一种AsCpf1突变体蛋白、编码基因、重组表达载体及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物化学与分子生物学技术领域，具体涉及一种ascpf1突变体蛋白、编码基因、重组表达载体及其制备方法与应用。

背景技术：

基因编辑是在基因组水平上进行精确修饰的一种技术，可完成基因定点删除突变、基因定点插入突变、多位点同时突变和小片段的删失等。基因编辑技术可用于基因功能及疾病发病机理研究、构建疾病动物模型、生物治疗、遗传和肿瘤相关疾病研究、整合病毒疾病研究和改良农畜牧物种。crispr-cas9是继“锌指核酸内切酶(zfn)”、“类转录激活因子效应物核酸酶(talen)”之后出现的第三代基因组定点编辑技术。

ascpf1(acidaminococcμssp.cpf1)是一种rna介导的v型crispr-cas9系统内切酶，在单链crrna(crisprrna)存在的情况下，ascpf1识别双链dna的5’-tttn-3’pam(protospaceradjacentmotif)，并在双链dna的与crrna互补链的第18个碱基和非互补链的第23个碱基处对dna进行切割。与crispr-cas9基因编辑系统相比，crispr-ascpf1系统具有不需要tracrrna(trans-activatingcrrna)、切割靶向dna效率高、切割产生粘性末端等特点，是潜在的、可用于真核生物基因组编辑的工具。

pd-1(programmeddeath1)，程序性死亡受体，是一种重要的免疫抑制分子，为cd28超家族成员，最初是从凋亡的小鼠t细胞杂交瘤2b4.11克隆出来。作为癌症免疫治疗的重要靶点，以基因编辑t细胞的pd-1基因为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种ascpf1突变体蛋白，可用于编辑t细胞的pd-1基因。

为实现上述目的，本发明提供的ascpf1突变体蛋白，其氨基酸序列如seqidno：1所示。

本发明的目的之二是提供一种重组ascpf1基因突变体，对ascpf1基因进行结构改造，可用于编码上述ascpf1突变体蛋白。

为实现上述目的，本发明提供的一种重组ascpf1基因突变体ascpf1(s589q/p711t)，其核苷酸序列如seqidno：2所示。ascpf1(s589q/p711t)是对ascpf1基因进行密码子优化，并将野生型ascpf1中的两个氨基酸位点(s598q和p711t)突变得到。

本发明的目的之三是提供一种含重组ascpf1基因突变体的重组表达载体。

为实现上述目的，本发明提供的重组表达载体pet15b-ascpf1(s589q/p711t)，是以seqidno：2所示的ascpf1(s589q/p711t)为模板设计引物进行pcr扩增，再将纯化的pcr产物用无缝克隆方法插入pet15b载体的多克隆位点ncoi和xhoi之间得到。

本发明的目的之四是提供ascpf1突变体蛋白的制备方法，得到高纯度的ascpf1突变体蛋白。

为实现上述目的，本发明提供的ascpf1突变体蛋白的制备方法，包括如下步骤：

①编码ascpf1突变体蛋白原核表达载体的构建：以合成的ascpf1(s589q/p711t)基因组dna为模板，用pcr的方法扩增ascpf1(s589q/p711t)编码序列，将得到的pcr产物进行纯化，用无缝克隆方法插入pet15b载体的多克隆位点ncoi和xhoi之间，得到重组表达载体，经测序验证阅读框及dna序列全部正确，即成功构建了含重组ascpf1基因突变体的原核表达载体，命名为pet15b-ascpf1(s589q/p711t)；

②ascpf1突变体蛋白的表达：将原核表达载体pet15b-ascpf(s589q/p711t)转入表达宿主菌escherichiacolibl21(de3)，挑取单克隆接种至新鲜的含50mg/l氨苄青霉素的lb培养基，经37℃摇床培养至od600为0.6，加入终浓度为0.6mm的iptg诱导ascpf1(s589q/p711t)的表达；

