一种烟草腋芽生长调控基因NtMOC1及其克隆方法与应用与流程

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种烟草腋芽生长调控基因ntmoc1及其克隆方法与应用。

背景技术：

烟草（nicotianatabacum）是重要的经济作物，是茄科一年生草本植物。打顶抹芽是优质烤烟种植过程中一项重要的生产技术措施。烟株现蕾后，烟叶中大量营养物质流向生殖器官，导致烟叶产、质量下降，因此烟株生长后期必须及时打顶。而打顶后烟草腋芽会快速萌发，萌生的大量侧芽同样会降低烟叶的品质和产量。人工抹芽耗费人力和物力，提高了烟叶生产成本；打顶后施用化学药剂可抑制腋芽生长，但化学药剂需要成本，且会造成环境污染。因此寻求一种简单可行的抑制腋芽形成和生长的方法势在必行。以发现打顶后产生侧芽（腋芽）的相关基因为突破口，通过生物技术创建无侧芽、少侧芽或小侧芽的烟草，则有可能从根本上或大幅度解决上述问题，从而实现烟草生长量、烟叶品质、环保等方面均有较大提升。

ls、las、moc1为同源基因编码的转录因子，属于gras家族，过去的研究发现，ls、moc1基因的突变导致分枝/分蘖减少。我们对烟草ntmoc1基因也进行了理论研究和应用实践，发现抑制ntmoc1的表达在烟草打顶后具有抑制侧芽（腋芽）形成的功能。通过植物基因工程技术控制烟草腋芽形成，避免了烟株体内营养物质的无谓消耗，提高烟草品质，在烟草生产上具有重要意义。

国际上一些知名烟草公司和研究机构正采用生物技术对烟草无腋芽、少腋芽品种进行研究，以提高烟草品质，减少对烟草打顶后化学药剂的施用，以降低烟叶生产劳动强度、化学药剂成本和环境污染。目前，我国也提出了无腋芽优质烟的开发计划，为烟草无腋芽、少腋芽品种研究提供了契机。随着烟草无腋芽、少腋芽品种研究的深入，必将使我国烟草腋芽控制迈上新台阶，为我国烟叶的健康和可持续发展奠定基础。因此，开发一种调控腋芽生长的候选基因，通过基因操作减少烟草腋芽是非常必要的。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种烟草腋芽生长调控基因ntmoc1；第二目的在于提供所述的烟草腋芽生长调控基因ntmoc1的克隆方法；第三目的在于提供所述的烟草腋芽生长调控基因ntmoc1的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的烟草腋芽生长调控基因ntmoc1的核苷酸序列如seqidno：1所示。

本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：

a、确定ntmoc1基因序列；

根据水稻moc1基因的蛋白序列（genbank登录号xp_015642672.1），搜索ncbi数据库得到烟草中同源基因ntmoc1序列。利用此序列设计基因克隆引物：

正向引物：5’-ggtaccatgttaggatcctttggttc-3’；

反向引物：5’-ctcgagttaacgccaagaagatatgg-3’；

b、提取烟草根组织rna，反转录得到第一链cdna；

c、根据ntmoc1基因序列设计合成特异性引物，以反转录得到的第一链cdna作为模板，进行pcr扩增，选用phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μl，包括：200ngcdna，5×phusionhf反应缓冲液10μl，10mmdntp1μl，2u的phusion^®high-fidelitydnapolymerase，10μm的正反向引物各1μl，补水至50μl。pcr反应在mastercycler^®pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，55℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；回收和纯化pcr产物；

d、纯化产物与载体连接，通过试剂盒反应与topo载体连接，连接体系与过程如下：4μl纯化产物、1μlsaltsolution、1μlpcr^®-bluntⅱ-topo混匀，25℃，水浴30min；将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌dh5a，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/l卡那霉素的lb平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和pcr检测。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。

