源于稻瘟病菌的致病性基因MoSNT2及其用途的制作方法

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本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一个源于稻瘟病菌的致病性基因mosnt2；还涉及该基因的用途。

背景技术：

稻瘟病(又名稻热病)是水稻重要病害之一，可引起大幅度减产，严重时减产40％～50％，甚至颗粒无收。稻瘟病在世界各稻区均有发生，其中以叶部、节部发生为多，尤其穗颈瘟或节瘟发生早而重，可造成白穗以致绝产。引起稻瘟病的病原体为稻瘟病菌，属于半活体寄生性真菌(magnaportheoryzae)，它具有生理小种多、繁殖变异快、流行性强等特点，对水稻生产威胁巨大。为了保障水稻生产安全，迫切需要寻找防治稻瘟病的有效途径。

稻瘟病菌对寄主水稻的侵染过程主要分为以下几个阶段：分生孢子粘附寄主、孢子萌发出芽管并分化产生侵染器官附着胞、附着胞产生侵染钉穿透植物表皮、侵染菌丝在植物组织中增殖并分泌效应蛋白抑制寄主免疫力、菌丝杀伤植物组织形成坏死斑、形成分生孢子梗并释放分生孢子(wilson等，naturereviewsmicrobiology，2009，7(3):185-195)。许多基因在稻瘟病侵染寄主水稻过程中发挥重要功能，调控稻瘟病菌侵染器官发育及侵染菌丝增殖，从而决定稻瘟病的致病力与侵染性。阐明这些致病性相关基因的分子功能，将有助于开发及利用新的稻瘟病防治靶点。

dean等(dean等，2005,434(7036)：980-986)完成了稻瘟病菌70-15菌株的基因组序列测定。韩国首尔大学构建了稻瘟病菌突变体库，并报道了202个致病性基因(jeon等，naturegenetics，2007(39)：561-565)。我国科研工作者对稻瘟病菌流行性菌株进行了基因组测序及解读，鉴定出许多与稻瘟病菌致病性相关的基因，这些基因所编码的转录因子、分泌性效应蛋白、胞泌调控因子等，在稻瘟病菌侵染寄主水稻过程中起着至关重要的作用(dong等，2015,plospathogens11(4):e1004801)。国内外学者已鉴定许多致病相关基因(yan等，currentopinioninmicrobiology，2016,34:147–153)。这些致病性基因所参与的代谢与信号通路主要包括：黑色素合成、脂肪酸β-氧化、海藻糖代谢、乙醛酸循环、细胞自噬、细胞分泌、camp/pka、g蛋白、mapk信号途径等。但是，针对这些代谢与信号途径，目前可利用的真菌特异防治靶点还十分有限。

目前，防治植物病原真菌的方法主要是化学防治。鉴定并解析植物病原真菌的致病性基因，尤其是与入侵寄主过程相关的功能基因，可以为设计、筛选抗真菌药物提供重要的靶标位点。传统的抗真菌药物的靶点主要包括细胞壁合成相关的重要酶类、细胞膜中甾醇与鞘磷脂等关键成分的合成酶类、真菌蛋白质与核酸的合成机器等(余新旭，2013，福建农林大学硕士学位论文；刘晓环，药物分析杂志，2015，35(2)：193-202)。三环唑广泛应用于防治稻瘟病菌，它可破坏侵染器官附着胞的穿透功能，其作用靶标是细胞壁黑色素合成相关的三羟萘还原酶。稻瘟病菌易变异、繁殖快和适应性强，长期使用单一抗真菌药物，易使病原菌累积抗药性，导致防效下降。因此，采用分子生物学技术，克隆及鉴定新的在稻瘟病菌侵染过程中发挥重要功能的致病基因，可为设计与筛选新型抗真菌药剂提供重要的药物靶点，这对稻瘟病的综合防治具有十分重要的理论意义和应用价值。

