耐热β‑淀粉酶‑海藻糖合成酶融合酶、其表达基因以及分泌该融合酶的工程菌与应用的制作方法

本发明涉及耐热β-淀粉酶-海藻糖合成酶融合酶、其表达基因以及分泌该融合酶的工程菌与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术：

海藻糖(trehalose)又称漏芦糖、蕈糖等，化学名α-d-吡喃葡糖基α-d-吡喃葡糖苷，是由2个葡萄糖分子通过α,α-1,1-糖苷键构成的天然非还原性双糖，分子式为c12h22o11·2h2o，分子量378.33。海藻糖在自然界中许多可食用动植物及微生物体内都广泛存在，如蘑菇、海藻、豆类、虾、面包、啤酒及酵母发酵食品中都有含量较高的海藻糖。海藻糖对多种生物大分具有非特异性的保护作用。科学家们发现，海藻糖创造了多种生命的奇迹，如卷柏在干旱时几近枯死，遇水后却又可以奇迹般复活；一些昆虫在高寒、高温和干燥失水等条件下不冻结、不干死。因此，海藻糖在科学界有“生命之糖”的美誉。

海藻糖不存在游离的醛基，化学性质稳定，是一种天然的多功能的糖类，具有热值低、甜味绵柔、抗淀粉老化、抗蛋白质变性等作用，在食品、保鲜、医药等行业具有广泛的应用。在食品领域，海藻糖不发生美拉德反应，不会对食品的色泽、风味、质地等产生不良影响，是理想的食品保鲜剂和甜味剂。在医药领域，海藻糖可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂。在化妆品方面，海藻糖具有较强的保湿、防晒等多方面的生理功效。

最初，海藻糖主要从菌体中抽提获得，以乳酸菌、酵母、霉菌及其他一些含海藻糖的菌体为提取源。由于海藻糖在酵母中的含量最大，所以通常以酵母提取为主。经过多次工艺改进，目前这种工艺已相当成熟，但由于制造成本高、收率低、价格高，限制了其大规模应用。随着科学技术的发展，人们提出了使用酶法合成海藻糖，以及从酶法衍生出的基因工程法。酶法合成海藻糖可分为单酶法和双酶法。单酶法利用海藻糖合成酶(trehalosesynthase，ec5.4.99.16)，以麦芽糖为底物通过分子内转糖基反应，将麦芽糖转化为海藻糖。双酶法应用比较成功的主要有麦芽寡糖基海藻糖合成酶(mtsase，ec5.4.99.15)和麦芽寡糖基海藻糖海藻糖水解酶(mthase，ec3.2.1.141)，以直链淀粉为底物合成海藻糖，开辟了淀粉生产海藻糖的新时代。

以淀粉为原料通过酶转化合成海藻糖，首先需要生产大量mtsase和mthase。两种酶均为胞内酶，要获得生产用酶，首先需要利用野生菌或者工程菌发酵获得大量菌体，然后通过繁琐的蛋白分离纯化步骤，才能获得足够的酶，无疑会增加生产成本。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中以淀粉为底物合成海藻糖过程中需要利用野生菌或者工程菌发酵获得大量菌体，然后通过繁琐的蛋白分离纯化步骤，才能获得足够的酶，生产成本高的问题，提供耐热β-淀粉酶-海藻糖合成酶融合酶、其表达基因以及分泌该融合酶的工程菌与应用，，具体提供了可分泌表达耐热β-淀粉酶-海藻糖合成酶融合酶基因工程菌并利用该工程菌发酵产酶用于制备海藻糖。