本发明的第三目的是这样实现的，所述的烟草腋芽生长调控基因ntmoc1在用于获得打顶后烟草产生腋芽的长度和重量显著降低的转基因植株中的应用。

本发明利用同源克隆技术从烟草中得到一个烟草腋芽生长调控基因ntmoc1，具体步骤为：根据水稻moc1基因的蛋白序列（genbank登录号xp_015642672.1），搜索ncbi数据库得到烟草中同源基因ntmoc1序列。利用此序列设计基因特异引物进行pcr反应，得到目的产物；对目的产物测序，得到ntmoc1基因序列；利用农杆菌介导的遗传转化方法获得ntmoc1基因的rnai植株，对ntmoc1进行功能验证，结果表明ntmoc1基因具有抑制烟草腋芽形成的功能。ntmoc1基因的发现，为通过调控基因的表达抑制打顶后烟草腋芽的形成提供了基因资源。

附图说明

图1为利用引物对ntmoc1-rnaif/ntmoc1-rnair扩增ntmoc1基因rnai片段结果，扩增产物约200bp，m:dl2，000，7:扩增产物；

图2为ptopo-ntmoc1质粒pcr电泳检测，扩增产物约200bp，m:dl2，000，11～15:扩增产物；

图3为kpni＋xhoi双酶切检测ptopo-ntmoc1质粒，产生两条片断约3.5kb和200bp，m:dl2，000，2～3:酶切产物；

图4为入门克隆pentr^tm2b-ntmoc1的构建，kpni＋xhoi双酶切检测pentr^tm2b-ntmoc1质粒，m:dl2，000，10～14:酶切产物；

图5为植物表达载体pk7gw1wg2-ntmoc1的构建；

其中，a为引物t35sf1/p35sr1质粒pcr检测pk7gw1wg2-ntmoc1，m:dl2，000，3:pk7gw1wg2-ntmoc1质粒pcr产物；b为引物intronf2/p35sr2质粒pcr检测pk7gw1wg2-ntmoc1，m:dl2，000，3:pk7gw1wg2-ntmoc1质粒pcr产物；

图6为菌落pcr检测农杆菌；m:dl2，000，19～20:扩增产物；

图7为ntmoc1t1代rnai株系基因表达水平分析；

图8为ntmoc1t1代rnai株系第1茎节腋芽长度；

图9为ntmoc1t1代rnai株系第1茎节腋芽重量。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的烟草腋芽生长调控基因ntmoc1的核苷酸序列如seqidno：1所示。

本发明所述的烟草腋芽生长调控基因ntmoc1的克隆方法，包括以下步骤：

a、确定ntmoc1基因序列；

根据水稻moc1基因的蛋白序列（genbank登录号xp_015642672.1），搜索ncbi数据库得到烟草中同源基因ntmoc1序列。利用此序列设计基因克隆引物：

正向引物：5’-ggtaccatgttaggatcctttggttc-3’；

反向引物：5’-ctcgagttaacgccaagaagatatgg-3’；

b、提取烟草根组织rna，反转录得到第一链cdna；

c、根据ntmoc1基因序列设计合成特异性引物，以反转录得到的第一链cdna作为模板，进行pcr扩增，选用phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μl，包括：200ngcdna，5×phusionhf反应缓冲液10μl，10mmdntp1μl，2u的phusion^®high-fidelitydnapolymerase，10μm的正反向引物各1μl，补水至50μl。pcr反应在mastercycler^®pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，55℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；回收和纯化pcr产物；

d、纯化产物与载体连接，通过试剂盒反应与topo载体连接，连接体系与过程如下：4μl纯化产物、1μlsaltsolution、1μlpcr^®-bluntⅱ-topo混匀，25℃，水浴30min；将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌dh5a，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/l卡那霉素的lb平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和pcr检测。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。