技术实现要素：

针对目前存在的稻瘟病危害严重，缺少有效防治方法的问题，本发明目的在于提供一种源于稻瘟病菌的致病性蛋白。

本发明另一目的在于提供编码上述致病性蛋白的基因。该基因对稻瘟病菌的菌丝营养生长、分生孢子产生和萌发、附着胞形成及致病性等都有重要作用。

本发明第三目的在于提供含有上述基因的表达载体。

本发明第四目的在于提供上述致病性蛋白的用途。

本发明第五目的在于提供上述基因的用途。

本发明第六目的在于提供上述表达载体的用途。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种源于稻瘟病菌的致病性蛋白，命名为mosnt2，所述蛋白的氨基酸序列如下：

(1)、具有seqidno:1所示的氨基酸序列；

(2)、将seqidno:1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的添加、替换或缺失所形成的、并具有稻瘟病致病性功能的氨基酸序列。

本发明还提供了编码上述致病性蛋白的基因，命名为mosnt2，该基因具有如下(a)、(b)或(c)的核苷酸序列：

(a)具有seqidno:2所示的核苷酸序列；

(b)在严谨条件下与seqidno:2所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(c)将seqidno:2所示的核苷酸序列经过一个或几个碱基的添加、缺失或替换所形成的、且编码具有稻瘟病致病性蛋白功能的核苷酸序列。

本发明还提供了含有上述基因的表达载体。

本发明还提供了上述致病性蛋白作为设计或/和筛选抗真菌药物靶标的应用。

本发明还提供了上述基因作为设计或/和筛选抗真菌药物靶标的应用。

上述应用中所述的真菌是指稻瘟病菌(magnaportheoryzae)等。

本发明还提供了上述表达载体在筛选抗真菌药物上的应用。

上述应用中所述的真菌是指稻瘟病菌(magnaportheoryzae)等。

本发明具有的优点和有益效果：本发明为防治稻瘟病菌提供了一个重要的靶标基因或靶标蛋白。本发明稻瘟病致病性蛋白对稻瘟病菌的菌丝营养生长、分生孢子产生和萌发、附着胞形成等各个生长发育阶段，以及致病性有重要影响，以该基因或蛋白作为靶标研制的药物，可破坏稻温病菌的基因表达或蛋白功能，可以有效地控制稻瘟病菌的致病性和流行性。

附图说明

图1.不同发育阶段mosnt2基因表达水平柱形图；其中1为液生营养菌丝；2为分生孢子梗；3为分生孢子；4为发育4小时的附着孢；5为发育8小时附着孢；6为发育12小时附着孢；7为发育16小时附着孢；8为发育20小时附着孢；9为发育24小时附着孢；10为生长于水稻叶鞘的侵染菌丝；11为侵染水稻叶片的侵染菌丝。

图2.mosnt2基因敲除突变体的构建过程示意图。

图3.以p1和p2为引物的mosnt2敲除突变体的pcr检测电泳图谱；其中1为dna分子量标准；2为△mosnt2.1；3为△mosnt2.2；4为△mosnt2.3；5为△mosnt2.4；6为△mosnt2.5；7为野生型guy11。

图4.以p3和p4为引物的mosnt2敲除突变体的pcr检测电泳图谱；其中1为dna分子量标准；2为△mosnt2.1；3为△mosnt2.2；4为△mosnt2.3；5为△mosnt2.4；6为△mosnt2.5；7为野生型guy11。

图5.验证mosnt2敲除突变体的southern杂交图谱；其中1为guy11；2为△mosnt2.1；3为△mosnt2.2；4为△mosnt2.3；5为△mosnt2.4；6为△mosnt2.5。

