本发明涉及鱼类产品深加工技术领域，尤其是涉及海鳗活性多肽的制备方法。
背景技术：
海鳗又名为鳗鱼、虎鳗、牙鱼、狼牙鳝、门鳝、长鱼、即勾、勾鱼。体长一般约0.5~1.5米，大的可达2米。体细长，躯干部近圆筒状，尾部较侧扁，无鳞。口大，上下领延长，具强尖锐齿，鳃孔宽大。背、臀、尾鳍相连，胸鳍发达。海鳗为暖水性的底层鱼类，一般喜栖息于水深一米泥沙底海区，有季节性洞游。分布于印度洋和太平洋，在中国沿海均有分布，尤以浙、闽、粤沿海产量最多，目前我国的年产量大约为巧万吨左右。海水养殖鱼一般呈高蛋白、高水分、高脂肪的特点。海鳗的肉质细嫩，味道鲜美，脂肪含量高，蛋白含量高于牛肉、牛乳及禽蛋，营养丰富，具有补虚养血、祛湿、抗痊等功效，是久病、虚弱、贫血、肺结核等病人的良好营养品海鳗富含钙质，经常食用，能使血钙值有所增加，使身体强壮；且鳗鱼的维生素和微量元素含量极高，维生素b1、维生素b2、维生素a含量分别是牛奶的25倍、5倍和45倍，锌含量脑黄金是牛奶的9倍。
我国是世界上最大的海鳗养殖、加工和出口国家，海鳗产品己成为我国单项农产品出口创汇最多的商品，每年产值逾亿元，出口一万，创汇一亿美元，我国海鳗产品出口量占世界贸易量的。海鳗产业在我国渔业经济中占重要地位，己成为一些地方经济的支柱产业。海鳗消费市场主要集中在烤鳗、活鳗和冻鳗为主。日本是世界最大的鳗鱼消费国，年进口量万一万，占我国烤鳗生产总量的。目前，在各类海鳗加工产品中，干制品以及在此基础上深加工的熏制品由于具有独特风味而受到人们的青睐，如烤鳗片、鳗鳌等是世界很多地区人们非常喜爱的食品。但这类产品都是基础类产品，附加值不高。
现有技术如授权公告号为cn101869172b的中国发明专利，公开了一种活性鳗肽的生产方法，其生产方法为：选择宰杀好的鲜鳗鱼或鲜冻鳗鱼经绞肉机绞碎、灭菌后再进入初发酵车间进行降解水解，通过鱼骨刺分离将得到的水解清液经过灭酶，油脂分离，超滤，膜分离、真空浓缩，生香处理，喷雾干燥生产出活性鳗肽。采用生物酶解及酶修饰在温和的条件下进行降解水解，提取浓缩高活性鳗鱼蛋白多肽-鳗肽，但该制备方法繁琐，油脂分离不彻底，产品易产生油哈败味。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种溶解性好，可直接被小肠吸收，改善肠道内环境，促进食物中营养成分的消化吸收利用的海鳗活性多肽的制备方法。
本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：海鳗活性多肽的制备方法，包括预处理、酶法脱脂、发酵培养基制备、黑霉菌种子液制备、啤酒酵母种子液制备、发酵、纯化，具体步骤为：
所用菌种及其购买的公司为：黑霉菌和啤酒酵母均购自上海复祥生物科技有限公司。
预处理：将冷冻海鳗解冻后，清洗，去头、去尾及内脏，从背部切开分两半，去中间的骨头，然后切成质量在20~30g之间的鱼片，备用；
酶法脱脂：用ph为9~10的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制40~50u/ml的碱性脂肪酶液，将鱼片与酶液按重量比为1:3~4的比例在28~33℃下浸泡脱脂48~55min，取出海鳗片，用清水冲洗，沥干水分，备用，脂肪酶作用于油脂的脂键，使油脂水解成甘油和脂肪酸，甘油溶于水，脂肪酸与碱形成皂盐漂洗掉，酶法脱脂反应条件温和、控制方便，能专一性水解油脂的酯键、不破坏制品的其他营养成分，生物降解性好，使用量少，不会产生化学品残留或二次污染等环境问题；
