一种5‑羰基‑2‑戊烯酰基辅酶A还原酶突变体的制作方法

本发明涉及一种5-羰基-2-戊烯酰基辅酶a还原酶突变体，属于生物工程领域。

背景技术：

己二酸(adipicacid)又称肥酸，是一种重要的平台化合物，当前己二酸最重要的应用领域是合成尼龙类纤维(比如尼龙6,6)。预计到2018年，己二酸全球的市场价值将达到63亿美元。

工业上己二酸的生产路线主要通过硝酸对环己醇—环己酮的混合物(醇酮油，也称ka油)进行氧化制取。但是该方法具有工艺流程长、副产物多、产品收率低、工业“三废”排放严重等问题，特别是温室气体的排放量十分大。因此，人们迫切需要寻找一种能替代传统化学合成己二酸的方法。随着生物技术的发展，全生物合成法生产有机酸具有生产成本低，生产工艺简单，污染小，产品纯度高等优势，所以该方法越来越受人们青睐。近年来，许多国内外的研究机构投入了大量的资源对上述方法进行了深入的研究。总部位于美国genomatica公司和verdezyne公司是该研究领域的领跑者。

verdezyne公司通过研究发现，有些酵母在降解甘油三酯的程中能够积累己二酸。比如该公司利用椰子油(coconutoil)作为底物，利用酵母，将皂化后的脂肪酸经过一系列β氧化和ω氧化，成功积累了己二酸。由于该方法仅能以椰子油做底物，所并不适合在我国推广。

genomatica公司通过生物信息学和系统的方法，寻找到了多种可能利用糖质原料全生物合成己二酸的途径，并对其中两个代谢途径的可行性进了探讨，其中一个途径是3-氧代己二酸途径(3-oxoadipatepathway)，另一个是3-氧代己二酰辅酶a途径(3-oxoadipyl-coapathway)。经过计算，该公司认为以上两种途径在大肠杆菌中表达后都能达到92％的理论产率(以葡萄糖为底物)。

上海交通大学的钟建江教授研究团队发现了与3-氧代己二酰辅酶a途径类似的途径(如图1)，然后将不同来源的5种酶的基因，连接到质粒后导入大肠杆菌进行表达，从而获得己二酸的积累。本人所在团队对一株褐色嗜热裂孢菌(thermobifidafusca)进行代谢改造后，发现该工程菌株b6能够生产己二酸。本团队发现该菌生产己二酸的途径为3-氧代己二酰辅酶a途径(如图1)，包括：tfu_0875(β-酮硫解酶，β-ketothiolase)，tfu_2399(3-羟酰基-辅酶a脱氢酶，3-hydroxyacyl-coadehydrogenase)tfu_0067(3-羟基己二酰脱氢酶，3-hydroxyadipyl-coadehydrogenase)，tfu_1647(5-羧基-2-戊烯酰辅酶a还原酶，5-carboxy-2-pentenoyl-coareductase)以及tfu_2577和tfu_2576(succinyl-coasynthase，琥珀酰辅酶a合成酶)。将该途径的六种基因导入到大肠杆菌中，同样也获得了己二酸的积累。但是这两个途径都不能高效积累己二酸。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明以表达5-羰基-2-戊烯酰基辅酶a还原酶的基因tfu_1647为研究对象，通过discoverystudio(ds)对tfu-1647理性预测并进行定点突变，以提高目的产物己二酸的产量。

本发明的第一个目的是提供一种5-羰基-2-戊烯酰基辅酶a还原酶突变体，所述突变体相对于5-羰基-2-戊烯酰基辅酶a还原酶亲本，将第334位的谷氨酸突变为精氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述5-羰基-2-戊烯酰基辅酶a还原酶亲本的氨基酸序列如seqidno.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列如seqidno.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种编码上述突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供一种含有编码上述突变体核苷酸序列的重组质粒载体。

本发明的第四个目的是提供一种表达上述突变体的重组细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞还表达了氨基酸序列如seqidno.5所示的β-酮硫解酶，氨基酸序列如seqidno.6所示的3-羟酰基-辅酶a脱氢酶，氨基酸序列如seqidno.7所示的3-羟基己二酰脱氢酶，氨基酸序列如seqidno.8所示的琥珀酰辅酶a合成酶，以及氨基酸序列如seqidno.9所示的琥珀酰辅酶a合成酶。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞的构建方法是：