图6.mosnt2敲除突变体等在cm平板培养基上的菌落及气生菌丝形态照片；其中1为guy11；2为△mosnt2.1；3为△mosnt2.2；4为compl.。

图7.mosnt2敲除突变体等气生菌丝生长及产孢显微照片；其中1为guy11；2为△mosnt2.1；3为△mosnt2.2；4为compl.。

图8.mosnt2敲除突变体等产孢量柱形图；其中1为guy11；2为△mosnt2.1；3为△mosnt2.2；4为compl.。

图9.mosnt2敲除突变体等孢子形态显微照片；其中1为guy11；2为△mosnt2.1；3为△mosnt2.2；4为compl.。

图10.mosnt2敲除突变体等在细胞壁抑制剂cfw胁迫下的菌落形态照片；其中1为guy11；2为△mosnt2.1；3为△mosnt2.2；4为compl.。

图11.mosnt2敲除突变体等在h2o2氧化胁迫下的菌落形态照片；其中1为guy11；2为△mosnt2.1；3为△mosnt2.2；4为compl.。

图12.mosnt2敲除突变体等侵染器官附着孢的发育的显微照片；其中1为guy11；2为△mosnt2.1；3为△mosnt2.2；4为compl.。

图13.mosnt2敲除突变体等对寄主水稻叶片的致病力照片；其中1为guy11；2为△mosnt2.1；3为△mosnt2.2；4为compl.；5为接种无菌琼脂块的空白对照。

图14.mosnt2敲除突变体等对寄主水稻根部的致病力照片；其中1为guy11；2为△mosnt2.1；3为△mosnt2.2；4为compl.；5为接种无菌琼脂块的空白对照。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步解释和说明，但是对本发明的保护范围不构成任何限制。下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：mosnt2基因的分离和克隆

(1)snt2蛋白在酵母的氧化胁迫应答过程中发挥重要作用(baker等，molecularandcellularbiology，2013，(33)19:3735–3748)，但该蛋白在稻瘟病菌中的功能未知。酵母和稻瘟病菌的蛋白序列之间存在一定相似性，因此首先从酵母的基因组数据库(http://www.yeastgenome.org/)网站搜索获得酵母snt2蛋白序列，然后利用blastp在稻瘟病菌基因组数据库(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/magnaporthe_grisea/multihome.html)中进行同源序列搜索，从中获得一个稻瘟病菌预测蛋白mgg_04421，命名为mosnt2，该蛋白的氨基酸序列见seqidno：1。

(2)mosnt2基因的克隆：为克隆mosnt2的cdna序列，首先使用rneasyplantminikit试剂盒(qiagen公司)，从稻瘟病菌野生型菌株guy11中提取总rna，然后使用superscriptiiireversetranscriptase试剂盒(invitrogen公司)，将总rna逆转录生成第一链cdna，再以snt2-cdna-for和snt2-cdna-rev为引物，使用phusion高保真酶(thermofisher公司)从第一链cdna中克隆mosnt2基因编码序列，共5382bp，最后将其连接到克隆载体peasy-blunt(全式金公司)上进行测序分析，获得mosnt2基因的克隆；mosnt2基因序列见seqidno：2。

所述pcr的反应体系(50μl)：guy11菌株cdna0.5μl(50ng)，phusiondna聚合酶0.5μl(2u/μl)，5×phusionhfbuffer10μl，dntp(25mmol/l，each)1μl，上游引物(50μmol/l)0.5μl，下游引物(50μmol/l)0.5μl，ddh2o37μl。pcr反应程序为：98℃30s；98℃10s，60℃30s，72℃3.5min，35个循环；72℃10min，4℃保温。所述的引物snt2-cdna-for(上游引物)和snt2-cdna-rev(下游引物)为：

snt2-cdna-for：5’-atggctcaaaagggttcaggtg-3’(seqidno：3)；

snt2-cdna-rev：5’-agacagtagatttcgcaacgaag-3’(seqidno：4)。

实施例2：mosnt2基因在不同发育阶段表达水平的定量rt-pcr检测

(一)有关培养基和溶液的配制：

(1)cm液体培养基：其组成成分及其比例为：d-glucose10g，peptone2g，yeastextract1g，casaminoacids1g，20×nitratesalts^*50ml，vitaminsolution^#1ml，traceelements^&1ml，加ddh2o至1000ml，并用1mol/l的naoh溶液调节ph值至6.5。