发酵培养基制备：将脱脂鱼片蒸煮35~40min，冷却后与水按重量比为1:1~2的比例匀浆，调节ph至5~6，封口，灭菌，备用，该发酵培养基碳、氮丰富，为菌体的生长繁殖提供能源，能使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，使长好的菌体能迅速合成需产物；
黑霉菌种子液制备：将活化好的黑霉菌接种到查氏液体培养基中，在28~33℃培养45~48h，即得黑霉菌种子液；
啤酒酵母种子液制备：将活化好的啤酒酵母接种到ydp液体培养基中，在28~33℃培养35~38h，即得啤酒酵母种子液；
发酵：将种子液接种到发酵培养液中，黑霉菌种子液的接种量为4~6%，啤酒酵母种子液的接种量为3~5%，在35~42℃下培养26~28h，灭菌，离心，抽滤，留取滤液，浓缩，备用，该步骤采用混合菌种发酵，相较于单一菌种纯种发酵有很大的局限性，作用效果的差异性，混合菌种发酵可利用了不同菌株的生理生化反应，使分泌的酶系统更加复杂多样，使酶活大大提高，酶系比例协调，利用两种菌种之间的共生作用或营养作用，使水解与发酵能够同时进行；
纯化：将浓缩液用0.2~0.3μm的微孔滤膜过滤，然后用截留分子量为3~5kda的超滤膜在0.6~0.8mpa压力下超滤分离，冷冻干燥，即得海鳗活性多肽，其氨基酸序列为hshacklcvcvncfaakcylcrvlhpgklcvcncsk，该活性多肽溶解性好，具有较强的吸湿性，即使在浓度较高时也有较好的流动性，不需要消化就可直接被小肠吸收，渗透压较低，在食用后不会引起腹痛、腹泻等不良反应，有利于肠道内益生菌的生长，帮助改善肠道内环境，促进食物中营养成分的消化吸收利用，可用于一般蛋白质制品的替代品，给拥有较弱的消化系统的病人或其它特殊人群提供营养。
作为优选，查氏培养基制备：按重量份取硝酸钠0.1~0.3份，磷酸氢二钾0.08~0.12份，氯化钾0.03~0.06份，硫酸亚铁0.001~0.002份，七水硫酸镁0.03~0.06份，蔗糖2~4份，琼脂1.5~2.3份，蒸馏水96~100份，混合均匀，高压灭菌。
作为优选，ydp液体培养基制备：按重量份取葡萄糖1.8~2.3份，酵母膏0.4~0.6份，蛋白胨0.8~1.2份，琼脂1.7~2.2份，蒸馏水96~100份，混合均匀，调节ph为5.5~6.0，高压灭菌。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明活性多肽溶解性好，具有较好的流动性，可直接被小肠吸收，渗透压较低，在食用后不会引起腹痛、腹泻等不良反应，帮助改善肠道内环境，促进食物中营养成分的消化吸收利用；2）采用混合菌种发酵法制备海鳗活性多肽，可利用了不同菌株的生理生化反应，使分泌的酶系统更加复杂多样，使酶系比例协调，水解与发酵能够同时进行；3）制备方法简单可行，易于扩大生产，能提高海鳗的附加值，具有较大的经济效益和社会效益。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
海鳗活性多肽的制备方法，包括预处理、酶法脱脂、发酵培养基制备、黑霉菌种子液制备、啤酒酵母种子液制备、发酵、纯化，具体步骤为：
1）预处理：将冷冻海鳗解冻后，清洗，去头、去尾及内脏，从背部切开分两半，去中间的骨头，然后切成鱼片的长和宽约为5cm和3cm，厚度约为1cm，质量在20~30g之间的鱼片，备用；
2）酶法脱脂：用ph为9的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制42u/ml的碱性脂肪酶液，将鱼片与酶液按重量比为1:3.5的比例在30℃下浸泡脱脂50min，取出海鳗片，用清水冲洗，沥干水分，备用，脂肪酶作用于油脂的脂键，使油脂水解成甘油和脂肪酸，甘油溶于水，脂肪酸与碱形成皂盐漂洗掉，酶法脱脂反应条件温和、控制方便，能专一性水解油脂的酯键、不破坏制品的其他营养成分，生物降解性好，使用量少，不会产生化学品残留或二次污染等环境问题；
