用于扩增结核分枝杆菌耐药相关基因的引物对组合产品的制作方法

本发明涉及医学检验领域，具体而言，涉及一种用于扩增结核分枝杆菌耐药相关基因的引物对组合产品。

背景技术：

结核病(tuberculosis，tb)是由结核分枝杆菌感染引起的一种严重威胁人类健康的传染性疾病。目前结核病耐药形式严峻。据估计全球约20％的结核分枝杆菌分离株至少耐一种主要的抗结核药物，更严重的是耐多药结核病、广泛耐药结核病、甚至全耐药结核病也已经出现并日趋增多。我国是结核病高负担国家，耐药疫情也十分严峻。据统计，我国新发和复发结核病例中耐多药结核病分别占5.7％和25.6％，其中约8％为广泛耐药结核病病人，均高于全球平均水平。因此，耐药结核病的快速诊断成为我国的重大需求，而如何简单、方便地获得耐药相关基因成为耐药结核病分子诊断的关键基础环节。

研究发现，结核分枝杆菌耐药相关基因发生一些位点发生错义突变是导致结核病耐药的一个重要原因。已经明确的这些耐药相关基因主要包括：与利福平耐药相关的rpob基因，与异烟肼耐药相关的katg基因和inha，与乙胺丁醇耐药相关的embb基因，与吡嗪酰胺耐药相关的pnca基因，与喹诺酮类药物耐药相关的gyra基因，与链霉素耐药相关的rpsl基因，与卡那霉素和卷曲霉素耐药相关的rrs基因和eis基因。基于现代分子生物学技术的耐药基因突变检测技术可以快速检出病人体内结核分枝杆菌的耐药性，从而指导临床及时选择有效药物。而现代分子生物学技术的关键环节是这些耐药相关基因的简单、便捷和大量的获得，其中应用最广的是聚合酶链式反应(pcr)技术。

pcr技术是扩增并获得目的基因的应用最为广泛的实验技术，是目前分子检测的基础。但是单一pcr反应每次只能扩增一个基因，实际工作要完成上述多样本的九个耐药基因检测，工作量巨大。多重pcr(multiplexpcr)通过在同一反应体系里加入两对对以上的引物，可以在同一反应管中实现对多个核酸片段的扩增，在提高通量、保持高特异性和高敏感性的同时，能大大降低成本、节省标本，使分子生物学技术更加简单、快速和高效。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种引物对组合产品，所述的引物对组合产品可在两个多重pcr反应体系中扩增9个结核分枝杆菌耐药相关基因。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明涉及一种引物对组合产品，其选自如下引物对组合中的任一组或两组：

第一组，包括核苷酸序列分别如seqidno：1和2、seqidno：3和4、seqidno：5和6、seqidno：7和8、seqidno：9和10所示的引物对中的一对、多对或全部；

第二组，包括核苷酸序列分别如seqidno：11和12、seqidno：13和14、seqidno：15和16、seqidno：17和18所示的引物对中的一对、多对或全部；

其中，每种引物对单独放置，且每对引物对中的上游引物和下游引物单独或混合放置。

seqidno：1和2、seqidno：3和4、seqidno：5和6、seqidno：7和8、seqidno：9和10分别用于扩增embb、katg、rrs、rpob、maba/inha五个基因；

seqidno：11和12、seqidno：13和14、seqidno：15和16、seqidno：17和18分别用于pnca、eis、gyra、rpsl四个基因。

本发明针对目前比较明确的结核分枝杆菌耐药基因，设计并优化了引物序列，建立起针对上述九个基因的多重pcr反应体系。通过进一步评估其扩增临床分离株dna的效果，证明引物与反应体系的在实际使用中的有效性，成为进一步研发结核病耐药基因检测产品的基础。该多重pcr反应具有通量高(每管分别为5重和4重pcr)，组合合理(条带大小分明)，反应条件一致(9对引物使用同一条件)，产物分子数接近的特点。

本发明还涉及一种组合物，其含有如上所述引物对组合产品中的第一组。

所述组合物为将第一组中的引物的混合物，其可以为固体干粉状产品，也可以为混合溶液。

优选的，如上所述的组合物，序列如seqidno:1～10所示的引物之间的摩尔比依次为：1.0～1.4:1.0～1.4:0.6～1.0:0.6～1.0:0.4～0.8:0.4～0.8:1.0～1.4:1.0～1.4:0.4～0.8:0.4～0.8；

更优选的，序列如seqidno:1～10所示的引物之间的摩尔比依次为：1.1～1.3:1.1～1.3:0.7～0.9:0.7～0.9:0.5～0.7:0.5～0.7:1.1～1.3:1.1～1.3:0.5～0.7:0.5～0.7；