③ascpf1突变体蛋白的纯化：收集一升发酵液的细胞，并用40ml冰浴的buffera重悬，冰浴超声裂解细胞，离心取上清，上清通过ni-ida柱；上样完毕用50mlbuffere洗涤ni-ida柱；50mlbufferg洗脱ni-ida柱，分管收集；将洗脱到的目的蛋白过cm离子柱；100mlbufferd洗涤cm离子柱；10mlbufferb洗脱cm离子柱，分管收集；使用专业分析软件grab-it2.5分析tat-as-cpf1蛋白纯度；洗脱的ascpf1(s589q/p711t)合并后将蛋白透析至20mmtris，50mmnaclph7.5，20％glycerol中；其中，buffera的组成为：20mmtris-hcl，50mmnacl，1％triton-100，20％glycerolph7.5；buffere的组成为：20mmtris-hclph7.5，2mnacl，0.1％tritonx-100，20％glycerol；bufferg的组成为：20mmtris-hclph7.5，50mmnacl，0.1％tritonx-100，500mm咪唑，20％glycerol；bufferd的组成为：20mmtris-hclph7.5，50mmnacl，0.1％tritonx-100，20％glycerol；bufferb的组成为：20mmtris-hclph7.5，50mmnacl，0.1％tritonx-100，20％glycerol。

本发明通过载体构建将密码子优化的ascpf1(s589q/p711t)基因克隆到pet15b载体中，在低温条件下ascpf1(s589q/p711t)在大肠杆菌中蛋白表达量可以达到18％，可溶性达到95％。

本发明的目的之五是提供ascpf1突变体蛋白、重组ascpf1基因突变体和重组表达载体在基因编辑原代t细胞pd-1方面的应用。

本发明的目的之六是提供ascpf1突变体蛋白编辑原代t细胞pd-1的方法，能更有效、便捷地编辑原代t细胞pd-1的基因。

具体包括以下步骤：

(1)原代t细胞pd-1基因部分序列扩增

以提取的原代t细胞pd-1基因组dna为模板，pcr扩增并回收扩增片段，pcr扩增所用正向引物为：5’-actccccagacaggccctg-3’(seqidno：6)，反向引物为：5’-caggggctggccggtgcg-3’(seqidno：7)；pcr反应体系为：基因组dna模板100ng，20μm正向引物1μl，20μm反向引物1μl，2xultrapfumix25μl，加ddh2o至总体积50μl；pcr反应条件为：94℃热变性5分钟，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共进行30个循环；

(2)ascpf1突变体蛋白体外切割pd-1

取1μg步骤(1)回收的pd-1产物、1μl纯化的ascpf1突变体蛋白、1μg合成的crrna、2μl10*reactionbuffer，配制成20μl体外切割反应体系，37℃水浴30min后，2％琼脂糖凝胶电泳检测切割；其中10*reactionbμffer的组成为：500mmkac、200mmtris-醋酸、100mmmg(ac)2、1mg/mlbsaph7.9@25℃；

(3)westernblotting检测ascpf1突变体蛋白处理原代t细胞后，pd-1表达水平变化

取1×10⁶个原代t细胞pd-1，加入20μg纯化的ascpf1突变体蛋白，10μg合成的crrna混匀冰浴，电转化仪点击转化后铺6孔板，72h后提取蛋白，westernblotting检测pd-1蛋白表达水平变化。

本发明纯化得到的ascpf1突变体蛋白切割效率高，切割不需要复杂的tracrrna，操作方便，节约成本；发现了两个新的pd-1基因编辑位点；利用ascpf1突变体蛋白能够实现原代t细胞pd-1的敲降，为基因编辑t细胞pd-1基因及癌症免疫治疗打下基础。

附图说明

图1是重组表达载体pet15b-ascpf1(s589q/p711t)的质粒图谱；

图2是重组ascpf1(s589q/p711t)蛋白表达的sds-page分析：泳道m为蛋白marker(kd)，泳道1为iptg诱导前，泳道2和3为iptg诱导后ascpf1(s589q/p711t)的全菌蛋白表达；