本发明的技术方案如下：

耐热β-淀粉酶-海藻糖合酶融合酶，包含seqidno.1的氨基酸序列或与seqidno.1具有80％至100％相似性的氨基酸序列。

上述耐热β-淀粉酶-海藻糖合酶融合酶的表达基因，包含seqidno.2的核苷酸序列或与seqidno.2具有80％至100％相似性的核苷酸序列。

一种重组载体，该载体含有如seqidno.2所示核苷酸序列的表达基因或与seqidno.2具有80％至100％相似性的核苷酸序列的表达基因。

优选地，所述的载体为pmizy04v2。

一种重组细胞，包含有上述重组载体或表达上述述耐热β-淀粉酶-海藻糖合酶融合酶。

优选地，所述的重组细胞为解脂耶罗威亚酵母(yarrowialipolytica)po1h菌株。

上述β-淀粉酶-海藻糖合酶融合酶、上述耐热β-淀粉酶-海藻糖合酶融合酶的表达基因或上述重组载体在制备海藻糖中的应用。

上述重组细胞在制备海藻糖中的应用。

优选地，所述的应用，是将上述重组细胞培养后获得粗酶液，然后利用粗酶液转化直链淀粉制备海藻糖。

优选地，所述重组细胞的培养方法为在ppb培养基中15℃至30℃条件下培养。

优选地，所述直链淀粉的添加量为终浓度的1％(质量)。

优选地，所述转化的条件为45℃～75℃反应24h～72h。

本发明β-淀粉酶来源于嗜热产硫耐热厌氧菌(thermoanaerobacteriumthermosulfurigenes)的β-淀粉酶；海藻糖合成酶基因来源于嗜热栖热菌(thermusthermophilus)，前者可以水解直链淀粉生成麦芽糖，后者可以将麦芽糖转化为海藻糖，设计构建融合酶，氨基酸序列如seqidno.1所示，核苷酸序列如seqidno.2所示的核苷酸序列，将上述序列连接到puc57-simple载体上，然后亚克隆到pmizy04v2表达载体上，构建了重组载体pmizy04v2-bamm-tres，然后转化到解脂耶罗威亚酵母po1h菌株中，得到了可分泌耐热β-淀粉酶-海藻糖合成酶融合酶的工程菌，然后在ppb培养基中培养48～120h，离心收集上清即得粗酶液。向粗酶液中加入1％的直链淀粉，45～65℃反应24～72h，可将直链淀粉转化为海藻糖。

本发明有益效果：

1、本发明所用表达宿主——解脂耶罗威亚酵母不同于大肠杆菌等产酶宿主，前者是一种生物安全的酵母，在食品行业具有悠久的应用，后者具有潜在的致病性。将解脂耶罗威亚酵母作为应用于海藻糖生产用酶的表达宿主，具有生物安全性。

2、本发明重组菌所分泌的β-淀粉酶-海藻糖合成酶融合酶具有耐热性能，能够在较高的温度下进行反应，可以省去胞内酶繁琐的酶提取和分离纯化步骤，简化海藻糖生产工艺，降低生产成本。在较高的反应温度条件下(45～75℃,优选65℃)，反应速度更快，可快速达到平衡，且较高的反应温度更适合工业生产。另外，较高的反应温度还可以使其他蛋白迅速失活，减少了副反应的发生。

3、本发明提供的酵母工程菌株，营养要求低，培养简单易操作。菌株经发酵培养后，经简单离心收集上清液即可得到粗酶液，粗酶液可直接用于转化底物生产海藻糖，可省去繁琐的蛋白分离纯化步骤，大大降低了生产成本。

附图说明

图1是pmizy04v2分泌表达载体质粒图谱。

图2是耐热β-淀粉酶与海藻糖合成酶融合酶重组质粒图谱。

图3是重组质粒酶切后琼脂糖凝胶电泳图谱。

图4是含有融合酶表达载体的重组细胞发酵液上清作用于直链淀粉后，tlc分析结果。

图5是含有融合酶表达载体的重组细胞发酵液上清作用于直链淀粉后，hplc分析结果。

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本发明以及创新之处。所列出的实施例仅用于具体说明本发明而非对本发明的进一步限定，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

以下实施例中，除非特别说明，均为常规实验方法。

生物材料来源

大肠杆菌dh5α感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司；

解脂耶罗威亚酵母po1h菌株，由法国国家农业研究所馈赠。

以下实施例中用到的培养基及其他溶液配制方法如下：

lb培养基：胰蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％。制作固体培养基时，额外加入1.5％的琼脂。121℃高压蒸汽灭菌20min。使用时，可加入适当浓度的抗生素。

ypd培养基：蛋白胨2％，酵母浸粉1％，葡萄糖2％。制作固体培养基时，额外加入1.5％的琼脂。115℃高压蒸汽灭菌30min。

ynb-n5000培养基：无氨基酸酵母氮源(不含硫酸铵)0.17％，硫酸铵0.5％，葡萄糖1％，3种成分混合溶解后，用0.22μm膜过滤除菌。制作固体培养基时，琼脂单独灭菌，冷却至50℃后，加入以上溶液，使琼脂终浓度为2％。