c步骤中所述的特异性引物为：

正向引物：5’-ggtaccatgttaggatcctttggttc-3’；

反向引物：5’-ctcgagttaacgccaagaagatatgg-3’。

d步骤中所述的培养基配方及制备方法是称取胰蛋白胨8~12g，酵母提取物5g，nacl10g溶解于1l蒸馏水中，121℃灭菌25min得到。

本发明所述的烟草腋芽生长调控基因ntmoc1的应用为所述的烟草腋芽生长调控基因ntmoc1在用于获得打顶后烟草产生腋芽的长度和重量显著降低的转基因植株中的应用。

所述获得的ntmoc1抑制表达的转基因烟草的方法包括以下步骤：

a、构建rnai载体：

a、以pcr^®-bluntii-topo载体为中间载体、pk7gw1wg2为表达载体骨架构建ntmoc1基因的rnai载体，构建引物为：

ntmoc1-rnaif:5’-ggtaccgctcttgaaagaccgcgaaa-3’

ntmoc1-rnair:5’-ctcgagctctctctactgctcggtgg-3’

ntmoc1-rnaif中ggtacc处为kpni酶切位点；ntmoc1-rnair中ctcgag处为xhoi酶切位点；

b、以ntmoc1阳性克隆topo质粒dna为模板进行pcr扩增，pcr反应体积为50μl，包括：200ngcdna，5×phusionhf反应缓冲液10μl，10mmdntp1μl，2u的phusion^®high-fidelitydnapolymerase，10μm的ntmoc1-rnaif引物、ntmoc1-rnair引物各1μl，补水至50μl。pcr反应在mastercycler^®pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，55℃，30秒，72℃，30秒，30个循环；72℃延伸7分钟；回收和纯化pcr产物；

c、回收目的片段产物与topo载体连接：通过试剂盒反应与topo载体连接。连接体系与过程如下：4μl纯化产物、1μlsaltsolution、1μlpcr®-bluntⅱ-topo混匀，25℃，水浴30min。将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌，添加培养基震荡培养后涂布至含100mg/l卡那霉素的lb平板上过夜培养。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序；

d、入门载体pentr^tm2b-ntmoc1rnai的构建：用上步测序对的topo质粒和pentr^tm2b空载体做酶切反应：kpni/xhoi双酶切topo质粒和pentr^tm2b-ccdb得到目的基因片段和载体片段pentr^tm2b，切胶回收后进行连接。连接反应如下：连接反应总体积为10μl，含酶切目的片段的切胶回收产物4μl，pentr^tm2b（kpni+xhoi双酶切）载体1μl，10×t4buffer1μl，t4ligase1μl，灭菌双蒸水3μl，混匀，室温反应2小时，转化大肠杆菌感受态细胞，添加培养基震荡培养后涂布至含100mg/l卡那霉素的lb平板上过夜培养，提取质粒进行pcr检测和酶切检测，以验证含目的基因片段的入门载体是否构建成功。

e、通过lr反应得到植物表达载体：挑选检测正确的入门载体与植物表达载体pk7gw1wg2(destinationclone)进行lr反应，具体反应如下：

反应体系：构建成功的入门载体(50-150ng)1-7μl，0.5μldestinationvector，tebuffer至总体积8μl；

1）上述体系混匀，冰浴2min，轻弹2次；

2）加入2μllrcloneasetmⅱenzymemix，轻弹，混匀，离心，25℃水浴1h；

3）加入1μlproteinasek轻弹，混匀，37℃水浴10min；

通过热激转化大肠杆菌，加入培养基震荡培养后涂布至含100mg/l壮观霉素的lb平板上过夜培养，挑菌提质粒后，以载体质粒dna为模板，使用两对引物（t35sf1/p35sr1、intronf2/p35sr2）进行pcr检测，使用lataq体系进行扩增，反应体系包括：200ng质粒dna，10×la反应缓冲液5μl，10mmdntp1μl，2u的lataqdnapolymerase，10μm正反向引物各1μl，补水至50μl，pcr反应在mastercycler^®pro扩增仪上进行，反应程序为：94℃，5分钟；94℃，30秒，55℃，30秒，72℃，2分钟，35个循环；72℃延伸7分钟；检测重组质粒的正确性，理论上由t35sf1/p35sr1引物扩增的片段大小为1.7kb，由intronf2/p35sr2引物扩增的片段大小为750bp，同时满足两个条件，则表明表达载体构建成功，进一步对构建正确的表达载体进行测序验证；

