本发明属于细胞免疫领域，涉及cik细胞，具体涉及硫酸软骨素用于扩增cik细胞、制备cik细胞扩增试剂和包被培养器皿的用途。
背景技术：
：硫酸软骨素(chondroitinsulfate,cs)广泛存在于各种动物组织中，尤其在软骨和结缔组织中含量丰富。由于不同生物或者相同生物的不同组织所含cs的种类和量均不同，使其结构与活性复杂多样。作为一类重要的生物大分子，cs具有广泛的生物活性，作为安全有效的保健食品和药品在世界各国得到了广泛应用。大量研究表明，cs具有降血脂、抗动脉粥样硬化和抗病毒性肝炎等活性，临床中已用于防治关节炎、肾炎、神经痛、偏头痛等。cs属于糖胺聚糖类(glycosaminoglycans，gags)物质，以蛋白聚糖的形式广泛分布于动物的软骨、皮肤、玻璃体及血管等组织中，在软骨组织中尤其丰富，是软骨的重要组成成分。cs是一类含有聚阴离子的线性多糖，由d-葡糖醛酸(glca)和n-乙酰半乳糖胺(galnac)构成的二糖单位以[4)-β-glca-(13)-β-galnac-(1]的序列重复连接组成骨架结构，并在后续的生物合成过程中在不同的位置引入硫酸基。不同来源及提取方法得到的cs其硫酸化的位点和程度、相对分子质量(mr)均存在差异，而这是影响cs生物活性的关键因素。生物治疗是继手术、化疗及放疗3种传统模式之后的第4大肿瘤治疗模式，前3种模式或毒副作用较大，或不能清除体内残存肿瘤细胞，大部分肿瘤患者终因复发或难治而导致死亡。细胞免疫治疗技术在肿瘤的生物治疗中占有重要地位,显示出良好的应用前景，并逐渐成为肿瘤治疗的重要手段之一。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkillercell，cik)是近年来发现的一种非常有前景的过继免疫细胞，具有增殖迅速、杀瘤活性广谱且高效、毒副作用微小等优点，已经成为肿瘤生物免疫治疗的主力军。cik细胞的主要效应细胞为cd3+cd56+表型t淋巴细胞，兼有nk细胞和t细胞的特征。在功能上，cik一方面拥有t淋巴细胞强大抗肿瘤活性，另一方面拥有nk细胞非mhc限制性的杀伤肿瘤的特点，其增殖迅速、对正常造血影响轻微。cik细胞的扩增活力和杀瘤活性直接关系到治疗成本和效果。目前尚未见硫酸软骨素在cik细胞培养扩增方面的应用。技术实现要素：本发明旨在提供硫酸软骨素用于扩增cik细胞、制备cik细胞扩增试剂和包被培养器皿的用途，以提高cik细胞的扩增活力和杀瘤活性，降低细胞治疗成本并提升治疗效果。本发明通过如下技术方案得以实现：一种高分子量硫酸软骨素，由动物胸软骨来源的硫酸软骨素经酸降解制备而得，所述高分子量指分子量范围为14.2-15.6kd。优选地，所述酸为苹果酸。优选地，所述酸降解的方法包括如下步骤：配制质量体积浓度为2-4％的硫酸软骨素溶液，加入苹果酸至浓度为0.1-0.3mol/l，于60-80℃搅拌降解8-12h，用足量的碱性物质终止反应，并调节ph至6.5，加入乙醇沉淀，分离干燥即得所述的高分子量硫酸软骨素。优选地，所述碱性物质为碳酸钙。优选地，所述动物胸软骨指鸡胸软骨。优选地，鸡胸软骨来源的硫酸软骨素的制备方法包括如下步骤：将鸡胸软骨用木瓜蛋白酶于50-60℃提取5.5-6.5h得到酶提液，经三氯乙酸去除蛋白质后抽滤离心，离心条件为4000-5000rpm离心8-12min，上清液浓缩后用乙醇沉淀，离心收集沉淀，离心条件为4000-5000rpm离心8-12min；沉淀透析脱盐后，再用阳离子交换树脂、葡聚糖凝胶柱层析纯化即得鸡胸软骨来源的硫酸软骨素。