(2)cm琼脂平板：其组成成分及其比例为：d-glucose10g，peptone2g，yeastextract1g，casaminoacids1g，20×nitratesalts^*50ml，vitaminsolution^#1ml，traceelements^&1ml，琼脂粉15g，加ddh2o至1000ml，并用1mol/l的naoh溶液调节ph值至6.5；121℃湿热灭菌20min。

(3)^*20×nitratesalts(1000ml)组成成分及其比例为：nano3120g，kcl10.4g，mgso4·7h2o10.4g，kh2po430.4g，加ddh2o至1000ml，121℃湿热灭菌20min。

(4)^#vitaminsolution(1000ml)组成成分及其比例为：biotin0.1g，pyridoxin0.1g，thiamine0.1g，riboflavin0.1g，paba(p-aminobenzoicacid)0.1g，nicotinicacid0.1g，加ddh2o至1000ml，过滤除菌，4℃黑暗储存。

(5)^&traceelements(100ml)组成成分及其比例为：znso4·7h2o2.2g，h3bo31.1g，mncl2·4h2o0.5g，feso4·7h2o0.5g，cocl2·6h2o0.17g，cuso4·5h2o0.16g，na2moo4·2h2o0.15g，加ddh2o至100ml，过滤除菌，4℃黑暗储存。

(二)试验方法：

以稻瘟病菌野生型菌株guy11为材料，收集cm液体培养基中营养菌丝、cm琼脂平板上产孢阶段的分生孢子梗和分生孢子、附着胞发育阶段不同时间点的菌体、以及定殖水稻叶鞘或叶片的侵染菌丝；使用rneasyplantminikit试剂盒(qiagen公司)从收集的菌体中分别提取总rna，然后用primescriptrtreagentkitwithgdnaeraser(takara公司)反转录产生cdna，再以rp1和rp2为引物，用sybrpremixextaq(takara公司)进行定量rt-pcr，并利用稻瘟病菌基因β-tublin的表达水平进行均一化校正。所述的引物rp1和rp2为：

rp1：5’-caggattatggagttcttg-3’(seqidno：5)；

rp2：5’-ctagtatcgttcaccttac-3’(seqidno：6)。

结果(见图1)mosnt2基因在产孢阶段分生孢子梗与分生孢子中的表达量最高；附着胞发育过程中，mosnt2基因表达量在孢子接种12小时后达到最高值，侵染菌丝与营养菌丝中的表达量比较接近。上述结果说明mosnt2基因在稻瘟病菌的各个生长发育阶段均有表达。

实施例3：稻瘟病菌mosnt2基因敲除突变体的构建

按照如下方法进行：

采用split-marker基因敲除方法(参考文献：kershaw等，pnatlacadsciusa，2009，106(37):15967-15972)构建基因mosnt2的敲除突变体(见图2)。基因mosnt2约2.5kbp的编码序列选为打靶位点，基因敲除过程中，同源重组事件将该打靶位点序列置换为潮霉素筛选标记基因hyg，从而形成基因敲除突变体。具体构建步骤如下：

(1)以稻瘟病菌野生型guy11基因组dna为模板，分别以snt2-lf-for和snt2-lf-rev、或snt2-rf-for/snt2-rf-rev为引物，用dna聚合酶kod-plus(康为世纪生物科技有限公司)进行pcr扩增,分别扩增得到mosnt2基因的左翼lf(seqidno：7)或右翼rf片段(seqidno：8)。其中pcr反应体系(50μl)为：guy11基因组dna0.5μl(100ng)，taq聚合酶0.5μl(5u/μl)，10×buffer(+mgcl2，25mmol/l)5μl，dntp(25mmol/l，each)0.5μl，上游引物(50μmol/l)0.5μl，下游引物(50μmol/l)0.5μl，ddh2o42.5μl。pcr反应程序为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min，4℃保温。所述的引物snt2-lf-for和snt2-lf-rev为：