ppb培养基：蔗糖或甘油20g/l，酵母浸粉1.32g/l，kh2po40.32g/l，nh4cl1.32g/l，mgso40.132g/l，盐酸硫胺素0.334mg/l，溶解于20mm柠檬酸缓冲液(ph6.0)。115℃高压蒸汽灭菌30min。

te缓冲液：(1)1mtris-hcl(ph8.0)的配制：称取6.057gtris-base，加入40ml超纯水溶解，滴加浓hcl约2.1ml，调ph至8.0，定容至50.0ml，高压灭菌，室温保存；(2)0.5medta(ph8.0)50.0ml的配制：称取9.306gedta-na2·2h2o，加入超纯水35ml，剧烈搅拌，用约1gnaoh颗粒调ph至8.0，定容至50.0ml；(3)1×te：取1.0ml1mtris-hcl(ph8.0)、0.5ml0.5medta(ph8.0)，加入超纯水，定容至1.0l，高压蒸汽灭菌，室温保存。

0.1mliac溶液：称取1.02gliac·2h2o溶于80ml超纯水中，用冰醋酸调节ph至6.0，加超纯水定容至100.0ml，高压蒸汽灭菌，室温保存。

40％(w/v)peg4000溶液：称取2.0gpeg4000，溶于3ml0.1mliac中，60℃加热溶解，冷却后定容至5.0ml，0.22μm无菌滤器过滤除菌，-20℃保存。

1mdtt溶液：称取1.542g二硫苏糖醇，溶于8ml超纯水中，定容至10.0ml，0.22μm无菌滤器过滤除菌，-20℃保存。

实施例1

耐热β-淀粉酶-海藻糖合成酶重组质粒构建，步骤如下：

设计如seqidno.2所示核苷酸序列(编码如seqidno.1所示的氨基酸序列)，由第三方公司合成并克隆到puc57-simple载体上，获得puc57s-bamm-tres质粒，经bbsi/hindiii限制性内切酶消化后，回收目的片段，连接到同样经bbsi/hindiii限制性内切酶消化的pmizy04v2表达载体的相应位点上，所得重组质粒如图2所示。

seqidno.1所示的氨基酸序列如下所示：

siapnfkvfvmgplekvtdfnafkdqlitlknngvygittdiwwgyvenagenqfdwsyyktyadtvraaglkwvpimsthacggnvgdtvnipipswvwtkdtqdnmqykdeagnwdneavspwysgltqlynefyssfasnfssykdiitkiyisggpsgelrypsynpshgwtypgrgslqcyskaaitsfqnamkskygtiaavnsawgtsltdfsqispptdgdnfftngykttygndfltwyqsvltnelaniasvahscfdpvfnvpigakiagvhwlynsptmphaaeycagyynystlldqfkasnlamtftclemddsnayvspyysapmtlvhyvanlannkgivhngenalaisnnnqayvncaneltgynfsgftllrlsnivnsdgsvtsemapfvinivtltpngtipvtftinnattyygqnvyivgstsdlgnwnttyargpascpnyptwtitlnllpgeqiqfkavkidssgnvtweggsnhtytvptsgtgsvtitwqnggsggsggsmdplwykdaviyqlhvrsffdanndgygdfeglrrklpyleelgvntlwlmpffqsplrddgydisdyyqilpvhgtledfkrfldeahgrgmkviielvlnhtsidhpwfqearkpgspmrdwyvwsdtpekykgvrvifkdfetsnwtfdpvakayywhrfywhqpdlnwdnpevekaihqvmffwadlgvdgfrldaipylyeregtscenlpetieavkrlrkaleerygpgkillaeanmwpeetlpyfgdgdgvhmaynfplmprifmalrredrgpietmlketegipetaqwalflrnhdeltlekvteeerefmyeayapdpkfrinlgirrrlmpllggdrrryelltallltlkgtpivyygdeigmgdnpflgdrngvrtpmqwsqdrnagfsrapyhalflppvsegpysyhfvnveaqrenphsllsfnrrflalrnqhakifgrgsltllpvenrrvlaylrehegervlvvanlsrytqafdlpleayqglvpvelfsqqpfppvegryrltlgphgfalfalkpveavlhlpspdwaeepapeeadlprvhmpggpevllvdtlvhergreellnalaqtlkekswlalkpqkvalldalrfqkdpplyltllqlenhrtlqvflpllwspqrregpglfarthgqpgyfyelsldpgfyrlllarlkegfegrslrayyrgrhpgpvpeavdllrpglaagegvwvqlglvqdggldrtervlprldlpwvlrpegglfwergasrrvlaltgslppgrpqdlfaalevrlleslprlrghtpgtpgllpgalhetealvrllgvrlallhralgevegvegghpllgrglgaflelegevylvalgaekrgaveedlarlaydveravhlalealeaelwafaeevadylhaaflqayrsalpeealeeagwtrhmaevaaehlhreerparkriherwqakagka.