上述硫酸软骨素在cik细胞培养方面的应用。一种用于cik细胞培养的培养基，含有有效浓度的上述硫酸软骨素。优选地，上述培养基内还含有叶绿素。一种用于cik细胞培养的培养器皿，培养器皿内壁包被有有效厚度的包被层，包被层的材料为上述硫酸软骨素。优选地，上述培养器皿内部用氩气填充密封。本发明优点：本发明提供的高分子量硫酸软骨素可以显著提高cik细胞的扩增活力和杀瘤活性，可以用于制备cik细胞培养基和培养器皿。附图说明图1为高分子量硫酸软骨素与硫酸软骨素原料的红外光谱图对比。具体实施方式为了更好地解释本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步介绍。实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，属于本领域技术人员易于获得的范畴。实施例1：高分子量硫酸软骨素的制备和表征1、鸡胸软骨来源的硫酸软骨素的制备：将新鲜的鸡胸软骨去筋膜后，55℃烘干粉碎过40目筛得软骨粉，将软骨粉溶于质量体积百分含量为8％的木瓜蛋白酶溶液中(5g软骨粉对应1l溶液)，用木瓜蛋白酶于55℃提取6h得到酶提液，加入三氯乙酸至体积浓度为10％，反应1.5小时经三氯乙酸去除蛋白质后抽滤离心，离心条件为4000-5000rpm离心8-12min，上清液浓缩后用乙醇沉淀(95％乙醇体积为上清液体积的5倍)，离心收集沉淀，离心条件为4000-5000rpm离心8-12min。沉淀用去离子水复溶透析脱盐后，再用732#阳离子交换树脂、sephacryls-300hr葡聚糖凝胶柱层析纯化、冷冻干燥即得鸡胸软骨来源的硫酸软骨素(下文称硫酸软骨素原料)。2、高分子量硫酸软骨素的制备制备实例1：将上述硫酸软骨素原料用去离子水溶解配制成质量体积浓度为3％的硫酸软骨素溶液，加入苹果酸至浓度为0.2mol/l，于70℃搅拌降解10h，用足量的碳酸钙粉末终止反应，并调节ph至6.5，加入乙醇沉淀(95％乙醇体积为降解溶液体积的8倍)，离心后55℃烘干即得所述的高分子量硫酸软骨素。制备实例2：将上述硫酸软骨素原料用去离子水溶解配制成质量体积浓度为2％的硫酸软骨素溶液，加入苹果酸至浓度为0.1mol/l，于60℃搅拌降解12h，用足量的碳酸钙粉末终止反应，并调节ph至6.5，加入乙醇沉淀(95％乙醇体积为降解溶液体积的8倍)，离心后55℃烘干即得所述的高分子量硫酸软骨素。制备实例3：将上述硫酸软骨素原料用去离子水溶解配制成质量体积浓度为4％的硫酸软骨素溶液，加入苹果酸至浓度为0.3mol/l，于80℃搅拌降解8h，用足量的碳酸钙粉末终止反应，并调节ph至6.5，加入乙醇沉淀(95％乙醇体积为降解溶液体积的8倍)，离心后55℃烘干即得所述的高分子量硫酸软骨素。3、分析与测试硫酸软骨素分子量采用《中国药典》(2010版)中高效液相色谱法测定，结果如下表：红外吸收光谱测试：kbr压片，4000～400cm-1波数范围扫描。结果如图1所示，图1上面的红外图谱为硫酸软骨素原料的红外图谱，图1下为制备实例1制备的高分子量硫酸软骨素，制备实例2和3与制备实例1图谱基本一致。从红外图谱可以看出，上述酸水解方法非常温和，未造成硫酸软骨素化学基团的破坏，仅仅是使其断裂分子量减少。