用于鉴定桉树无性系的STR引物及其应用的制作方法

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及用于鉴定桉树无性系的str引物及其应用。

背景技术：

桉树是桃金娘科(myrtaceae)桉属(eucalyptus)树种的总称，是全球三大造林树种之一。桉树因其遗传多样性丰富、生长迅速、木材产量高和适应性强等特点，在华南地区广泛种植，为缓解我国木材供求紧张的局面发挥了重要的作用。

生产中桉树主要以无性系进行繁殖，随着无性系扩繁代数的增加、推广范围的扩大和流通市场的拓展，无性系混乱的问题日益严重，一些无性系名称在组培室和苗圃中被错误记录，市场上还存在以次充好、将表型相似的不良无性系作为优良无性系销售的现象，这极大地损害了种植者的效益。此外，一些单位将别人培育的无性系重新命名、据为己有，不利于知识产权的保护。因此，对桉树无性系进行鉴别尤为重要。

国际植物新品种保护联盟(upov,internationalunionfortheprotectionofnewvarietiesofplants)对无性系鉴定的传统方法包括：叶片形态、树皮纹理以及果实性状等一系列形态学以及其它的一些解剖学特征，不同人判定标准难以统一，极易造成鉴定不准确，影响生产。dna分子标记，尤其是短串联重复序列(shorttandemrepeat,str)具有多态信息含量高、共显性遗传、技术简单、重复性好、特异性强等特点，可以为某一品种提供独特的多态性信息，可以用于植物品种准确的检测和鉴定。目前dna分子标记已广泛应用于许多农作物的种质资源鉴定，桉树中也相继在不同无性系开展了一定的dna指纹图谱分析工作，但仍没有一套简单易行的str检测体系和常用桉树无性系的检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的是针对目前桉树无性系种植情况和现有鉴定方法的缺点与不足，提供一组用于鉴定桉树无性系的str引物，其可以在桉树常用无性系中进行快捷、方便鉴定的应用。本发明通过构建桉树无性系的分子鉴定体系，建立桉树无性系指纹图谱，能有效甄别假冒和错乱的无性系，切实保障良种培育人和营林种植者的权益，提高桉树商品林发展良种化程度。

本发明的第一个目的是提供用于鉴定桉树无性系的str引物。

本发明的用于鉴定桉树无性系的str引物，包括以下8对引物：

(1)eucessr0475引物：其正向引物如seqidno.1所示，其反向引物如seqidno.2所示；

(2)eucessr0204引物：其正向引物如seqidno.3所示，其反向引物如seqidno.4所示；

(3)eucessr419引物：其正向引物如seqidno.5所示，其反向引物如seqidno.6所示；

(4)eucessr1128引物：其正向引物如seqidno.7所示，其反向引物如seqidno.8所示；

(5)eucessr298引物：其正向引物如seqidno.9所示，其反向引物如seqidno.10所示；

(6)eucessr0176引物：其正向引物如seqidno.11所示，其反向引物如seqidno.12所示；

(7)eucessr181引物：其正向引物如seqidno.13所示，其反向引物如seqidno.14所示；

(8)eucessr304引物：其正向引物如seqidno.15所示，其反向引物如seqidno.16所示。

本发明的第二个目的是提供上述的用于鉴定桉树无性系的str引物在鉴定桉树无性系中的应用。

优选，所述的应用，包括以下步骤：

a.提取待测桉树dna；

b.以步骤a提取的桉树dna为模板，利用上述的鉴定桉树无性系的str引物进行多重pcr扩增，得到pcr产物；

(3)对pcr产物进行分型，与桉树无性系str指纹图谱进行比对，确定待测桉树的品种。

所述的步骤b中的多重pcr扩增，其反应体系为：

type-itmultiplexpcrmastermix(2x)5μl，rnase-freewater1μl，primers2μl，templatedna(30ng/μl)2μl；其中primers包含的各引物在反应体系中的终浓度为：eucessr0475的正向、反向引物各为0.17μm，eucessr0204的正向、反向引物各为0.05μm，eucessr419的正向、反向引物各为0.15μm，eucessr1128的正向、反向引物各为0.33μm，eucessr298的正向、反向引物各为0.19μm，eucessr0176的正向、反向引物各为0.06μm，eucessr181的正向、反向引物各为0.17μm，eucessr304的正向、反向引物各为0.87μm。