b、农杆菌转化：

从-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞，放置冰上溶解后加入重组表达载体pk7g-ntmoc14μl；液氮速冻1分钟，转入37℃水浴5分钟，再冰浴2分钟，向混合物中加入1mllb液体培养基，28℃、220rpm培养3~4小时；培养物涂布于含有壮观霉素100mg/l和利福平25mg/l的lb固体培养基上，28℃倒置培养2~3天，可见含有目标载体的农杆菌克隆;

c、rnai载体导入烟草、培养转基因植株：

a、挑取含有目标载体的农杆菌克隆，在含有壮观霉素和利福平的lb平板上划线，28℃培养2~3天；刮取划线菌斑接菌于含有壮观霉素和利福平的ms培养基中，28℃，220rpm震荡培养，菌液浓度达到od=0.5~0.8时进行侵染；

b、将烟草叶片置于500ml广口瓶中，加入适量75%乙醇，漂洗1min；弃乙醇，加入0.1%的hgcl2溶液，置摇床上室温振荡15~30分钟；弃溶液，用无菌水冲洗6遍；

c、将烟草叶片取出，用无菌吸水纸洗去表面液体，取无菌叶片用剪刀切成1cm×1cm的小片，将切成小片的烟草叶片放入含目标载体的无菌ms液体培养基悬浮菌液中，静置15~20min；取出烟草叶片，用无菌滤纸吸去多余菌液，于含有6-ba（0.02mg/l）、naa（2mg/l）的ms培养基中25℃暗培养两天；将烟草叶片转入分化培养基中，切口接触培养基，分化培养基为含有6-ba（0.5mg/l）、naa（0.1mg/l）、卡那霉素(100mg/l)、头孢霉素(500mg/l)的ms培养基，每2~3周继代一次，切口处逐渐形成愈伤组织，最后分化出芽；

d、将长至3~5cm的芽切下，转入ms培养基诱导生根，生根后的转基因植株由生根培养基中取出，用自来水洗净培养基，移植于灭菌的营养土中；

e、转基因植株经nptii基因特异引物进行pcr验证，鉴定转基因阳性植株。

c步骤b中所述的0.1%的hgcl2溶液配制方法为称取升汞0.1克，用酒精溶解，再加水定容至100毫升。

下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：

实施例1——ntmoc1基因的分离克隆

根据水稻moc1基因的蛋白序列（genbank登录号xp_015642672.1），搜索ncbi数据库得到烟草中同源基因ntmoc1序列。利用此序列设计该基因rnai片段扩增引物，进行pcr反应，得到目的产物；对目的产物测序，得到ntmoc1基因序列；其核苷酸序列如seqidno.1所示。

提取云烟87根部rna，抽提使用trizol试剂盒（invitrogen,按该试剂盒提供的说明书操作）。

取2μgrna进行反转录，利用primescript^tmrtreagentkitwithgdnaeraser（takara）试剂盒进行基因组dna去除并反转录（按试剂盒操作手册操作）。

将反转录得到的第一链cdna作为模板，用于pcr扩增ntmoc1基因全长，并设计特异性引物如下：

正向引物：5’-ggtaccatgttaggatcctttggttc-3’；

反向引物：5’-ctcgagttaacgccaagaagatatgg-3’；

pcr反应体系为50μl，包括：200ngcdna，5×phusionhf反应缓冲液10μl，10mmdntp1μl，2u的phusion^®high-fidelitydnapolymerase，10um上述引物各1μl，补水至50μl。pcr反应在mastercycler^®pro（eppendorf，德国）扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，55℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟。