3）发酵培养基制备：将脱脂鱼片蒸煮38min，冷却后与水按重量比为1:1.5的比例用组织捣碎机捣致匀浆，调节ph至6，封口，灭菌，备用，该发酵培养基碳、氮丰富，为菌体的生长繁殖提供能源，能使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，使长好的菌体能迅速合成需产物；
4）黑霉菌种子液制备：将活化好的黑霉菌接种到查氏液体培养基中，在32℃培养46h，即得黑霉菌种子液；
5）啤酒酵母种子液制备：将活化好的啤酒酵母接种到ydp液体培养基中，在32℃培养36h，即得啤酒酵母种子液；
6）发酵：将种子液接种到发酵培养液中，黑霉菌种子液的接种量为5%，啤酒酵母种子液的接种量为3%，在38℃、190r/min下摇床培养26h，灭菌，离心，抽滤，留取滤液，浓缩，备用，该步骤采用混合菌种发酵，相较于单一菌种纯种发酵有很大的局限性，作用效果的差异性，混合菌种发酵可利用了不同菌株的生理生化反应，使分泌的酶系统更加复杂多样，使酶活大大提高，酶系比例协调，利用两种菌种之间的共生作用或营养作用，使水解与发酵能够同时进行；
7）纯化：将浓缩液用0.25μm的微孔滤膜过滤，然后用截留分子量为4kda的超滤膜在0.6mpa压力下超滤分离，冷冻干燥，即得海鳗活性多肽，其氨基酸序列为hshacklcvcvncfaakcylcrvlhpgklcvcncsk，该活性多肽溶解性好，具有较强的吸湿性，即使在浓度较高时也有较好的流动性，不需要消化就可直接被小肠吸收，渗透压较低，在食用后不会引起腹痛、腹泻等不良反应，有利于肠道内益生菌的生长，帮助改善肠道内环境，促进食物中营养成分的消化吸收利用，可用于一般蛋白质制品的替代品，给拥有较弱的消化系统的病人或其它特殊人群提供营养。
上述查氏培养基制备：按重量份取硝酸钠0.15份，磷酸氢二钾0.09份，氯化钾0.05份，硫酸亚铁0.0015份，七水硫酸镁0.04份，蔗糖3.2份，琼脂1.9份，蒸馏水98份，混合均匀，高压灭菌。
上述ydp液体培养基制备：按重量份取葡萄糖1.9份，酵母膏0.48份，蛋白胨0.96份，琼脂1.9份，蒸馏水98份，混合均匀，调节ph为5.8，高压灭菌。
实施例2：
海鳗活性多肽的制备方法，包括预处理、酶法脱脂、发酵培养基制备、黑霉菌种子液制备、啤酒酵母种子液制备、发酵、纯化，具体步骤为：
1）预处理：将冷冻海鳗解冻后，清洗，去头、去尾及内脏，从背部切开分两半，去中间的骨头，然后切成质量在20~30g之间的鱼片，备用；
2）酶法脱脂：用ph为9.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制43u/ml的碱性脂肪酶液，将鱼片与酶液按重量比为1:3.5的比例在30℃下浸泡脱脂50min，取出海鳗片，用清水冲洗，沥干水分，备用，脂肪酶作用于油脂的脂键，使油脂水解成甘油和脂肪酸，甘油溶于水，脂肪酸与碱形成皂盐漂洗掉，酶法脱脂反应条件温和、控制方便，能专一性水解油脂的酯键、不破坏制品的其他营养成分，生物降解性好，使用量少，不会产生化学品残留或二次污染等环境问题；
3）发酵培养基制备：将脱脂鱼片蒸煮38min，冷却后与水按重量比为1:1.8的比例用组织捣碎机捣致匀浆，调节ph至5.5，封口，灭菌，备用，该发酵培养基碳、氮丰富，为菌体的生长繁殖提供能源，能使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，使长好的菌体能迅速合成需产物；