(1)设计定点突变所用引物，以携带5-羰基-2-戊烯酰基辅酶a还原酶亲本基因的载体为模板进行突变并构建含有突变体的质粒载体ptrc99a-0067-1647；其中质粒载体ptrc99a-0067-1647是指在质粒ptrc99a上连接氨基酸序列如seqidno.7所示的3-羟基己二酰脱氢酶的基因和氨基酸序列如seqidno.2所示的5-羰基-2-戊烯酰基辅酶a还原酶基因；

(2)将突变质粒转化进宿主细胞；

(3)将连接了氨基酸序列如seqidno.5所示的β-酮硫解酶基因和氨基酸序列如seqidno.6所示的3-羟酰基-辅酶a脱氢酶基因的质粒prsf-0875-2399转化进宿主细胞；

(4)将连接了氨基酸序列如seqidno.8所示的琥珀酰辅酶a合成酶基因和氨基酸序列如seqidno.9所示的琥珀酰辅酶a合成酶基因的质粒pcd-2576-2577转化进宿主细胞，最终得到重组细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。

本发明的第五个目的是提供一种上述突变体在生产己二酸中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是将含有权利要求1所述突变株的单菌落接入含有kan，amp，str三种抗生素的lb培养基中，35-38℃，200-250r/min摇床培养过夜，将该种子液以2-5％接种量接入到发酵培养基中，待菌体生长至od＝0.7左右，加入iptg诱导，然后转入28-32℃培养。

本发明有益效果

本发明对产己二酸代谢途径3-氧代己二酰辅酶a途径中的限速基因tfu_1647进行定点突变，得到一株己二酸产量提高的突变菌株。采用本发明的突变菌株发酵24h，己二酸产量由对照菌株的0.24g/l提高到1.01g/l，提高了近5倍。采用本发明的突变体，大大提高了己二酸产量，降低生产成本，促进己二酸在工业上的推广应用。

附图说明

图1：己二酸积累途径；

图2：model-1647的活性口袋；

图3：ptrc99a-0067-1647的质粒图谱；

图4：突变菌株的己二酸产量结果。

具体实施方式

实施例1：突变位点选择

同源建模

以5-羰基-2-戊烯酰基辅酶a还原酶(对应的基因为tfu-1647)的氨基酸序列seqidno.1为基础，利用swiss-model对5-羰基-2-戊烯酰基辅酶a还原酶进行同源建模，得到模型model-1647。

活性口袋及活性位点的预测

利用discoverystudio3.0对模型model-1647进行模拟，寻找活性口袋，如图2所示。

实施例2：突变体的构建

利用定点突变成功构建一个突变体e334r。

具体步骤如下：

(1)定点突变

以突变点为中心，突变点的前后各扩展15-20bp，设计序列如seqidno.3/seqidno.4所示的引物对6号-f:agtgatgtcgctatgaggattactactgatgccgtgca/6号-r:ggcatcagtagtaatcctcatagcgacatcactggcg。

以突变点为中心，以连接有亲本基因的质粒ptrc99a-0067-1647为模版(质粒图谱见图3)进行全质粒pcr(pcr的体系见表1)。其中连接有亲本基因的质粒ptrc99a-0067-1647是指在质粒ptrc99a上连接氨基酸序列如seqidno.7所示的3-羟基己二酰脱氢酶的基因和氨基酸序列如seqidno.1所示的5-羰基-2-戊烯酰基辅酶a还原酶亲本基因。

表1：质粒ptrc99a-0067-1647全质粒pcr的体系

其反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸2min，反应进行28个循环之后，72℃再延伸10min。

(2)pcr产物的纯化

用pcr纯化试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)对pcr产物进行纯化。首先，将pcr产物转移至干净的1.5ml的离心管中再用ddh2o补充至100μl，然后向里面加入5倍体积(500μl)的bufferb3，充分混匀，将混合液转移至全部转移至吸附柱，8000g离心30sec，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。向吸附柱中加入500μlwashsolution，9000g离心30sec，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，该步骤重复两次。然后将空吸附柱和收集管放入离心机，10000g离心2min，以除尽残余的乙醇。最后，在吸附膜的中央加入50℃预热的ddh2o40μl，室温静置2min，9000g离心1min。将得到的dna溶液于-20℃保存或直接用于后续实验。