实施例2：高分子量硫酸软骨素对cik细胞扩增活力和杀瘤活性的影响一、实验材料10％胎牛血清和rpmi-1640培养液购于gibco公司，淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司(tbd)，il-2购自北京双鹭药业股份有限公司，抗人cd3单抗购自gibco公司，ifn-γ购自美国peprotec公司，il-1α购自美国peprotec公司，cck-8试剂购自上海碧云天生物技术有限公司。balb/c裸鼠，均选用雌性裸鼠，鼠龄6-7周，体重18-23g，在spf条件下的裸鼠室内饲养，由南京大学实验动物中心提供。胃癌mgc-803细胞购自上海歌凡生物细胞库。二、实验方法1、cik细胞的分离和培养(1)单个核细胞的分离：采集健康志愿者外周血，预冷的pbs1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，rpmi-1640培养基重悬细胞后置于37℃，5％co2孵箱中孵育2h。(2)cik细胞的培养：收集单核细胞中的悬浮细胞，调整细胞密度至2.5×106/ml，均分为三组进行培养，分组及培养方法如下：常规组：0天时，在完全培养基(rpmi-1640+10％fbs)中加入inf-γ(1000u/ml)，放入5％co2、37℃培养箱中孵育24h后，添加il-2(500u/ml)、il-1α(l00u/ml)和抗人cd3单抗(20μg/ml)。每2-3d进行换液，并补充等量的细胞因子，在培养过程中，添加新鲜培养基前用台盼蓝染色检测细胞的活率，统计细胞的绝对数目；连续培养12天，收集细胞；对比组：0天时，在完全培养基(rpmi-1640+10％fbs)中加入inf-γ(1000u/ml)和硫酸软骨素原料(20μg/ml)，放入5％co2、37℃培养箱中孵育24h后，按照常规组后续方法培养，统计细胞的绝对数目，收集细胞；诱导组：0天时，在完全培养基(rpmi-1640+10％fbs)中加入inf-γ(1000u/ml)和上述制备实例1制备的高分子量硫酸软骨素(20μg/ml)，放入5％co2、37℃培养箱中孵育24h后，按照常规组后续方法培养，统计细胞的绝对数目，收集细胞。2、cik细胞的体外肿瘤杀伤活性使用cck-8法检测体外各组cik细胞对胃癌mgc-803细胞的杀瘤活性，以对数生长期的mgc-803细胞作为靶细胞，待贴壁培养24h后，分别以培养12天的各组cik细胞作为效应细胞，分别置于37℃、5％co2、饱和湿度下的细胞培养箱中，待贴壁24h后，按效靶比为10:1加入效应细胞，设效应细胞对照与靶细胞对照，每组3个复孔，效应细胞与靶细胞共培养24h后，每孔按10％的体积加入cck-8溶液，置于培养箱中继续孵育培养4h后，酶联免疫捡测仪选择波长为450nm测定各孔光吸光值，并按照下式计算杀伤活性(杀伤率)：杀伤率＝[1-(实验组od值-效应细胞组od值)/靶细胞组od值]×l00％。3、cik细胞的体内肿瘤杀伤活性将balb/c裸鼠右腋皮下接种0.2ml1×106/mlmgc-803胃癌细胞后，再随机分成4组：对照组、常规组、对比组和诱导组，每组20只。10d后常规组、对比组和诱导组的每只裸鼠在接种肿瘤细胞部位处注射0.2ml1×107/ml的cik细胞(分别对应按照上述常规组、诱导a-d组诱导培养12天)，对照组裸鼠注射0.2ml生理盐水，连续注射5d。