seqidno.2的核苷酸序列如下所示：

gaagactaggcctctatcgctcccaacttcaaggtgttcgtcatgggccccctggagaaggtgaccgacttcaacgccttcaaggaccagctgattaccctgaagaacaacggcgtgtacggaatcaccaccgacatttggtggggatacgtcgagaacgctggagagaaccagttcgactggtcctactacaagacctacgctgacaccgtgcgagctgctggtctgaagtgggtccccatcatgtctacccacgcctgtggcggaaacgtgggcgacaccgtcaacatccccattccctcctgggtgtggaccaaggacacccaggacaacatgcagtacaaggacgaggccggcaactgggacaacgaggctgtctctccctggtactccggactgacccagctgtacaacgagttctactcttccttcgcctctaacttctcttcctacaaggacatcattaccaagatctacatttctggtggtccttccggagagctgcgatacccttcttacaacccttcccacggatggacctaccctggacgaggttctctgcagtgttactccaaggccgctatcacctctttccagaacgctatgaagtccaagtacggcaccattgccgctgtgaactctgcctggggaacctccctgaccgacttctcccagatctctccccccaccgacggagacaacttcttcaccaacggctacaagaccacctacggaaacgacttcctgacctggtaccagtctgtgctgaccaacgagctggccaacattgcttctgtcgcccactcctgcttcgaccccgtgttcaacgtccccatcggcgctaagattgccggagtccactggctgtacaactcccccaccatgccccacgccgctgagtactgtgccggctactacaactactctaccctgctggaccagttcaaggcctccaacctggctatgaccttcacctgcctggagatggacgactctaacgcctacgtgtctccctactactccgctcccatgaccctggtgcactacgtcgctaacctggccaacaacaagggtatcgtgcacaacggcgagaacgccctggctatttccaacaacaaccaggcctacgtcaactgtgctaacgagctgaccggatacaacttctctggtttcaccctgctgcgactgtccaacatcgtgaactccgacggatctgtcacctccgagatggctcccttcgtgatcaacattgtcaccctgacccccaacggcaccatccccgtgaccttcaccattaacaacgccaccacctactacggacagaacgtgtacatcgtcggttctacctccgacctgggcaactggaacaccacctacgctcgaggtcctgcttcttgccccaactaccccacctggaccattaccctgaacctgctgcccggagagcagatccagttcaaggccgtgaagattgactcttccggcaacgtcacctgggagggaggttccaaccacacctacaccgtgcccacctctggcaccggatctgtcaccatcacttggcagaacggcggatctggtggctccggaggttctatggaccccctgtggtacaaggacgccgtgatctaccagctgcacgtccgatccttcttcgacgctaacaacgacggatacggtgacttcgagggtctgcgacgaaagctgccctacctggaggagctgggcgtgaacaccctgtggctgatgcccttcttccagtcccccctgcgagacgacggctacgacatctctgactactaccagattctgcccgtccacggaaccctggaggacttcaagcgattcctggacgaggctcacggccgaggaatgaaggtcatcattgagctggtcctgaaccacacctccatcgaccacccttggttccaggaggctcgaaagcctggttcccctatgcgagactggtacgtgtggtctgacacccccgagaagtacaagggagtgcgagtcattttcaaggacttcgagacctctaactggaccttcgaccccgtcgccaaggcttactactggcaccgattctactggcaccagcccgacctgaactgggacaaccccgaggtggagaaggccattcaccaggtcatgttcttctgggctgacctgggcgtggacggattccgactggacgccatcccctacctgtacgagcgagagggcacctcttgcgagaacctgcccgagaccattgaggccgtcaagcgactgcgaaaggctctggaggagcgatacggtcctggcaagatcctgctggctgaggctaacatgtggcccgaggagaccctgccctacttcggagacggtgacggcgtgcacatggcctacaacttccccctgatgccccgaattttcatggctctgcgacgagaggaccgaggacccatcgagaccatgctgaaggagaccgagggtattcccgagaccgcccagtgggctctgttcctgcgaaaccacgacgagctgaccctggagaaggtgaccgaggaggagcgagagttcatgtacgaggcctacgctcccgaccccaagttccgaatcaacctgggaattcgacgacgactgatgcccctgctgggcggagaccgacgacgatacgagctgctgaccgccctgctgctgaccctgaagggtacccccatcgtgtactacggcgacgagattggaatgggtgacaaccccttcctgggagaccgaaacggtgtccgaacccctatgcagtggtcccaggaccgaaacgctggtttctctcgagctccttaccacgctctgttcctgcctcccgtgtccgagggcccctactcttaccacttcgtgaacgtcgaggcccagcgagagaacccccactccctgctgtctttcaaccgacgattcctggccctgcgaaaccagcacgctaagatcttcggtcgaggatccctgaccctgctgcctgtggagaaccgacgagtcctggcttacctgcgagagcacgagggagagcgagtgctggtggtcgccaacctgtcccgatacacccaggccttcgacctgcctctggaggcctaccagggcctcgtgcccgtcgagctgttctctcagcagcctttccctcctgtggagggtcgataccgactgaccctgggtcctcacggtttcgctctgttcgctctgaagcctgtggaggctgtcctgcacctgccttctcctgactgggctgaggagcctgctcctgaggaggctgacctgcctcgagtgcacatgcctggtggtcctgaggtgctgctggtcgacaccctggtccacgagcgaggacgagaggagctgctgaacgccctggctcagaccctgaaggagaagtcctggctggctctgaagccccagaaggtcgccctgctggacgctctgcgattccagaaggacccccccctgtacctgaccctgctgcagctggagaaccaccgaaccctgcaggtcttcctgcctctgctgtggtctcctcagcgacgagagggtcctggtctgttcgctcgaacccacggacagcccggttacttctacgagctgtccctggaccctggtttctaccgactgctgctggctcgactgaaggagggcttcgagggacgatctctgcgagcttactaccgaggtcgacaccctggacctgtgcctgaggctgtcgacctgctgcgacctggactggctgctggagagggtgtgtgggtccagctgggtctggtgcaggacggaggtctggaccgaaccgagcgagtgctgcctcgactggacctgccttgggtcctgcgacccgagggcggactgttctgggagcgaggagcttcccgacgagtgctggctctgaccggatctctgcctcctggtcgacctcaggacctgttcgccgctctggaggtccgactgctggagtccctgcctcgactgcgaggtcacacccctggtacccctggtctgctgcctggagccctgcacgagaccgaggctctggtgcgactgctgggcgtccgactggctctgctgcaccgagctctgggagaggtggagggtgtcgagggtggtcaccccctgctgggccgaggactgggtgccttcctggagctggagggagaggtgtacctggtcgctctgggtgctgagaagcgaggagctgtggaggaggacctggctcgactggcttacgacgtggagcgagctgtccacctggctctggaggctctggaggctgagctgtgggctttcgctgaggaggtcgccgactacctgcacgccgctttcctgcaggcctaccgatctgctctgcctgaggaggccctggaggaggctggttggacccgacacatggctgaggtggctgctgagcacctgcaccgagaggagcgacctgctcgaaagcgaattcacgagcgatggcaggccaaggctggaaaggcctaagctt