产物经1%（g/ml）的琼脂糖凝胶电泳分离，扩增结果产生一条单一pcr条带，见图1。用qiaquickgelextractionkit（qiagen，德国）回收扩增条带，提取步骤参照试剂盒使用说明。回收纯化的dna与topo载体（invitrogenzerobluntii-topo-pcrcloningkit）连接，按说明书操作。连接产物利用热激法转化大肠杆菌dh5a，在含有100mg/l卡那霉素的lb固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个克隆测序（大连宝生物工程有限公司）。

测序结果表明该基因的核苷酸序列为seqidno：1所示，通过测序、比对确定是本发明需要的目的基因，申请人将该基因命名为ntmoc1。ntmoc1基因包括1191bp的开放阅读框。

实施例2——抑制表达（rnai）载体构建

a、以pcr^®-bluntii-topo载体为中间载体、pk7gw1wg2为表达载体骨架构建ntmoc1基因的rnai载体，构建引物为：

ntmoc1-rnaif:5’-ggtaccgctcttgaaagaccgcgaaa-3’，

ntmoc1-rnair:5’-ctcgagctctctctactgctcggtgg-3’，

ntmoc1-rnaif中ggatcc处为kpni酶切位点；ntmoc1-rnair中ctcgag处为xhoi酶切位点；

b、以ntmoc1阳性克隆topo质粒dna为模板进行pcr扩增，pcr反应体积为50μl，包括：200ngcdna，5×phusionhf反应缓冲液10μl，10mmdntp1μl，2u的phusion^®high-fidelitydnapolymerase，10μm的ntmoc1-rnaif引物、ntmoc1-rnair引物各1μl，补水至50μl。pcr反应在mastercycler^®pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，55℃，30秒，72℃，30秒，30个循环；72℃延伸7分钟；回收和纯化pcr产物；

c、回收目的片段产物与topo载体连接：通过试剂盒反应与topo载体连接。连接体系与过程如下：4μl纯化产物、1μlsaltsolution、1μlpcr®-bluntⅱ-topo混匀，25℃，水浴30min。将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌，添加培养基震荡培养后涂布至含100mg/l卡那霉素的lb平板上过夜培养。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序；

d、入门克隆pentr^tm2b-ntmoc1rnai的构建：用上步测序对的topo质粒和pentr^tm2b空载体做酶切反应：kpni+xhoi双酶切topo质粒和pentr^tm2b-ccdb得到目的基因片段和载体片段pentr^tm2b，切胶回收后进行连接。连接反应如下：连接反应总体积为10μl，含酶切目的片段的切胶回收产物4μl，pentr^tm2b（kpni+xhoi双酶切）载体1μl，10×t4buffer1μl，t4ligase1μl，灭菌双蒸水3μl，混匀，室温反应2小时，转化大肠杆菌感受态细胞，添加培养基震荡培养后涂布至含100mg/l卡那霉素的lb平板上过夜培养，提取质粒进行pcr检测和酶切检测，以验证含目的基因片段的入门载体是否构建成功。

e、通过lr反应得到植物表达载体：挑选检测正确的入门载体与植物表达载体pk7gw1wg2(destinationclone)进行lr反应，具体反应如下：

反应体系：构建成功的入门载体(50-150ng)1-7μl，0.5μldestinationvector，tebuffer(至总体积8μl)。

1）上述体系混匀，冰浴2min，轻弹2次。

2）加入2μllrcloneasetmⅱenzymemix，轻弹，混匀，离心，25℃水浴1h。

3）加入1μlproteinasek轻弹，混匀，37℃水浴10min。

通过热激转化大肠杆菌，加入培养基震荡培养后涂布在含100mg/l壮观霉素的lb平板上。挑菌提质粒后，以载体质粒为模板，使用两对引物（t35sf1/p35sr1、intronf2/p35sr2）进行pcr检测，使用lataq体系进行扩增，反应体系包括：200ng质粒dna，10×la反应缓冲液5μl，10mmdntp1μl，2u的lataqdnapolymerase，10μm正反向引物各1μl，补水至50μl。pcr反应在mastercycler^®pro扩增仪上进行，反应程序为：94℃，5分钟；94℃，30秒，55℃，30秒，72℃，2分钟，35个循环；72℃延伸7分钟；检测重组质粒的正确性，理论上由t35sf1/p35sr1引物扩增的片段大小为1.7kb，由intronf2/p35sr2引物扩增的片段大小为750bp，同时满足两个条件，则表明表达载体构建成功，进一步对构建正确的表达载体进行测序验证。