(3)dpni酶消化pcr纯化产物

将纯化产物用dpni进行消化，其消化的体系见表2。

表2：消化pcr产物的体系

将该混合液加入200μl的离心管中，在涡旋器上震荡混匀，然后瞬时离心一下，置于37℃水浴锅中，保温2h。然后于-20℃保存或直接用于后续实验。

(4)质粒转化入jm109感受态细胞

将步骤(3)所得消化产物20μl加入到感受态jm109细胞中，混匀，置于冰上，冰浴30min以上后，42℃热激90sec，热激后迅速将其转移至冰上，继续冰浴3-5min，然后向其中加入800μl的lb培养基后置于37℃，220r/min的摇床上孵育。1h后3500g离心2min，弃去800μl上清，用剩余的液体将菌体悬浮起来，均匀地涂布在含50μg/mlamp的固体lb平板上，置37℃培养箱里培育过夜。

(5)突变质粒的提取

从上步中的平板上挑取单菌落，放入含50μg/mlamp的lb培养基里，37℃，220r/min的摇床上孵育10-16h，取菌液5ml，8000g离心2min，收集菌体，倒尽培养基，加入250μl的bufferp1，吹打悬浮菌体，然后加入250μl的bufferp2，立即温和地颠倒离心管10次混匀，静置2-4min，最后向离心管中再加入350μl的bufferp3，温和地颠倒离心管10次混匀。于离心机中12000g离心10min，将上清小心的转移至吸附柱，9000g离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。然后向吸附柱中加入500μl的去蛋白液bufferdw1，9000g离心30s，倒掉收集管中的液体，继续将吸附柱放入同一收集管中，向其中加入500μlwashsolution，9000g离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，该步骤重复两次。然后将空吸附柱和收集管放入离心机，10000g离心2min，以除尽残余的乙醇。最后，在吸附膜的中央加入50℃预热的ddh2o60μl，室温静置2min，9000g离心1min。将得到的dna溶液于-20℃保存或直接用于后续实验。

(6)导入大肠杆菌bl21(de3)的感受态细胞中

将突变质粒ptrc99a-0067-1647与该己二酸合成途径中的另外两个质粒prsf-0875-2399，pcd-2576-2577(质粒prsf-0875-2399是指在质粒prsf上连接了氨基酸序列如seqidno.5所示的β-酮硫解酶基因和氨基酸序列如seqidno.6所示的3-羟酰基-辅酶a脱氢酶基因；质粒pcd-2576-2577是指在质粒pcd上连接了氨基酸序列如seqidno.8所示的琥珀酰辅酶a合成酶基因和氨基酸序列如seqidno.9所示的琥珀酰辅酶a合成酶基因)各5μl加入到100μl的bl21(de3)感受态细胞中，混匀，置于冰上，冰浴30min以上后，42℃热激90sec，热激后迅速将其转移至冰上，继续冰浴3-5min，然后向其中加入800μl的lb培养基后置于37℃，220r/min的摇床上孵育。1h后3500g离心2min，弃去800μl上清，用剩余的液体将菌体悬浮起来，均匀地涂布在含kan，amp，str(浓度都为50μg/ml)的固体lb平板上，置37℃培养箱里培育过夜，得到表达突变体e334r的突变菌株，命名为突变菌株6号。

实施例3：突变体对己二酸积累的影响

发酵培养突变的重组菌

挑取实施例2中得到的表达突变体e334r的突变菌株6号的单菌落接入含有kan，amp，str(浓度都为50μg/ml)三种抗生素的lb培养基中，37℃，220r/min摇床培养过夜(种子液)，将该种子液以2％的比例接入到发酵培养基m9中(除m9中必含的盐外还包含1.5～2.5mmmgso4、0.08～0.12mmcacl2、50g/ml的kan，amp，str三种抗生素和4g/l的葡萄糖)，待菌体生长至od＝0.7左右，加入1m的iptg30ul诱导，然后转入30℃摇床培养。分别在诱导后10h，14h，18h，22h，26h，30h，34h，38h，42h，46h取样1.5ml，置于2ml的离心管中，-20℃保存或直接用于后续实验。

高效液相色谱检测发酵液

将发酵液于12000g离心5min，取上清，用0.22μm的滤膜过滤入液相瓶中，以5mm的硫酸为流动相，柱温为30℃，流速为0.6ml/min，检测己二酸的积累量。其中未进行突变的重组菌bl21(de3)prsf-0875-2399，ptrc99a-0067-1647，pcd-2576-2577按同样的方法处理，作为对照。

突变株与对照相比，发酵24小时，己二酸产量提高近5倍，对照的产量是0.24g/l，而突变菌株6号的产量为1.01g/l。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>江南大学

<120>一种5-羰基-2-戊烯酰基辅酶a还原酶突变体

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