snt2-lf-for：5’-aatccctgcgggctactt-3’(seqidno：9)；

snt2-lf-rev：5’-ccttcaatatcatcttctgtcgacctcacaaaggcaccgctg-3(seqidno：10)。

所述的引物snt2-rf-for和snt2-rf-rev为：

snt2-rf-for：5’-cccagcactcgtccgagggcaaaggaataggcatctccaagttcggctca-3’(seqidno：11)；

snt2-rf-rev：5’-acaaccgcaaccctggga-3’(seqidno：12)。

(2)分别以hyg-for和hy-split、或yg-split和hyg-rev为引物从质粒模板pcb1004中分别扩增潮霉素筛选标记基因hyg的片段hy(见seqidno：17)或片段yg(见seqidno：18)。所述的引物hyg-for和hy-split为：

hyg-for：5’-gtcgacagaagatgat-3’(seqidno：13)；

hy-split：5’-tacttcgagcggaggcatcc-3’(seqidno：14)。

所述的引物yg-split和hyg-rev为：

yg-split：5’-cgttgcaagacctgcctgaa-3’(seqidno：15)；

hyg-rev：5’-ctattcctttgccctcggacg-3’(seqidno：16)。

上述pcr的反应体系(50μl)为：pcb1004质粒模板0.5μl(10ng)，taq聚合酶0.5μl(5u/μl)，10×buffer(+mgcl2，25mmol/l)5μl，dntp(25mmol/l，each)0.5μl，上游引物(50μmol/l)0.5μl，下游引物(50μmol/l)0.5μl，ddh2o42.5μl。pcr的反应程序为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min30s，35个循环；72℃10min，4℃保温。

(3)利用琼脂糖凝胶电泳回收上面扩增得到的四个片段lf、rf、hy和yg；通过融合pcr，使用引物对snt2-lf-for和hy-split将片段lf和hy连接形成融合片段lf-hy(见seqidno：19)；同时使用引物对yg-split和snt2-rf-rev将片段yg和rf连接形成融合片段yg-rf(见seqidno：20)。

上述获得融合片段lf-hy或yg-rf的pcr的反应体系(50μl)为：上游片段1μl(约50ng)，下游片段1μl(约50ng)，taq聚合酶0.5μl(5u/μl)，10×buffer(+mgcl2，25mmol/l)5μl，dntp(25mmol/l，each)0.5μl，上游引物(50μmol/l)0.5μl，下游引物(50μmol/l)0.5μl，ddh2o41μl。pcr反应程序为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min30s，35个循环；72℃10min，4℃保温。

(4)mosnt2敲除突变体的获得：琼脂糖凝胶电泳回收dna片段lf-hy和yg-rf，同时参照tablot等(tablot等，theplantcell，1993，5：1575-1590)所述方法制备稻瘟病菌野生型菌株guy11的原生质体，将lf-hy和yg-rf片段共转至原生质体中，采用含潮霉素的cm琼脂平板筛选真菌转化子。结果获得mosnt2基因敲除的转化子(或称为mosnt2敲除突变体)。在基因置换过程(如图2所示)中，大部分外源dna插入到稻瘟病菌的基因组中，由于融合片段的lf和rf序列与基因组上mosnt2的位点序列存在同源性，因此会发生同源置换，获得mosnt2敲除突变体。