更优选的，序列如seqidno:1～10所示的引物之间的摩尔比依次为：1.2:1.2:0.8:0.8:0.6:0.6:1.2:1.2:0.6:0.6。

本发明还涉及一种组合物，其含有如上所述引物对组合产品中的第二组。

所述组合物为将第二组中的引物的混合物，其可以为固体干粉状产品，也可以为混合溶液。

优选的，如上所述的组合物，序列如seqidno:11～18所示的引物之间的摩尔比依次为：0.6～1.0:0.6～1.0:0.6～1.0:0.6～1.0:0.4～0.8:0.4～0.8:0.4～0.8:0.4～0.8；

更优选的，序列如seqidno:11～18所示的引物之间的摩尔比依次为：0.7～0.9:0.7～0.9:0.7～0.9:0.7～0.9:0.5～0.7:0.5～0.7:0.5～0.7:0.5～0.7；

更优选的，序列如seqidno:11～18所示的引物之间的摩尔比依次为：0.8:0.8:0.8:0.8:0.6:0.6:0.6:0.6。

本发明还涉及一种试剂盒，其包含如上所述的引物对和探针的组合产品；和/或；如上所述的组合物(第一组)；和/或；如上所述的组合物(第二组)；

所述试剂盒可以选自如上所述的引物对和探针的组合产品，但不含有上述的组合物(第一组和第二组)；

也可以不含有如上所述的引物对和探针的组合产品，而含有上述的组合物(第一组和/或第二组)；

所述试剂盒优选还包括pcr反应缓冲液、dna聚合酶、dntp、水、上样缓冲液以及dna分子量内标中的一种或多种。

优选的，如上所述的试剂盒，所述dna聚合酶选自taq、bst、vent、phi29、pfu、tru、tth、tl1、tac、tne、tma、tih、tf1、pwo、kod、sac、sso、poc、pab、mth、pho、es4dna聚合酶以及klenow片段中的任一种。

优选的，如上所述的试剂盒，所述水选自双蒸水或去离子水。

优选的，如上所述的试剂盒，所述上样缓冲液选自甲酰胺或去离子甲酰胺。

本发明还涉及如上所述的引物对组合产品、如上所述的组合物(第一组)、如上所述的组合物(第二组)或如上所述的试剂盒在制备用于结核分枝杆菌耐药性检测的试剂中的应用。

本发明还涉及使用如上所述的引物对组合产品、如上所述的组合物(第一组)、如上所述的组合物(第二组)或如上所述的试剂盒进行结核分枝杆菌耐药性检测的方法，所述方法包括以下步骤：(1)将制备好的dna模板与seqidno：1-18所示的引物(第一组或第二组分开进行)、pcr反应缓冲液、dntps、dna聚合酶和去离子水混匀，进行pcr反应；(2)电泳检测pcr扩增产物。

在一些实施方式中，所述dna模板通过饱和苯酚-氯仿法、树脂提取法或磁珠提取法提取。

在一些实施方式中，所述dna模板为含有dna的血滤纸片、唾液卡片或fta卡。

在一些实施方式中，在进行所述pcr反应时，各引物的退火温度均为60℃～64℃，优选61℃～63℃，更优选62℃。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明所提供的9对引物对可以在两个反应体系中就完成9种基因的扩增，从而可以快速、准确地根据检测结果进行结核分枝杆菌耐药相关基因的检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为九个目的基因扩增产物1％琼脂糖凝胶电泳图，从左到右各泳道依次为marker，katg、maba/inha、rpob、gyra、rrs、embb、rpsl、pnca、eis，marker；

图2为多重pcr(2管扩增9个目的基因)产物3.5％page胶电泳图；

a包含五对基因引物：embb、katg、rrs、rpob、maba/inha；b包含四对基因引物：pnca、eis、gyra、rpsl；m1marker，条带分别600/500/400/300/200/100bp；m2marker，条带分别2000/1000/750/500/250/100bp；

图3为多重pcr(2管扩增9个目的基因)产物3.5％page胶电泳图，经调整引物的含量，达到产物中多个基因分子数基本一致的目的；a包含五对基因引物：embb、katg、rrs、rpob、maba/inha；b包含四对基因引物：pnca、eis、gyra、rpsl；mmarker，条带分别600/500/400/300/200/100bp；

图4.为以临床分离株dna为模板的pcr产物2％琼脂糖凝胶电泳；

1-10为结核分枝杆菌临床分离株dna样本；a代表a管，包含5对基因引物(embb、katg、rrs、rpob和maba/inha)；b代表b管，包含4对引物(pnca、eis、gyra和rpsl)；m为dna分子量标准，条带从大至小分别为2000、1000、750、500、250和100bp。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例

一、材料与方法

1.菌株及痰标本来源：收集结核分枝杆菌临床分离株10株，所有样本来源于首都医科大学附属北京胸科医院。

2.10株临床分离株dna的提取：用te缓冲液(ph8.0，含tris-cl0.1mol/l，edta0.5mol/l重悬细菌，加入溶菌酶至5mg/ml，37℃过夜振荡消化，加入蛋白酶k至终浓度1mg/ml，加入10％sds至终浓度1％，37℃振荡1小时。用dna小量提取试剂盒(51304，qiagen公司)按操作说明提取菌株dna，溶解于适量无菌去离子水，用nanodrop2000(美国thermoscientific)进行定量检测后，贮存于-20℃。