15d后每组剥离肿瘤块并称重，按照如下公式计算抑瘤率(％)：抑瘤率＝(对照组瘤质量-实验组瘤质量)/对照组瘤质量×100％4、统计学分析使用spss20.0统计学软件进行t检验，p<0.05认为差异显著。三、实验结果1、各组cik细胞的增殖与活率接种时各组都为2.5×106个细胞，培养至第12天时，常规组的细胞绝对数目为(425.52±42.26)×106个，增殖倍数约为170倍左右；对比组的细胞绝对数目为(456.26±31.34)×106个，增殖倍数约为183倍左右，与常规组相比无显著性差异(p＞0.05)；诱导组的细胞绝对数目分别为(764.86±50.08)×106个，增殖倍数约为306倍左右，与常规组和对比组相比具有显著性差异(p＜0.05)。每次补液前台盼蓝染色检测细胞活率，保证活率约95％。2、体外各组cik细胞对胃癌mgc-803细胞的杀瘤活性分别取培养至第12天时各组cik细胞对mgc-803细胞进行杀伤实验，在效靶比为10:1时，各组cik细胞均表现出明显的杀瘤活性，其中诱导组制备的cik细胞比常规组和对比组制备的cik细胞具有更强的杀瘤活性，且差异显著(p＜0.05)。各组cik细胞对mgc-803细胞的杀伤率如下表所示。常规组对比组诱导组体外杀伤率(％)35.94±3.1338.73±2.9463.55±3.873、体内各组cik细胞对胃癌移植瘤的杀瘤活性全部实验裸鼠在接种第7天时在接种部位均有肿瘤形成，直径为0.8-1cm。cik细胞干预15天后，常规组、对比组、诱导组所有裸鼠的肿块均有所缩小，而对照组所有裸鼠的肿块均增大。解剖时发现，与对照组相比，常规组、对比组、诱导组的肿瘤块较小且局限，而对照组的肿瘤块大且有肿瘤局部浸润现象。常规组、对比组、诱导组抑瘤率见下表。常规组对比组诱导组体内抑瘤率(％)45.12±5.6749.04±6.0371.38±5.96从上表可以看出，诱导组比常规组和对比组具有更优的体内抑瘤率，差异显著(p＜0.05)。制备实例2和3制备的高分子量硫酸软骨素与制备实例1具有基本一致的增殖活力和对肿瘤的体内外杀伤活性。实施例3：高分子量硫酸软骨素的应用(制备商品化培养基和包被培养瓶)培养基：在现有的rpmi-1640培养液中添加实施例1制备的高分子量硫酸软骨素，质量体积浓度为20μg/ml。在一个优选实施例中，同时在培养液中添加4-6μg/ml的叶绿素，可以显著提高上述高分子量硫酸软骨素在rpmi-1640培养液中的光照稳定性，且叶绿素的添加不影响cik细胞的培养和增殖活力、杀伤活性。若不添加叶绿素，4500±500lx强度的光照(温度25±5℃)连续光照30天，有超过60％的高分子量硫酸软骨素进一步降解至3kd以下；若添加5μg/ml的叶绿素，这一比率在5％以内。包被细胞培养瓶：采用常规的低温固化工艺在现有的细胞培养瓶(或其他可能用于cik细胞培养的容器，如培养皿)内表面包被0.2-0.3mm厚度的包被层，包被层材料即为上述高分子量硫酸软骨素。在一个优选实施例中，将包被有该包被层的细胞培养瓶中填充满氩气密封储存。若不填充满氩气，4500±500lx强度的光照(温度25±5℃)连续光照30天，包被层出现明显的裂隙，显微镜下表面出现皱缩凹孔；若用氩气保护则不会出现这种情况。该方法可以提高包被培养瓶的光照稳定性，延长保质期和货架期。上述实施例仅用于进一步解释本发明的技术方案，本领域技术人员应当明白，任何简单替换或修改均不脱离本发明，本发明的保护范围并不受限于上述具体实施例。当前第1页12