一种羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶及其应用的制作方法

本发明属于生物酶领域，具体地，涉及一种羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶及其应用。

背景技术：

酶（enzyme）的本质大部分是蛋白质，少数为非蛋白质，酶具有高效性、专一性、温和性，是一类特殊的催化剂，也称生物催化剂。但游离的酶稳定性差，极易在高温、强酸和强碱的环境中被破坏结构而变性失活，因此大大的限制了酶的大量重复使用。为了提高酶的稳定性，1953年由德国科学家（gubhofen）提出“固定化酶”，固定化酶是使用特殊的固体材料将酶固定在一定的区域内，但其仍然能够进行催化反应，且该酶可回收及重复利用的一类技术。固定化酶的基本方法有包埋法、交联法和共价键合法等，其中交联法是利用一类特殊的试剂在酶与载体间进行交联而形成共价键，从而得到交联网架结构。

木瓜蛋白酶（papain）通常为白色的粉末状，溶于磷酸缓冲液、微溶于水，有特殊的气味。由于木瓜蛋白酶活性中心是含有半胱氨酸的巯基蛋白酶，具有较强的水解多种蛋白酶的能力，且热稳定性好以及来源丰富等特点，因此在医药、食品等行业得到广泛的应用。研究发现，木瓜蛋白酶与胃蛋白酶的作用性能很相似，在一定程度上可以使用木瓜蛋白酶来帮助机体水解蛋白质。因此，在对于机体组织坏死的症状可用木瓜蛋白酶进行治疗，尤其是对于难以水解的蛋白质的水解效果更为有效，因此木瓜蛋白酶在医学上被称为“生物性解剖刀”。rakhimov做过大量的研究发现，对于烧伤、烫伤等普遍发生的创伤中，木瓜蛋白酶作为烧伤敷料可以有效地消除伤口红肿发炎，加快伤口愈合，并且对正常的组织细胞无副作用。基于木瓜蛋白酶的更深入研究，在不久的将来木瓜蛋白酶会在更多的领域行业得到更加广泛的应用。

现有技术中，通常以壳聚糖、树脂、纤维素纳米晶基材等为载体，通过交联法对木瓜蛋白酶进行固定化，载体的选择是影响固定化木瓜蛋白酶的稳定性和酶活力回收率的关键因素。目前以羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵为固定化载体，利用交联法固定木瓜蛋白酶还未见报导。

技术实现要素：

本发明的目的在于填补现有技术中的研究空白，提供一种羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶。本发明以羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵为固定化载体，得到的羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶具有较好的稳定性和酶活力回收率。

本发明的另一目的在于提供上述羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶在医药或食品领域中的应用。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶，所述固定化木瓜蛋白酶的制备方法如下：

s1：将羧甲基壳聚糖溶液和海藻酸钠溶液混合得混合溶液，备用；用磷酸缓冲溶液溶解木瓜蛋白酶得木瓜蛋白酶溶液，备用；

s2：于搅拌状态下将木瓜蛋白酶溶液加入所述混合溶液中，然后加入戊二醛溶液搅拌10～30min，然后再加入cacl2溶液并搅拌10～30min，得固化混合液备用；

s3：将s2所得固化混合溶液真空冷冻干燥，即得所述羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶；

其中，s1中，所述木瓜蛋白酶溶液的酶活为500～700u/ml；s2中，所述戊二醛溶液的浓度为1.0～1.6%。

壳聚糖本身不溶于水，但在引入亲水基团羧甲基后，壳聚糖内部的晶体结构被破坏致使羧甲基壳聚糖的水溶性显著提高。另外羧甲基壳聚糖分子中大量的氨基和羧基在交联剂戊二醛的作用下，分子内和分子间都可以发生交联作用而形成凝胶，经冷冻干燥后可形成优良的孔隙性和透气性的膜；同时羧甲基壳聚糖具有比壳聚糖更为优异的抑菌抗菌功效。

海藻酸钠(sodiumalginate,naalg,简称ags)是一种天然高分子多糖类化合物，一种白色或淡黄色粉末，广泛存在于各类棕色海藻中，具有较好的水溶性，充分吸水后体积可膨胀至10倍；具有较好的稳定性，在酸性、碱性以及高温的环境中都比较稳定；具有较好的凝胶成膜性，在少量含有ca²⁺的碱性溶液，ca²⁺可以迅速置换出凝胶中的na⁺形成海藻酸钙凝胶，这种凝胶的强度较好且为热不可逆的，冷冻干燥后形成薄膜，适用于作载体海绵或者止血海绵性等。