3.耐药相关基因的引物设计及合成：采用primerpremier5.0软件设计和评价引物，委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行引物合成。

5.pcr扩增及测序：pcr扩增采用的taq酶购于北京康为世纪生物科技有限公司(cw0654a)，dntp购于天根生化科技(北京)有限公司(cd111-02)。由生工生物工程(上海)股份有限公司完成pcr产物的双向测序。

6.主要仪器：生物安全柜(nu-425-300e，美国nuaire公司)，基因扩增仪(mycycler，美国bio-rad公司)，凝胶成像系统(geldocxr，美国bio-rad公司)，核酸分析仪(nanodrop2000，美国thermo公司)

二、结果

1.耐药相关基因扩增所用引物序列

本发明选取目前发现的8个结核分枝杆菌耐药相关基因序列，分别为rpob、katg、maba/inha、embb、gyra、rpsl、rrs和eis，设计合成的引物序列见表1。

表1结核分枝杆菌耐药基因引物序列

注：f为上游引物，r为下游引物。

2.耐药基因扩增多重pcr体系的建立

本发明根据不同耐药基因扩增片段大小，尝试不同组合和扩增体系，最终通过优化可以实现利用两个多重pcr体系扩增9个耐药基因，扩增体系见表2。pcr扩增条件为：95℃10min，(95℃30s，62℃30s，72℃40s)×30个循环，72℃5min。2％琼脂糖凝胶电泳显示，9个条带对应基因大小与预期一致(图1)。

表2结核分枝杆菌耐药基因扩增多重pcr体系

注：管a包含5对基因引物：embb、pnca、eis、gyra、maba/inha；管b包含4对基因引物：rpob、katg、rpsl、rrs。a指管a中5条正义引物各0.8μl，b指管b中5条反义引物各0.8μl，c指管2中4条正义引物各0.8μl，d指管2中4条反义引物各0.8μl。

3.多重pcr体系中各基因引物量的调整

多重pcr反应产物以保证各产物(电泳条带)的分子数基本相同。为此，可以通过调整引物的量来实现。通过不断实验验证，我们最终确定管a包含5对基因引物量：embb的上下游引物量同为1.2μl、pnca上下游引物量同为0.8μl、eis上下游引物量同为0.8μl、gyra上下游引物量同为0.6μl、maba/inha上下游引物量同为0.6μl；管b包含4对基因引物量为：rpob上下游引物量同为1.2μl、katg上下游引物量同为0.8μl、rpsl上下游引物量同为0.6μl、rrs上下游引物量同为0.6μl(图3)。

4.优化后的多重pcr体系成功扩增临床分离株dna

提取10株结核分枝杆菌临床分离株dna，以菌株dna为模板、采用已建立的多重pcr体系进行扩增，结果10株的9个条带全部成功扩增(图4)，扩增成功率为100％。

三、讨论

本发明针对目前结核病治疗最常用的一线口服抗结核药(异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺)、注射类抗结核药物(链霉素、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素)和氟喹诺酮类药物，检索文献、选取较确切的9个耐药基因，合成引物，扩增包含常见突变位点的基因片段。其中rpob基因涉及利福平耐药，本实验扩增片段包含1123-1531区域内突变位点；katg基因和maba/inha操纵子启动子区涉及异烟肼耐药，扩增片段包含katg基因438-1072区域和maba/inha操纵子启动子区常见突变位点；embb基因涉及乙胺丁醇耐药，扩增片段包含852-1962区域内突变位点；rpsl基因涉及链霉素耐药，扩增片段包含目前发现的全部突变位点。rrs基因涉及链霉素、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素耐药，扩增片段包含1158位点后的所有突变位点；eis基因涉及卡那霉素耐药，扩增片段包含该基因启动子区内突变位点；gyra基因涉及氟喹诺酮类药物耐药，扩增片段包含-29-394区域内突变位点。另外，pnca基因突变是吡嗪酰胺耐药的主要机制，约85％吡嗪酰胺耐药菌株存在pnca突变。

我们采用两个多重pcr体系扩增9个包含常见突变位点的结核分枝杆菌耐药基因，以临床分离株提取的dna为模板时成功率为100％。虽然多重pcr能够同时扩增目的基因的数量理论上没有限制，但实践中常常因为多对引物同时存在容易产生非特异性扩增、扩增效率不同、扩增结果判读困难等原因而受到限制，因而在设计引物时要综合考虑引物的特异性、长度、退火温度等因素，并通过调整mg²⁺浓度、引物浓度等优化反应体系，以最终获得靶基因片段的有效扩增。本发明也曾尝试将9对引物放在一个多重pcr体系扩增，但干扰明显，无法实现对所有目的基因的扩增。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

sequencelisting

<110>首都医科大学附属北京胸科医院

<120>用于扩增结核分枝杆菌耐药相关基因的引物对组合产品

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