图3是ni-ida柱纯化后的ascpf1(s589q/p711t)的sds-page(13％)分析：泳道1：超声上清；泳道2：流出；泳道3：50mm咪唑洗脱；泳道4：500mm咪唑洗脱1；泳道5：500mm咪唑洗脱2；泳道6：残留；泳道m为蛋白marker(kd)；

图4是cm柱纯化后的ascpf1(s589q/p711t)的sds-page(13％)分析：泳道1：ni-ida纯化ascpf1(s589q/p711t)；泳道2：cm流出；泳道3：cm洗脱1；泳道4：cm洗脱2；泳道5：cm洗脱3；泳道6：残留；泳道m为蛋白marker(kd)；

图5是纯化的ascpf1(s589q/p711t)与野生型ascpf1(wt)体外切割活性对比(体外切割贪铜菌copr基因片段)：

泳道m：dl2000；泳道1：copr+ascpf1(wt)；泳道2：copr+crrna；泳道3：copr+ascpf1(wt)+crrna；泳道4：copr+ascpf1(s589q)+crrna；泳道5：copr+ascpf1(p117t)+crrna；泳道6：copr+ascpf1(s589q/p711t)+crrna；

图6是纯化的ascpf1(s589q/p711t)体外切割pd-1：泳道m为dnamarker(dl2000)；泳道1：pd-1+ascpf1(s589q/p711t)；泳道2：pd-1+ascpf1(s589q/p711t)+crrna1；泳道3：pd-1+ascpf1(s589q/p711t)+crrna2；泳道4：pd-1+ascpf1(s589q/p711t)+crrna3；

图7是ascpf1(s589q/p711t)处理原代t细胞后，westernblotting检测pd-1表达水平：

泳道1：con组1(原代t细胞不经任何处理)；泳道2：con组2(原代t细胞+电击处理)；泳道3：con组3(原代t细胞+ascpf1(s589q/p711t)+电击处理)；泳道4：crrna1(原代t细胞+ascpf1(s589q/p711t)+crrna1+电击处理)；泳道5：crrna2(原代t细胞+ascpf1(s589q/p711t)+crrna2+电击处理)；泳道6：crrna3(原代t细胞+ascpf1(s589q/p711t)+crrna3+电击处理)。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对发明作进一步详细描述。

下述实例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：ascpf1的优化设计和合成

首先对野生型ascpf1的序列进行以下优化：

5’端加上穿膜肽tat编码序列，编码序列为tacggtcgtaaaaaacgtcgtcagcgtcgtcgt(seqidno：3)。

3’端加上核定位序列(nls)，编码序列为：aaaaggccggcggccacgaaaaaggccggccaggcaaaaaagaaaaagggatcc(seqidno：4)。

3’端加上6*his标签序列，编码序列为：catcatcatcatcatcac(seqidno：5)。

再将野生型ascpf1中的两个氨基酸位点突变：s598q和p711t。

密码子优化后ascpf1基因进行全基因合成，委托上海吉玛制药技术有限公司合成，命名为ascpf1(s589q/p711t)。合成的ascpf1(s589q/p711t)的核苷酸序列如seqidno：2所示。

实施例2：原核表达载体pet15b-ascpf1(s589q/p711t)的构建

以合成的ascpf1(s589q/p711t)基因组dna为模板，用pcr的方法扩增ascpf1(s589q/p711t)编码序列，设计的正向引物为：

5’-gtttaactttaagaaggagatataccatgtacggtcgtaaaaaacgtcgtcagcgtcgtcgtacacagttcgagggctttac-3’(seqidno：6)

反向引物为：

5’-tcgggctttgttagcagccggatcctcgagttagtgatgatgatgatgatgg-3’(seqidno：7)

pcr反应体系为：合成的ascpf1(s589q/p711t)模板50ng，正向引物(20μm)1μl，反向引物(20μm)1μl，2xultrapfumix25μl，加ddh2o至总体积50μl；

pcr扩增条件为：94℃热变性5分钟，60℃退火30秒，72℃延伸5分钟，共进行30个循环。

将得到的pcr产物进行纯化，用无缝克隆方法插入pet15b载体(购自novagen公司)的多克隆位点ncoi和xhoi之间，得到重组表达载体。对重组表达载体进行dna测序，分析其阅读框和编码序列的正确性。