本发明提供的羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶，充分利用羧甲基壳聚糖和海藻酸钠在交联剂作用下可互相交联成膜的特性，得到具有较大比表面积和孔隙性的网状空间结构；木瓜蛋白酶一方面通过其非活性中心的氨基与戊二醛上的醛基进行化学反应形成席夫碱结构，吸附在复合海绵上；另一方面通过物理作用吸附在复合海绵上，从而使得本发明制备得到的羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶在较好的酶活力回收率的基础上，具有更好的稳定性；另外复合海绵还可增强固定化蛋白酶的杀菌抑菌功效。

优选地，s1中，所述木瓜蛋白酶溶液的酶活为600u/ml。研究表明，木瓜蛋白酶在复合海绵上的吸附量会随着固定化木瓜蛋白酶的增加而增加，此时酶活力回收率也随之增大；但当木瓜蛋白酶增加到一定量以后，木瓜蛋白酶的吸附已经接近饱和，此时多余的酶并不能吸附到复合海绵上，只能以游离的状态存在。

优选地，s2中，所述戊二醛溶液的浓度为1.0%。戊二醛在固定化反应中起交联的作用，但是戊二醛又会破坏酶的活性基团导致酶失活。发明人通过研究发现，随着戊二醛量的增加，在羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵形成了更多的网状空间结构使木瓜蛋白酶更多地结合在海绵上，但戊二醛用量到一定量之后，戊二醛与木瓜蛋白酶活性中心的氨基反应增加，使木瓜蛋白酶活性降低或失活，因此选用适合的戊二醛浓度是保证固定化木瓜蛋白酶固定效果和酶活力回收率的关键。

优选地，所述羧甲基壳聚糖/海藻酸钠与木瓜蛋白酶的质量体积比为1:3～8；即每克羧甲基壳聚糖/海藻酸钠载体固化的木瓜蛋白酶的活力单位为2000～4000u。

优选地，所述戊二醛与羧甲基壳聚糖/海藻酸钠的质量比为2:5～25。

优选地，所述混合溶液中羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的质量比为3:7～7:3。

羧甲基壳聚糖和海藻酸钠作为不同的海绵材料，其配比不同，在戊二醛和氯化钙的交联作用下，形成的网状结构也不同，木瓜蛋白酶与海绵的结合量也不同，进而也影响了酶活力回收率的高低。发明人研究发现，当羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的质量比在本方案范围内时，具有更为优异的酶活力回收率。

优选地，所述混合溶液中羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的摩尔比为4:6。

优选地，s2中的反应温度为20～40℃

优选地，s2中的反应温度为25℃。

上述羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶在医药领域中的应用也在本发明的保护范围内。

与现有技术相比，本发明提供的羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶为网络空间结构，具有比表面积大、孔隙性和吸水性好的优点；木瓜蛋白酶可通过化学作用和物理吸附与复合海绵结合。本发明提供的羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶在具有较好的酶活力回收率的同时还具有较好的稳定性。另外，该固定化木瓜蛋白酶还具有较好的杀菌抑菌功效。

附图说明

图1为本发明提供的羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶；

图2为本发明提供的羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶的显微结构（40×）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述。这些实施例仅是对本发明的典型描述，但本发明不限于此。下述实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的原料，试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。

实施例1~10

实施例1~10中的羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶由如下制备方法制得：

s1：将羧甲基壳聚糖溶液和海藻酸钠溶液混合得混合溶液，备用；同时用磷酸缓冲溶液溶解木瓜蛋白酶得木瓜蛋白酶溶液，备用；

s2：于搅拌状态下将木瓜蛋白酶溶液加入所述混合溶液中，然后加入戊二醛溶液搅拌10min后加入cacl2溶液搅拌10min，得固化混合液备用；

s3：将s2所得固化混合溶液真空冷冻干燥，即得所述羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶。

实施例1~10中羧甲基壳聚糖/海藻酸钠的质量配比、木瓜蛋白酶溶液的酶活、戊二醛的用量及s2中反应温度如下表1，实施例1~10中羧甲基壳聚糖/海藻酸钠溶液的总质量为10g，木瓜蛋白酶溶液的用量为1ml，戊二醛溶液的用量为0.5ml。