4）黑霉菌种子液制备：将活化好的黑霉菌接种到查氏液体培养基中，在30℃培养45h，即得黑霉菌种子液；
5）啤酒酵母种子液制备：将活化好的啤酒酵母接种到ydp液体培养基中，在30℃培养37h，即得啤酒酵母种子液；
6）发酵：将种子液接种到发酵培养液中，黑霉菌种子液的接种量为6%，啤酒酵母种子液的接种量为4%，在40℃下培养27h，灭菌，离心，抽滤，留取滤液，浓缩，备用，该步骤采用混合菌种发酵，相较于单一菌种纯种发酵有很大的局限性，作用效果的差异性，混合菌种发酵可利用了不同菌株的生理生化反应，使分泌的酶系统更加复杂多样，使酶活大大提高，酶系比例协调，利用两种菌种之间的共生作用或营养作用，使水解与发酵能够同时进行；
7）纯化：将浓缩液用0.3μm的微孔滤膜过滤，然后用截留分子量为5kda的超滤膜超滤分离，冷冻干燥，即得海鳗活性多肽，其氨基酸序列为hshacklcvcvncfaakcylcrvlhpgklcvcncsk，该活性多肽溶解性好，具有较强的吸湿性，即使在浓度较高时也有较好的流动性，不需要消化就可直接被小肠吸收，渗透压较低，在食用后不会引起腹痛、腹泻等不良反应，有利于肠道内益生菌的生长，帮助改善肠道内环境，促进食物中营养成分的消化吸收利用，可用于一般蛋白质制品的替代品，给拥有较弱的消化系统的病人或其它特殊人群提供营养。
上述查氏培养基制备：按重量份取硝酸钠0.3份，磷酸氢二钾0.1份，氯化钾0.05份，硫酸亚铁0.002份，七水硫酸镁0.04份，蔗糖3份，琼脂2份，蒸馏水98份，混合均匀，高压灭菌。
上述ydp液体培养基制备：按重量份取葡萄糖2份，酵母膏0.5份，蛋白胨1份，琼脂2份，蒸馏水100份，混合均匀，调节ph为6，高压灭菌。
实施例3：
海鳗活性多肽的制备方法，具体步骤为：
将冷冻海鳗解冻后，清洗，切成鱼片，备用；
用ph为10的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制40~50u/ml的碱性脂肪酶液，将鱼片与酶液按重量比为1:3.3的比例在32℃下浸泡脱脂48~55min，取出海鳗片，用清水冲洗，沥干水分，备用；
发酵培养基制备：将脱脂鱼片蒸煮35min，冷却后与水按重量比为1:2的比例匀浆，调节ph至5.8，封口，灭菌，备用；
将活化好的黑霉菌接种到含有硝酸钠、磷酸氢二钾、氯化钾、硫酸亚铁、七水硫酸镁、蔗糖、琼脂、蒸馏水的查氏液体培养基中，在33℃培养48h，即得黑霉菌种子液；
将活化好的啤酒酵母接种到含有葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、琼脂、蒸馏水的ydp液体培养基中，在28℃培养38h，即得啤酒酵母种子液；
将接种量为4~6%的黑霉菌种子液、接种量为3~5%的啤酒酵母种子液接种到发酵培养液中，在36℃下培养27h，灭菌，离心，抽滤，留取滤液，浓缩，备用；
纯化：将浓缩液用微孔滤膜过滤，超滤，即得海鳗活性多肽。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>乐清瑞耀食品技术有限公司
<120>海鳗活性多肽的制备方法
<130>1
<160>1
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>36
<212>prt
<213>人工合成
<400>1
hisserhisalacyslysleucysvalcysvalasncysphealaala
151015
lyscystyrleucysargvalleuhisproglylysleucysvalcys
202530
asncysserlys
35