将密码子优化的ascpf1(s589q/p711t)基因克隆至pet15b载体中，重组质粒经生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证，阅读框及dna序列全部正确，即成功构建了含重组ascpf1基因突变体的原核表达载体，命名为pet15b-ascpf1(s589q/p711t)，其简图参见图1。

实施例3：ascpf1突变体蛋白的表达及纯化

(1)ascpf1突变体蛋白的表达

分别将原核表达载体pet15b-ascpf(s589q/p711t)和对照载体pet15b转入表达宿主菌escherichiacolibl21(de3)(购自newenglandbiolabs公司)，挑取单克隆接种至新鲜的lb培养基(含50mg/l氨苄青霉素)。待细菌长至od600为0.6左右，分别加入终浓度为0.6mm的iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)诱导ascpf1(s589q/p711t)的表达。诱导两个小时后收集菌体，处理后的菌体蛋白样品经13％sds-page电泳，使用凝胶成像系统uvpwhite/ultraviolettransilluminator(购自美国upland公司)对考马斯亮蓝染色的凝胶进行扫描记录，采用专业分析软件grab-it2.5和gelwork分析目的蛋白占菌体总蛋白的比例。

本申请中，可溶性定义为：可溶性的目的蛋白/总的目的蛋白×100％。在iptg诱导后，出现了一条约为155kd的蛋白条带，和理论分子量大小吻合，经凝胶扫描灰度分析，ascpf1(s589q/p711t)蛋白约占菌体总蛋白的18％(图2)，可溶性达到95％。

(2)ascpf1突变体蛋白的纯化

收集一升发酵液的细胞，并用40ml冰浴的buffera(20mmtris-hcl，50mmnacl，1％triton-100，20％glycerolph7.5)重悬，冰浴超声裂解细胞，离心取上清，上清通过ni-ida柱；上样完毕用50mlbuffere(20mmtris-hclph7.5，2mnacl，0.1％tritonx-100，20％glycerol)洗涤ni-ida柱；50mlbufferg(20mmtris-hclph7.5，50mmnacl，0.1％tritonx-100，500mm咪唑，20％glycerol)洗脱ni-ida柱，分管收集；将洗脱到的目的蛋白过cm离子柱；100mlbufferd(20mmtris-hclph7.5，50mmnacl，0.1％tritonx-100，20％glycerol)洗涤cm离子柱；10mlbufferb(20mmtris-hclph7.5，50mmnacl，0.1％tritonx-100，20％glycerol)洗脱cm离子柱，分管收集。使用专业分析软件grab-it2.5分析tat-as-cpf1蛋白纯度为90％。洗脱的ascpf1(s589q/p711t)合并后将蛋白透析至20mmtris，50mmnaclph7.5，20％glycerol中。

ni-ida柱纯化后的ascpf1(s589q/p711t)的sds-page(13％)分析如图3所示；cm柱纯化后的ascpf1(s589q/p711t)的sds-page(13％)分析如图4所示。

实施例4：纯化的ascpf1突变体蛋白与野生型ascpf1(wt)切割活性对比

(1)copr基因序列扩增

采用常规方法从天然沥青中提取贪铜菌，并以提取的贪铜菌基因组dna为模板，pcr扩增并回收copr基因片段，pcr扩增所用正向引物为：

5’-atgaaattgctggtagtcgaaga-3’(seqidno：8)，反向引物为：5’-tcagtcgccttcctccggat-3’(seqidno：9)。pcr扩增体系为：基因组dna模板100ng，正向引物(20μm)1μl，反向引物(20μm)1μl，2xultrapfumix25μl，加ddh2o至总体积50μl；pcr反应条件为：94℃热变性10分钟，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共进行35个循环。pcr扩增产物回收，用于ascpf1(s589q/p711t)和野生型ascpf1(wt)体外切割实验。