实施例4稻瘟病菌mosnt2基因敲除突变体的鉴定

按照如下方法进行：

(1)提取实施例3中所得转化子的基因组dna，分别以p1和p2、或p3和p4为引物进行pcr扩增，其中随机插入的片段不能产生扩增条带，只有在mosnt2基因位点发生了同源置换的转化子才能产生扩增条带。其中转化子检测的pcr反应体系(25μl)为：转化子基因组dna0.5μl(50ng)，taq聚合酶0.3μl(5u/μl)，10×buffer(+mgcl2，25mmol/l)2.5μl，dntp(25mmol/l，each)0.2μl，上游引物0.2μl，下游引物0.2μl，ddh2o21.1μl。pcr反应程序为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃2.5min，35个循环；72℃10min，4℃保温。其中所述的引物p1和p2为：

p1：5’-ggtaggagaaaggctgatgg-3’(seqidno：21)；

p2：5’-gcttctgcgggcgatttgtgta-3’(seqidno：22)。

所述的引物p3和p4为：

p3：5’-cagcgagagcctgacctattgc-3’(seqidno：23)；

p4：5’-cttcctgacgcttccgataa-3’(seqidno：24)。

结果以p1和p2为引物所得的扩增产物大小为2.8kbp(见图3)，以p3和p4为引物所得的扩增产物大小为2.2kbp(见图4)。5个转化子是经同源置换而产生的敲除突变体，分别命名为△mosnt2.1、△mosnt2.2、△mosnt2.3、△mosnt2.4和△mosnt2.5。

(2)southern杂交鉴定：提取野生型菌株guy11与5个敲除突变体的基因组dna，然后使用限制性内切酶sphi进行酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳之后进行转膜。southern杂交试验使用地高辛dna标记与检测试剂盒(roche公司)。杂交探针为lf片段，用于合成探针的pcr反应体系与前述操作方法相同。

结果(见图5)野生型guy11菌株在1.2kbp和4.1kbp处有杂交信号，而敲除突变体δmosnt2由于同源置换，使得编码框内的一个sphi酶切位点消失(如图2所示)，从而导致在4.1kbp和5.5kbp处有杂交信号，该southern鉴定结果证实△mosnt2.1、△mosnt2.2、△mosnt2.3、△mosnt2.4和△mosnt2.5均是正确的mosnt2敲除突变体。

实施例5mosnt2基因互补载体及回复菌株的构建

为了验证突变体的表型是因为基因mosnt2的缺失而引起的，按照oldenburg等(oldenburg等，1997，nucleicacidsresearch，25:451-452)所述的酵母细胞内重组的方法，构建互补载体pneb-mosnt2-gfp-bar，该载体中mosnt2蛋白的c末端标记绿色荧光蛋白gfp，以利于分析mosnt2的蛋白亚细胞定位，该载体构建方法如下：

(1)以guy11的基因组dna为模板，分别以snt2-for1和snt2-rev1、snt2-for2和snt2-rev2、snt2-for3和snt2-rev3、或snt2-for4和snt2-rev4为引物进行pcr扩增，扩增产物包含mosnt2全长基因的启动子和编码框的四个重叠片段；同时以gfp-snt2-for和gfp-snt2-rev为引物扩增获得绿色荧光蛋白的编码框及终止子；以bar-for和bar-rev为引物扩增草铵膦的抗性筛选标记基因bar；将上述扩增得到的六个dna片段，与经saci和hindiii双酶切线性化处理的载体pneb-nat(he等，plosone，2012，7(3):e33270)一起，共转化酵母感受态细胞，在酵母细胞内的重组修复系统的作用下，dna片段和载体即可连接形成重组载体，命名为pneb-mosnt2-gfp-bar。其中所述的引物snt2-for1和snt2-rev1为：

snt2-for1：

5’-aactgttgggaagggcgatcggtgcgggccactagttcattgttaccgaaagaagcc-3’(seqidno：25)；

snt2-rev1：5’-aacccttttgagccatgaattcgacgaccaggcaggcaaatc-3’(seqidno：26)。

所述的引物snt2-for2和snt2-rev2为：

snt2-for2：5’-cctgcctggtcgtcgaattcatggctcaaaagggttcaggtg-3’(seqidno：27)；

snt2-rev2：5’-agtggattcccaggtagcg-3’(seqidno：28)。

所述的引物snt2-for3和snt2-rev3为：

snt2-for3：5’-tgtaccatgccagcctctg-3’(seqidno：29)；

snt2-rev3：5’-tgacgcttccgataatgttct-3’(seqidno：30)。

所述的引物snt2-for4/snt2-rev4为：

snt2-for4：5’-acccaaccagcattcttccc-3’(seqidno：31)；

snt2-rev4：5’-agacagtagatttcgcaacg-3’(seqidno：32)。

所述的引物gfp-snt2-for和gfp-snt2-rev为：

gfp-snt2-for：5’-gccagcccttcgttgcgaaatctactgtctcccgggatggtgagcaagggcgagga-3’(seqidno：33)；

