一种烟草抗旱基因NtSAP5及其克隆方法与应用与流程

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种烟草抗旱基因ntsap5及其克隆方法与应用。

背景技术：

干旱严重影响作物的生长发育、产量及品质。提高植物的抗旱能力已经成为现代植物研究工作中的关键问题之一。抗旱机理的研究是抗旱育种的基础，也是育种的关键因素之一。经历了几十年的努力，对植物抗旱的研究已从抗旱指标的表观因素分析，进入到分子及基因水平的探索。

近年来，随着全球气候变暖，干旱已成为我国作物生产中频繁发生的自然灾害。烟草作为中国重要的经济作物，在整个生育期对水分的要求很高。中国大部分烟区处于干旱、半干旱环境中，而且优质烟区多位于丘陵山区，常因土壤干旱而影响烟株的生长发育，导致烟叶的产量和品质降低，干旱已成为制约我国烟叶产量与品质提高的主要限制因子之一。因此，加强烟草抗旱基因资源的挖掘和利用，对于烟草抗旱新品种培育，实现烟草农业可持续发展具有重大意义。

自20世纪80年代以来，国内外学者在干旱对烟草生长、发育、代谢的影响等方面做了大量研究，取得了一些重要进展。归纳起来主要有以下几个方面:第一，干旱对烟草生理的影响，主要表现在:(1)干旱胁迫影响了叶绿素的合成，促进了叶绿素的分解，从而影响了叶片的光合效率(plantmolecularbiology，1979，20:37-44)；(2)干旱胁迫导致植株氮素代谢关键酶-硝酸还原酶(nr)的活性降低，而蛋白水解酶活性增强引起脯氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和缬氨酸等大量积累；(3)干旱胁迫导致叶片膜脂过氧化作用增强，膜透性增加，丙二醛(mda)含量升高，出现电解质外渗。抗氧化保护酶s0d、p0d、cat等酶活性显著下降。第二，干旱对烟草生长发育的影响，主要表现在:(i)干旱胁迫降低了种子的萌发和幼苗的成活；(2)抑制了根系的生长，从而影响了矿质营养的吸收；(3)干旱胁迫导致植株矮小，节间短，叶片小，易早衰。这些研究较好地阐明了干旱对烟草生长、发育及代谢影响的生理生化基础，但缺乏对烟草抗旱分子遗传机理的研究。

近年来，随着分子生物学和基因组学研究的深入，抗旱基因的发掘成为目前作物抗逆遗传资源与品种改良研究的热点，越来越多的抗旱相关基因相继被克隆和鉴定。按照抗旱基因的功能，可以把植物抗旱相关基因分为两大类:第一类基因为功能基因，主要在植物抗性中起保护作用。这一类基因主要包括渗透调苄基因如:海藻糖合成酶基因tpsljf氨酸合成酶基因p5cs、甘露醇合成基因mtld、甜菜碱合成酶级以内badh、及多按合成基因odc等；保护生物大分子的活性基因如:脱水蛋白基因bdn1、水通道蛋白基因aqp和晚期胚胎发生丰富蛋白lea等。第二类基因为调苄基因，主要在信号传导和逆境基因表达过程中起调节作用，主要包括一些转录因子基因如:dreb、myb、bzip、wrky、nac等。这些基因已在植物基因工程中得到应用。

泛素化生物体表观遗传修饰的一种重要形式，该过程能够使生物体内蛋白发生泛素化，泛素化的蛋白能够被降解。泛素连接酶e3是泛素化过程中的关键酶类，决定了那些蛋白能够被泛素化。泛素化在植物激素调控、花发育和病原菌防卫反应中起着重要的作用(plantj,2010,61:1029-1040；jexpbot，2007，58:221-227)。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种烟草抗旱基因ntsap5；第二目的在于提供所述的烟草抗旱基因ntsap5的克隆方法，第三目的在于提供所述的烟草抗旱基因ntsap5的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的烟草抗旱基因ntsap5的核苷酸序列如seqidno：1所示。

本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：

a、烟草叶片cdna合成：提取烟草叶片总rna，反转录得到第一链cdna；

b、ntsap5基因的pcr扩增：以烟草叶片cdna为模板，根据ntsap5基因序列设计引物，进行pcr扩增，回收和纯化pcr扩增产物，并测序。

本发明的第三目的是这样实现的，所述的烟草抗旱基因ntsap5在获得抗干旱转基因烟草植株中的应用。

本发明提供了一种新的植物抗旱相关蛋白及其编码基因。

本发明所提供的植物抗旱相关蛋白，名称为ntsap5，其来源于云烟87栽培烟草，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的seqidno：2；

2)将序列表中seqidno：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱相关的蛋白质。

序列表中的序列2由154个氨基酸组成。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

ntsap5的编码基因(ntsap5)也属于本发明的保护范围。

ntsap5的编码基因，可具有下述核苷酸序列之一：1)序列表中seqidno：1的dna序列；2)编码序列表中seqidno：2蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中seqidno：1限定的dna序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中seqidno：1限定的dna序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna序列。

含有本发明ntsap5的表达载体，细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增ntsap5中任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了利用该基因增强植物抗旱性的方法，是在植物中过量表达上述植物抗旱性相关蛋白编码基因。

过量表达上述植物抗旱性相关蛋白编码基因ntsap5可通过多种方法实现，如植物病毒载体介导基因过表达的方法，农杆菌介导转化过表达载体，对基因编码匡进行优化修改，对该基因启动子进行优化以达到过表达效果等方法实现。本发明过量表达基因的方法并不限于上述几种方法，只要能过量表达ntsap5即可。