表1实施例1~10中物料和控制条件

对比例1~4

对比例1~4中各物料用量和条件控制如下：

表2对比例1~4中各物料用量和条件控制

对比例1和对比例2为不同戊二醛质量分数条件下制备得到的羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶，其余条件及制备方法与实施例1一致。其中对比例1中戊二醛质量分数为0.7%；对比例2中戊二醇质量分数为1.8%。

对比例3为仅选用壳聚糖对木瓜蛋白酶进行固定，得到壳聚糖固定化木瓜蛋白酶，其中壳聚糖的用量与羧甲基壳聚糖/海藻酸钠的总质量相同，其余条件及制备方法与实施例1中的一致。

对比例4为选用壳聚糖/海藻酸钠为载体，得到壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶，其中壳聚糖/海藻酸钠的配比与实施例1中一致，壳聚糖/海藻酸钠的用量与羧甲基壳聚糖/海藻酸钠的用量相同，其余条件及制备方法与实施例1中的一致。

性能测定

（1）羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶形貌分析

图1为本发明制备得到的羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶，由图1可观察到其呈白色，质地柔软，表面平整；该固定化木瓜蛋白酶的显微结构如图2，从图中可以看出，复合海绵的表面为不规则的多孔结构，具有优良的孔隙性和透气性，适合用于作木瓜蛋白酶的固定化的载体。

（2）羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶的活性测定

测试方法：

精密称取1/5制备好的海绵，放置10ml具塞的试管中，加入2ml配制好的酶稀释液，完全浸没2h，充分膨胀后，置37±0.2℃的水浴中保温10min，加入5.00ml已预热的酪蛋白溶液，充分震荡，放回水浴中反应10min，再加入5.00ml已预热的三氯乙酸溶液，充分震荡，最后放置水浴中40min。用干净的滤纸过滤上述反应物，取滤液。于2h内，用蒸馏水作为参比溶液，在紫外分光光度计波长为275nm测出吸光度a1。

空白实验：精密称取1/5制备好的海绵，放置10ml具塞的试管中，加入2ml配制好的酶稀释液，完全浸没2h，充分膨胀后，置37±0.2℃的水浴中保温10min，加入5.00ml已预热的三氯乙酸溶液，充分震荡，放回水浴中反应10min，再加入5.00ml已预热的酪蛋白溶液，充分震荡，最后放置水浴中40min。用干净的滤纸过滤上述反应物，取滤液。于2h内，用蒸馏水作为参比溶液，在紫外分光光度计波长为275nm测出吸光度a2。

酪氨酸标准溶液吸光度：在紫外分光光度计波长为275nm处，以蒸馏水作为参比溶液，测出50ug/ml酪氨酸标准溶液吸光度a3。

根据以下公式计算结果：

试样中木瓜蛋白酶活力x1（u/g）按式（1）计算：

（1）

式中：a1——试样溶液的吸光度；

a2——空白试验的吸光度；

a3——酪氨酸标准溶液的吸光度；

m1——对照品溶液中每毫升含酪氨酸的量，单位为微克（µg）；

m2——试样的质量，单位为克（g）；

n——试样溶液的稀释倍数。

u/g表示固定化酶活力，回收率按下式计算：

固定化酶活力回收率（%）=固定化酶活力（u）/溶液酶总活力（u）×100%。其中，固定化酶活力是指酶被固定化后测得的固定化酶的活力，溶液酶总活力是指固定化前酶溶液中酶的活力。

测试结果如表3。

表3实施例1~10和对照例1~2酶活力回收率测定结果

由上述可知，实施例1~10中的羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶的回收率均在51%~65%范围内，回收率较高。

（3）羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶热稳定性研究

在不同温度条件保存一定的时间后测试羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶的活性并计算酶的活性回收率，从而得到热稳定性测试结果。选取的温度分别为：低温（0℃以下）、室温（25±2℃）、高温（40±1℃）；保存时间分别为：1d、3d、5d、10d、15d；每一个样品重复试验3次后取平均值。

测定结果如下表4。

表4实施例1~10和对照例1~2热稳定性研究结果

由上述结果可知，实施例1中的固定化蛋白酶在低温、常温、高温条件下分别保存15d后与新制备的相比，总体上保持相对稳定，稳定性较好。