(2)切割活性对比

取1μg回收的copr产物、1μl纯化的ascpf1突变体蛋白或者ascpf1(wt)、1μg合成的crrna、2μl10*reactionbuffer，配制成20μl体外切割反应体系，37℃水浴30min后，2％琼脂糖凝胶电泳检测切割；其中10*reactionbuffer的组成为：500mmkac、200mmtris-醋酸、100mmmg(ac)2、1mg/mlbsaph7.9@25℃。

其中crrna委托上海吉玛制药技术有限公司合成，其序列为：

5’-cgcgggccagcagttcggcaaaggatctacaacagtagaaattccctatagtgagtcgtattaatttc-3’(seqidno：10)

体外切割实验结果如图5所示，结果表明ascpf1突变体蛋白相较于野生型ascpf1(wt)，切割活性明显提高。

实施例5：ascpf1突变体蛋白编辑原代t细胞pd-1

(1)pd-1基因部分序列扩增

采用常规方法从人外周血中分离原代t细胞，并以提取的原代t细胞基因组dna为模板，pcr扩增并回收扩增片段，pcr扩增所用正向引物为：5’-actccccagacaggccctg-3’(seqidno：11)，反向引物为：5’-caggggctggccggtgcg-3’(seqidno：12)。pcr扩增体系：基因组dna模板100ng，正向引物(20μm)1μl，反向引物(20μm)1μl，2xultrapfumix25μl，加ddh2o至总体积50μl；pcr反应条件为：94℃热变性5分钟，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共进行30个循环。pcr扩增产物回收，用于ascpf1(s589q/p711t)体外切割实验。

(2)ascpf1(s589q/p711t)体外切割pd-1

取1μg回收的pd-1产物、1μl纯化的ascpf1(s589q/p711t)、1μg合成的crrna、2μl10*reactionbμffer，配制成20μl体外切割反应体系，37℃水浴30min后，2％琼脂糖凝胶电泳检测切割。其中10*reactionbμffer的组成为：500mmkac、200mmtris-醋酸、100mmmg(ac)2、1mg/mlbsaph7.9@25℃。

根据pd-1基因序列设计了3条靶向不同位点的crrna，委托上海吉玛制药技术有限公司合成：

crrna1：aauuucuacucuuguagaugcacgaagcucuccgauguguugg(seqidno：13)；

crrna2：aauuucuacucuuguagauaucugcgccuugggggccagggag(seqidno：14)；

crrna3：aauuucuacucuuguagaugaacuggccggcuggccuggguga(seqidno：15)；

使用纯化的ascpf1突变体蛋白对pd-1进行体外切割实验，实验结果如图6所示，结果表明3条crrna均可介导ascpf1(s589q/p711t)对pd-1进行切割，说明ascpf1(s589q/p711t)识别并切割pd-1效率高。

(3)westernblotting检测ascpf1突变体蛋白处理原代t细胞后，pd-1表达水平变化

取1×10⁶个原代t细胞pd-1，加入20μg纯化的ascpf1突变体蛋白，10μg合成的crrna混匀冰浴，电转化仪(bio-radmicropilser^tm)点击转化后铺6孔板，72h后提取蛋白westernblotting检测pd-1蛋白表达水平变化。

用设计合成的3条crrna分别对原代t细胞进行处理，westernblotting检测结果如图7所示，crrna2和crrna3处理原代t细胞后，pd-1蛋白表达水平明显降低，表明ascpf1突变体蛋白及设计的两条针对pd-1基因的靶向crrna能有效敲降原代t细胞pd-1的表达。

<110>江苏溥博生物科技有限公司

<120>一种ascpf1突变体蛋白、编码基因、重组表达载体及其制备方法与应用

<160>15

<210>1

<211>1342

<212>prt

<213>人工序列

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<223>

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