gfp-snt2-rev：

5’-agtgctccttcaatatcatcttctgtcgacggccggccgtggagatgtggagtgggc-3’(seqidno：34)。

所述的引物bar-for和bar-rev为：

bar-for：5’-gtcgacagaagatgatattg-3’(seqidno：35)；

bar-rev：

5’-ttcacacaggaaacagctatgaccatgattatttaaatacgcgtggccggccgtcgacctaaatctcggtgacgg-3’(seqidno：36)。

(2)将步骤(1)中所得的重组载体pneb-mosnt2-gfp-bar转化至突变体△mosnt2.1原生质体，获得回复突变体，将回复突变体命名为：compl.(compl.为英文单词complement缩写形式，表示补充、恢复的意思)。

实施例6：mosnt2敲除突变体△mosnt2和野生型及回复菌株的对比分析

(1)敲除突变体△mosnt2菌落生长试验

将野生型guy11、敲除突变体△mosnt2.1、△mosnt2.2和回复菌株compl.分别接种于cm琼脂培养基上，在25℃条件下培养培养10天，然后观察菌落。

结果(见图6)敲除突变体△mosnt2.1和△mosnt2.2的菌落明显小于野生型菌株guy11和回复菌株compl.的菌落；此外，敲除突变体△mosnt2.1和△mosnt2.2菌落的气生菌丝很少，而野生型guy11和回复菌株compl.的气生菌丝浓密。说明mosnt2基因的缺失影响了稻瘟病菌的菌落形态和生长速度。

(2)敲除突变体△mosnt2的产孢量检测

(a)将野生型菌株guy11、敲除突变体△mosnt2.1和△mosnt2.2、回复菌株compl.分别接种在cm琼脂培养基上，16小时光照/8小时黑暗，在25℃条件下生长10天，然后在显微镜下观察分生孢子产生情况。

结果(见图7)野生型guy11和回复菌株compl.的气生菌丝上分化形成大量分生孢子，而敲除突变体△mosnt2.1和△mosnt2.2的气生菌丝上则极少形成分生孢子；说明mosnt2基因的缺失使产孢量大大减少。

(b)用5ml无菌水刮取菌落表面的分生孢子，并用擦镜纸过滤孢悬液，然后于显微镜下统计孢子数量。

结果(见图8)敲除突变体△mosnt2.1和△mosnt2.2产生的孢子数量明显少于野生型菌株guy11和回复菌株compl.。说明mosnt2在产孢过程中发挥关键作用。

(c)在显微镜下对敲除突变体△mosnt2的孢子形态进行观测。

结果(见图9)野生型guy11和回复菌株compl.的孢子呈现正常的梨形，而敲除突变体△mosnt2.1和△mosnt2.2的分生孢子的形态异常，呈长条形、圆形或棒状。说明mosnt2在孢子形态建成过程中发挥重要作用。

以上结果说明mosnt2基因在稻瘟病菌的产孢和孢子形态建成过程中发挥重要作用。

(3)敲除突变体△mosnt2对细胞壁胁迫的敏感性试验

荧光增白剂(calcofluorwhite，cfw)能结合真菌胞壁成分几丁质，因此会影响真菌胞壁的组装与结构，对真菌造成细胞壁胁迫。将野生型guy11、敲除突变体△mosnt2.1、△mosnt2.2菌株和回复菌株compl.接种于包含200μg/ml荧光增白剂的cm琼脂平板上生长5天，然后观察菌落形态。