seqidno.2中下划线部分分别为bbsi和hindiii限制性酶切位点。

质粒酶切体系如表1-2所示：

表1puc57s-bamm-tres质粒酶切体系

表2pmizy04v2载体酶切体系

上述反应体系，37℃温育1h。琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段。

回收目的片段，连接，连接体系如表3所示：

表3连接体系

上述反应体系，16℃温育1h。

取5.0μl转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，步骤如下：

(1)从-80℃冰箱中取100μl感受态细胞悬液，置于冰上解冻。

(2)加入5.0μldna连接溶液，轻轻摇匀，冰浴30min。

(3)42℃水浴中热激90秒，迅速置于冰上冷却3分钟。

(4)向管中加入1mllb液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养1h。

(5)将上述菌液涂布于含氨苄青霉素的lb平板上，37℃静置培养14～16h。

挑取单菌落，转接于含有氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃振荡培养14h，提取质粒，经bbsi/hindiii双酶切验证无误后即得耐热β-淀粉酶-海藻糖合成酶融合酶分泌表达重组载体pmizy04v2-bamm-tres。

实施例2

重组菌株的获得，步骤如下：

(1)重组片段制备将pmizy04v2-bamm-tres重组载体采用noti限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳检测，回收大片段，备用。pmizy04v2-bamm-tres经酶切后预期出现两条片段，大小分别为7.6kb和2.7kb。重组载体noti酶切消化电泳结果如图3所示，两片段与预期一致。

(2)酵母感受态细胞制备将解脂耶罗威亚酵母po1h菌株接种到ypd固体培养基上，28℃培养过夜；挑取单菌落接种于5.0ml液体ypd培养基中，28℃振荡培养过夜；以终浓度5.0×10⁶cells/ml接种于50.0ml液体ypd培养基中，在28℃条件下，转速200rpm振荡培养4h；)4℃条件下，1500×g离心5min收集细胞，用25.0mlte溶液洗涤菌体2次；重悬细胞于1.0mlte中，10000×g离心10s，弃上清；重悬细胞于600.0μl0.1mliac(ph6.0)中，28℃水浴静置孵育1h；1500×g离心2min，弃上清，轻轻悬浮细胞于80.0～120.0μlliac中，此细胞悬液即为感受态细胞。

(3)酵母细胞转化取40.0μl感受态细胞，加入2.0μl鲑鱼精dna、3.0μl回收的重组载体dna，28℃水浴静置15min；加入360.0μl40％的peg4000、16.0μl1m的dtt，28℃静置水浴1h；加入40.0μldmso，39℃水浴10min；加入600.0μl0.1mliac，混合均匀，涂布于5个选择性(ynb-n5000)平板上，28℃静置培养2～3d。

(4)长出的菌落即为重组菌株，提取单菌落在ynb-n5000平板上划线纯化。

实施例3

重组菌株产海藻糖能力验证，步骤如下：

(1)挑取重组菌单菌落接种于5.0mlypd液体培养基中，28℃振荡培养过夜，此为种子液。

(2)取1.0ml种子液，转接于50.0mlppb培养基中，25℃振荡培养3～5d。

(3)1500×g离心5min，收集上清40ml，获得粗酶液，加入终浓度1％的直链淀粉，调节ph至6.5，65℃反应12h。

(4)取反应后溶液稀释10倍，0.22μm水相膜过滤，分别用薄层层析(tlc)和高压液相层析(hplc)检测。tlc和hplc检测结果如图4～5所示。图4中，泳道g、m、t和s分别为葡萄糖、麦芽糖、海藻糖和直链淀粉，泳道1～4为直链淀粉转化结果，可以看出，粗酶液可将直链淀粉转化为海藻糖。从图5可以看出，粗酶液转化直链淀粉产物中有麦芽糖和海藻糖。

利用hplc检测，溶液中海藻糖浓度为3.18g/l，由此推算，底物向海藻糖的转化率为28.9％。

本实施例中重组菌所分泌的β-淀粉酶-海藻糖合成酶融合酶具有耐热性能，能够在较高的温度下进行反应，本实施例以反应温度为65℃为例，但是反应温度不受本实施例限制，反应温度在45℃-65℃范围内任意取值均可以获得相同的技术效果。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120>耐热β-淀粉酶-海藻糖合成酶融合酶、其表达基因以及分泌该融合酶的工程

菌与应用

<130>1

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1493

<212>prt

<213>耐热β-淀粉酶-海藻糖合酶融合酶包含的氨基酸序列

<400>1

serilealaproasnphelysvalphevalmetglyproleuglulys

151015

valthrasppheasnalaphelysaspglnleuilethrleulysasn

202530

asnglyvaltyrglyilethrthraspiletrptrpglytyrvalglu

354045

asnalaglygluasnglnpheasptrpsertyrtyrlysthrtyrala

505560

aspthrvalargalaalaglyleulystrpvalproilemetserthr

65707580

hisalacysglyglyasnvalglyaspthrvalasnileproilepro

859095

sertrpvaltrpthrlysaspthrglnaspasnmetglntyrlysasp

100105110

glualaglyasntrpaspasnglualavalserprotrptyrsergly

115120125

leuthrglnleutyrasngluphetyrserserphealaserasnphe

130135140

sersertyrlysaspileilethrlysiletyrileserglyglypro

145150155160

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165170175

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180185190

serpheglnasnalametlysserlystyrglythrilealaalaval

195200205

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210215220

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245250255

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260265270

valproileglyalalysilealaglyvalhistrpleutyrasnser

275280285

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290295300

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325330335

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340345350

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<213>耐热β-淀粉酶-海藻糖合酶融合酶的表达基因

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