所述的步骤b中的多重pcr扩增，其反应程序为：

95℃预变性5min；95℃变性30s、60℃退火90s、72℃延伸30s，30个循环；60℃延伸30min；20℃保温。

本发明的优点在于：

(1)本发明通过大量的str标记(400余个)分型检测，筛选出了8对多态性高、扩增条带清晰的桉树str引物，并建立了多重荧光检测体系。该方法具有实验效率高、检测准确、操作方便等优势。可为今后快速进行桉树种质资源遗传评价、遗传图谱构建、分子标记辅助育种、无性系指纹图谱构建和鉴定提供重要的技术支撑。

(2)利用上述方法，构建了58个国内常用桉树无性系的指纹图谱，并成功的对上述无性系进行了鉴定。该方法可有效甄别假冒和错乱的无性系，切实保障良种培育人和营林种植者的权益。

附图说明

图1是str多重荧光检测体系对桉树无性系ll280、q9、z10-42和dh32-13的检测情况。

图2是58个桉树无性系基于8对str引物的遗传聚类图，其中桉树无性系guangzhou1与lh1为同一无性系。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

(1)桉树无性系dna的提取

收集桉树无性系(表1)叶片，利用ctab法提取桉树基因组dna，置于冰箱冷冻，以备使用。

表158份桉树无性系

秤好58份桉树无性系(表1)叶样0.3g左右，在液氮中研碎，转移至2ml离心管中，并加入1mlctab提取液，60～65℃保温45～60min左右，10min摇动一次。取出样品管，4℃、12000rpm离心10min，取上清液。加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，封口，摇匀；4℃、12000rpm离心10min，取上清液。加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)，12000rpm离心10min，取上清液。向上清液中加入冷藏的、2/3体积的异丙醇，轻轻晃动混匀，静置-20℃下1小时以上。12000rpm离心10min，倒掉上清液，加1ml70％和95％乙醇水溶液各洗一次，洗后将管倒置于卫生纸上吸干，真空浓缩仪中真空干燥5min左右。加入1×te110μl，沉淀浸泡5～10min，弹动或振荡以充分溶解dna。稍离心，溶液转入1.5ml离心管中，10000rpm离心5min，取上清液到另一1.5ml离心管。放-80℃长期保存。

所述的ctab提取液包括如下成分：100mmol/ltris-hcl(ph8.0)，20mmol/ledta(乙二胺四乙酸二钠)，l.4mol/lnacl，2％ctab(w/v)，2％pvp(聚乙烯毗咯烷酮)，1％β-琉基乙醇(每次提取之前混合均匀后使用)。所述的1×te包括如下成分：10mmol/ltris-hcl、1mmol/ledta，ph＝8.0。

(2)多重pcr扩增的str标记的位点选择

以本单位实验室开发的400余对ssr标记引物为引物、步骤(1)提取的dna为模板进行pcr扩增。pcr扩增体系为10μl，包括：1μl10×buffer(100mmtris-hclph9.0,80mm(nh4)2so4,100mmkcl，0.5％np-40)，2.0mm的mgcl2，25μm各dntp，0.5μm前向引物和后向引物，0.5utaq酶(上海申能博彩公司)，10pmol荧光-dutp(加拿大fermentas)，约20ngdna。pcr扩增在dnaengine扩增仪上进行(美国bio-rad)，扩增程序为：94℃4min；20次循环：94℃30s，70-60℃30s且每循环降低0.5℃，72℃1min；再26次循环：94℃30s，60℃30s，72℃1min；最后72℃10min。ssr标记的检测利用abi3130xl测序仪(美国appliedbiosystems)进行。1μlpcr产物与9.34μl超纯甲酰胺、0.16μl内标genescan500-liz(美国appliedbiosystems)混匀，95℃变性5min、立即冰上冷却。上机操作参考仪器说明，利用相应软件genemapper4.0(美国appliedbiosystems)进行标记检测与判读。