结果(见图10)：与野生型guy11与回复菌株compl.相比，敲除突变体△mosnt2.1、△mosnt2.2在cfw胁迫平板上的菌落生长显著减弱，对cfw更加敏感。这说明mosnt2影响稻瘟病菌细胞壁完整性。

(4)敲除突变体△mosnt2对氧化胁迫的敏感性试验

向cm琼脂培养基添加过氧化氢(h2o2)，使其终浓度分别为2mm、3mm或5mm，从而形成氧化胁迫生长环境，将野生型guy11、敲除突变体△mosnt2.1、△mosnt2.2菌株和回复菌株compl.接种于添加过氧化氢(h2o2)的cm琼脂培养基上，在25℃生长10天，然后观察菌落形态。

结果(见图11)过氧化氢可明显抑制各菌株的菌落生长，但它对敲除突变体△mosnt2.1和△mosnt2.2的抑制程度要明显高于野生型guy11和回复菌株compl.；当过氧化氢浓度为5mm时，guy11与回复菌株compl.均可生长，但敲除突变体△mosnt2.1和△mosnt2.2则完全不能生长。说明敲除突变体对氧化胁迫高度敏感，因此mosnt2是调控稻瘟病菌氧化胁迫应答的重要因子。

(5)敲除突变体△mosnt2侵染器官附着孢观测试验

从生长于cm琼脂培养基的菌落收集分生孢子，制备为孢悬液，然后将孢悬液接种至疏水性玻片(fisherscientific产品)，在25℃放置0、10和24小时，然后在显微镜下进行观察。

结果(见图12)野生型guy11与回复菌株compl.在接种10小时后，均能在疏水性玻片上萌发并分化形成黑色素化的附着胞，但敲除突变体△mosnt2.1和△mosnt2.2虽然可萌发，但却不能分化形成附着孢；接种24小时后，野生型guy11与回复菌株compl.的附着孢成熟，并且分生孢子由于自噬而坍塌，但敲除突变体△mosnt2.1和△mosnt2.2仍不能形成附着孢，分生孢子保持完整形态而未坍塌。上述结果说明mosnt2在附着胞形成过程中发挥关键作用。

实施例7：mosnt2基因敲除突变体的稻瘟病致病性对比试验

按照如下方法进行：

(1)将稻瘟病菌野生型菌株guy11、敲除突变体△mosnt2.1、△mosnt2.2和回复菌株compl.分别接种于cm琼脂培养基上，在25℃生长10天，然后对生长有菌丝的琼脂块打孔。以实验室常用高感稻瘟病的水稻品种co39(该水稻材料保存于四川农业大学水稻研究所)为寄主材料。

(2)将菌块接种在育苗21天的co39的叶片上，未接菌琼脂块接种叶片作为对照。接种后5天观察水稻叶片发病情况。

结果(见图13)接种野生型guy11和回复菌株compl.的水稻叶片上形成了了典型的稻瘟病病斑，而接种敲除突变体△mosnt2.1和△mosnt2.2的水稻叶片上没有产生典型的稻瘟病病斑，只形成由超敏反应所引起的急性褐色斑点。

(3)将菌块接种在育苗21天的co39的根上，未接菌琼脂块接种的根作为对照，接种7天后观察发病情况。

结果(见图14)野生型guy11和回复菌株compl.可使根部坏死而变为黑色，而敲除突变体△mosnt2.1和△mosnt2.2不能使水稻根部产生黑色坏死斑，因而丧失了对水稻根部的致病性。

以上结果说明了mosnt2基因是稻瘟病菌致病性的关键基因。

以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。但本发明不受以上实施例的限制，本领域的普通技术人员可以从本发明公开的内容直接导出或联想到许多变形，其他任何未背离本发明的精神实质和原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应视为等效的置换方式，都应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>四川农业大学

<120>源于稻瘟病菌的致病性基因mosnt2及其用途

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