rluka和rlukb都能结合到靶细胞上，其通过luka和lukb特异性抗体的免疫印迹进行测定(图9a)。6his-标记rlukab对pmn-hl60细胞的结合也使用荧光激活的细胞分选(facs)和组氨酸特异性抗体而得到确认(图9b)。用重组蛋白攻毒后通过免疫印迹，在pmn-hl60细胞膜上也可被检测到rlukab寡聚物，这表明lukab在靶细胞膜表面形成了高度有序的结构(图9c)。更重要的是，用rlukab对pmn-hl60攻毒表明，lukab在靶细胞的细胞膜上形成了溴化乙锭可渗透的孔洞，其能被聚乙二醇(peg)阻止(图9d)，并且阻止lukab孔洞可提高细胞存活情况(图9e)。另外，peg可特异性地阻止lukab孔洞，因为皂素在pmn-hl60细胞膜上形成孔洞不受peg阻止，这样不能保护这些细胞免受孔洞介导的死亡。这些数据表明lukab孔洞可被小分子阻止，并且阻止lukab孔洞可以保护细胞免受lukab介导的杀伤。

α-luka多克隆抗体对金黄色葡萄球菌培养物滤液细胞毒性的中和作用

在对pmn-hl60攻毒前，将金黄色葡萄球菌培养物滤液与从两只兔子产生的不同数量的α-luka多克隆抗体预孵育，结果为培养物滤液毒性呈剂量依赖性降低(图10)。当使用免疫前血清预孵育培养物滤液时，没有发现这种中和作用。重要的是，两只兔子产生的抗体的结果相似，且抗体的中和能力随着抗体成熟而增加，通过比较前期取血和后期取血的抗体中和作用可以观察到这一现象(图10)。这些数据表明，金黄色葡萄球菌培养物滤液的细胞毒性可以被α-luka多克隆抗体所中和。

仍能被α-luka多克隆抗体识别的无毒性luka截断突变的鉴定

luka不同于其他的葡萄球菌白细胞毒性s亚单位，在于其在n-和c-端都有一个扩展部分。所述扩展部分在n端由33个氨基酸组成，c端由10个氨基酸组成(图11a)。用缺少n端扩展部分的纯化重组luka(rδ33nluka)和纯化的rlukb一起对pmn-hl60细胞攻毒，结果对细胞表现出强效的细胞毒性，近乎于纯化的rluka+rlukb的细胞毒性(图11b)。然而，使用纯化的缺少c端扩展部分的重组luka(rlukaδ10c)和rlukb一起对pmn-hl60攻毒，没有表现出细胞毒性作用(图11b)。这些数据表明，n端扩展部分对于luka的细胞毒性是非必要的，而c端扩展部分对于毒性是必不可少的。重要的是，中和lukab作用的α-luka多克隆抗体(图10)，仍能识别6xhis-标记的非细胞毒性rlukaδ10c突变体，和α-his多克隆抗体相同(图11c)。这些数据表明rlukaδ10c可被用来在体内产生多克隆抗体这样的中和抗体。因此，rlukaδ10c可被用作主动疫苗组分。

所有专利文献和非专利文献都在本领域技术人员的技术水平内。所有这些公开在本文中都被相同程度地参考，即每个单独的公开都被具体地或分别通过参考并入本文。

尽管本发明通过特定的实施方式进行说明，应当理解的是这些实施方式仅仅是本发明的原理和应用的一个示例性说明。因此应当理解的是，在不脱离本发明的权利要求书中所确定的精神和范围的情况下，可以对示例性实施方式进行多种修改，并可以设计出其他的排列方式。

序列表

<110>v·j·托雷斯

a·l·杜蒙特

<120>金黄色葡萄球菌杀白细胞素及其治疗组合物和用途

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<140>待定

<141>待定

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<220>

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<212>prt

<213>金黄色葡萄球菌

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(279)

<223>xaa可以是任意天然存在的氨基酸

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<213>金黄色葡萄球菌

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