通过上述过程筛选多态性高、分型结果较好的str标记。共筛选出8对str引物，用于接下来的实验，分别为eucessr0475、eucessr0204、eucessr419、eucessr1128、eucessr298、eucessr0176、eucessr181和eucessr304引物，具体引物序列如表2所示(其正向引物、反向引物依次分别如seqidno.1-seqidno.16所示)。

(3)str引物对桉树无性系的检测

以步骤(2)筛选的str引物、结合str标记的片段大小设计合成不同的荧光引物，8对str引物在5'端所加的荧光依次为：eucessr0475-rox、eucessr0204-6-fam、eucessr419-tamra、eucessr1128-rox、eucessr298-tamra、eucessr0176-6-fam、eucessr181-hex、eucessr304-rox(如表2所示)。

表28对str引物序列及荧光标记情况

将str引物进行单基因座荧光引物扩增，扩增产物使用遗传分析仪检测样本峰面积，根据峰面积选择合成的引物浓度。复合扩增的引物浓度根据各个单扩增引物浓度进行进一步的调整。最后将所有标记整合在1次pcr和毛细管电泳中完成检测，即建立优化的str多重荧光检测体系，具体如下：

优化的str多重荧光检测体系中str引物终浓度情况详见表3，其中每个str引物对中的正向引物和反向引物终浓度相同；

表3str引物终浓度

扩增体系如表4所示；

表4扩增体系

pcr扩增程序为：

95℃预变性5min；95℃变性30s、60℃退火90s、72℃延伸30s，30个循环；60℃延伸30min；20℃保温。

以步骤(1)提取的dna为模板，按照上述优化后的str多重荧光检测体系，进行多重pcr扩增，得到pcr产物。

(4)多重pcr扩增产物的毛细管电泳检测

利用5色荧光matrix(6-fam、hex、tamra、rox，分子量内标为liz，无锡中德美联公司)对3130xl遗传分析仪进行光谱校正。取步骤(3)中获得的pcr产物1μl，加入到9.5μl缓冲液(9.34μl高纯甲酰胺+0.16μlgenescanliz500分子量内标)中混合均匀，在pcr仪上经95℃变性5min，4℃保存4min。变性后的pcr产物在abi3130xl遗传分析仪上进行基因分型。str多重荧光检测体系对部分桉树无性系的检测结果如图1所示。

(5)桉树无性系的指纹图谱

用genemapper4.0软件进行不同无性系的特征谱带分析，构建桉树无性系str指纹图谱(表4)，表4中，纯合位点的等位变异大小数据记录为x/x，其中x为该位点变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为x/y，其中x、y为该位点上两个不同的等位变异。小片段在前，大片段在后。利用ntsys-pcversion2.1构建无性系间的聚类图(图2)。图2中桉树无性系guangzhou1与lh1为同一无性系，其检测结果与实际一致。

表4桉树无性系str指纹图谱

(6)未知桉树无性系的检测

利用上述方法，提取待检测桉树无性系的基因组dna，进行多重荧光str标记的pcr扩增，将扩增产物利用遗传分析仪进行基因分型，获得该无性系相应位点的扩增情况，若检测结果与上述桉树无性系指纹图谱中的碱基大小(bp)完全一致，即获得该未知桉树无性系的品系名称。同时也可以对多个未知桉树无性系进行上述检测，根据分型结果确认样本间的亲缘关系。

序列表

<110>中国林业科学研究院热带林业研究所

<120>用于鉴定桉树无性系的str引物及其应用

<160>16

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gcaagcaaccgagttcaatg20

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

cgcttccaccgccatttt18

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tcttcttcgcctcgtcctcgca22

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

agccattcttgcggatggtgcc22

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

agcttttcttgagcaataggtc22

<210>6

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

tctcgaaacgacgaaccc18

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

ataataatgctggctttctg20

<210>8

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

ggtgcccatcttcttcct18

<210>9

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

atggctagagcagttggg18

<210>10

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

aatgagcagtctcgtcca18

<210>11

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

gatcgccgaatcggagca18

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

tcgcaattatcccccaacca20

<210>13

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

gcccgctgaagtgtttgt18

<210>14

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

tgtggtaggagggtttgg18

<210>15

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

gtccaaaggcagaagatg18

<210>16

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

caggaaagaaggatacgg18