实施例3——烟草的遗传转化

（1）表达载体转化农杆菌

从-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞，放置冰上溶解后加入重组表达载体pk7g-ntmoc14μl；液氮速冻1分钟，转入37℃水浴5分钟，再冰浴2分钟，向混合物中加入1mllb液体培养基，28℃、220rpm培养3~4小时；培养物涂布于含有壮观霉素100mg/l和利福平25mg/l的lb固体培养基上，28℃倒置培养2~3天，可见含有目的载体的农杆菌克隆；

（2）烟草转化

a、挑取含有目标载体的农杆菌克隆，在含有壮观霉素和利福平的lb平板上划线，28℃培养2~3天；刮取划线菌斑接菌于含有壮观霉素和利福平的ms培养基中，28℃，220rpm震荡培养，菌液浓度达到od=0.5~0.8时进行侵染；

b、将烟草叶片置于500ml广口瓶中，加入适量75%乙醇，漂洗1min；弃乙醇，加入0.1%的hgcl2溶液，置摇床上室温振荡15~30分钟；弃溶液，用无菌水冲洗6遍；

c、将烟草叶片取出，用无菌吸水纸洗去表面液体，取无菌叶片用剪刀切成1cm×1cm的小片，将切成小片的烟草叶片放入含目标载体的无菌ms液体培养基悬浮菌液中，静置15~20min；取出烟草叶片，用无菌滤纸吸去多余菌液，于含有6-ba（0.02mg/l）、naa（2mg/l）的ms培养基中25℃暗培养两天；将烟草叶片转入分化培养基中，切口接触培养基，分化培养基为含有6-ba（0.5mg/l）、naa（0.1mg/l）、卡那霉素(100mg/l)、头孢霉素(500mg/l)的ms培养基，每2~3周继代一次，切口处逐渐形成愈伤组织，最后分化出芽；

d、将长至3~5cm的芽切下，转入ms培养基诱导生根，生根后的转基因植株由生根培养基中取出，用自来水洗净培养基，移植于灭菌的营养土中；

e、转基因植株经nptii基因特异引物进行pcr验证，鉴定转基因阳性植株。

实施例4——转基因植株分析

t1代转基因株系提总rna，利用takara公司的primescript^tmrtreagentkit反转录合成cdna作为模板进行实时荧光定量pcr分析，获得目标基因表达显著降低的rnai株系（图6）。打顶前观察转基因株系和对照，腋芽生长均不明显，打顶16天后，ntmoc1基因表达受到显著抑制的2个株系中，第1茎节处腋芽长度、重量比对照显著降低（图7、8），表明ntmoc1基因正向调控腋芽形成。

sequencelisting

<110>云南省烟草农业科学研究院

<120>一种烟草腋芽生长调控基因ntmoc1及其克隆方法与应用

<130>2017

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>210

<212>dna

<213>ntmoc1rnai片段的核苷酸序列

<400>1

gctcttgaaagaccgcgaaaagttaaggatttttttgcataggattaaatccatgaaccc60

taaagttgtaacgctggccgagagagaagcaaatcataatcacccactttttttgcaaag120

atttgtggaggctttggattattatgcagctgtgtttgattcattggaagcaactttgcc180

accgagcagtagagagag198

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>正向引物

<400>2

ggtaccatgttaggatcctttggttc26

<210>3

<211>26

<212>dna

<213>反向引物

<400>3

ctcgagttaacgccaagaagatatgg26