利用任何基因过表达或者基因修饰方法该ntsap5使植物表现为抗旱；利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的ntsap5转入植物中，植物就表现出干旱不敏感。

本发明的ntsap5基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(gus基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以植物苗期叶片失水程度来筛选转化植株。携带有本发明ntsap5基因的表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。

本发明的植物抗旱相关蛋白及其编码基因为农作物尤其是烟草抗旱育种提供基因与技术的支持。

本发明中，干旱处理的烟草幼苗叶片中，所述的泛素e3连接酶编码基因ntsap5被诱导表达。本发明所述的蛋白ntsap5是植物泛素化蛋白降解途径中的关键酶类，所以调控ntsap5的表达能够调节植物对干旱的抗性。因此所述的干旱响应的基因ntsap5在植物抗旱领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。

附图说明

图1为本发明烟草叶片中ntsap5基因响应干旱胁迫柱状图；

图2为ntsap5的pcr产物电泳图；

图3为pdonr-zeo载体图；

图4为ntsap5基因植物表达载体pb2gw7图；

图5为转ntsap5基因的烟草株系表达水平柱状图；

图6为ntsap5基因过量表达的烟草植株对干旱胁迫处理的生长表型照片。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的烟草抗旱基因ntsap5的核苷酸序列如seqidno：1所示。

所述的烟草抗旱基因ntsap5编码的氨基酸序列如seqidno：2所示。

本发明所述的烟草抗旱基因ntsap5的克隆方法，包括以下步骤：

a、烟草叶片cdna合成：提取烟草叶片总rna，反转录得到第一链cdna；

b、ntsap5基因的pcr扩增：以烟草叶片cdna为模板，根据ntsap5基因序列设计引物，进行pcr扩增，回收和纯化pcr扩增产物，并测序。

b步骤中所述的引物为：

正向引物：5’-atggctcagagaacagagaaag-3’

反向引物：5’-tcaaagtttaacgatcttcg-3’。

b步骤中所述的pcr反应体系和扩增条件如下：

b步骤中所述的测序的具体操作为送交invitrogen公司进行测序。

b步骤中所述的回收和纯化pcr扩增产物的具体操作如下：

所述的回收和纯化pcr扩增产物的具体操作如下：凝胶电泳后，用干净的刀片将带有目的片段的胶切割下来，放入到离心管中，胶不要切得过大，以避免回收时dna片段溶液含有大量的杂质；向离心管中加入3倍体积的qg溶液后，在50℃条件下温浴10min，直到胶完全融化；将离心管中的溶液移到2ml的吸附柱中，离心1min，弃去液相；再次向吸附柱中加入0.5ml的qg溶液，离心1min，弃去液相；向吸附柱加入0.75ml的pe溶液，离心1min，弃去液相；再次离心1min后，将吸附柱放置在一个新的离心管上，加入50μl的溶解液，静置1min，最后离心1min，得到的液相即为回收的dna溶液。

本发明所述的烟草抗旱基因ntsap5的应用为所述的烟草抗旱基因ntsap5在获得抗干旱转基因烟草植株中的应用。

下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：

实施例1

云烟87种子播种到花盆中，在温度为26-28°c、湿度为60%、光暗交替周期为16h/8h的光照培养室中培养。待幼苗长至约5-6片叶片时，进行干旱处理。处理的时间分别为0.5小时、2小时；以未做胁迫处理的烟草幼苗作为对照组，采取对照及处理的烟草叶片材料进行高通量rna-seq。其中ntsap5作为e3连接酶在干旱处理0.5小时的时候上调显著，两小时后表达量下调（图1）。

实施例2

ntsap5基因的克隆

1.烟草叶片cdna合成

采用trizol(invitrogen，usa)试剂提取烟草叶片总rna，将烟草叶片总rna定量1μg于1.5ml离心管中，按照invitrogen公司的rna提取试剂盒产品说明进行反转录,最终获得烟草叶片cdna。、

2.ntsap5基因的pcr扩增

以烟草叶片cdna为模板，根据烟草基因组数据库信息设计引物，进行ntsap5基因的pcr扩增，得到pcr扩增产物。

引物为

将扩增获得的pcr产物在0.8%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳结果为(如图2所示)，获得471bp大小的片段。

电泳结束后，采用qiagen公司pcr产物纯化试剂盒，按照产品说明回收纯化所述的pcr产物，并送invitrogen测序，验证序列结果，结果表明该序列与基因组数据库中数据完全相同。

实施例3

ntsap5基因转化烟草及转基因植株检测

1、植物表达载体的构建

以实施例2中ntsap5全长片段为模板，用含有gateway接头序列的引物进行pcr扩增，扩增产物经pcr产物纯化后，经过bp反应插入到invitrogen公司pdonr-zeo载体中。将构建好的bp反应载体通过lr反应将ntsap5片段置换到pb2gw7载体中。

gateway反应引物序列如下:

2、农杆菌介导的烟草转化及转基因植株的鉴定

将经过pcr反应及测序，鉴定正确的重组质粒利用冻融法转化农杆菌lba4404，通过菌落pcr确定阳性农杆菌菌株，利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草品种云烟87。

具体方法如下:

(1)无菌条件下，将烟草种子放入ep管中用无菌水冲洗2-3次；

(2)于75%的酒精中浸泡30-60sec；

(3)再用0.1%的升汞处理5min，最后用无菌水冲洗5次；

(4)播种于ms培养基上，培养在云南烟草农业科学研究院组织培养室中，暗培养4天。25℃光照培养20-30天；

(5)待烟草苗长至3-5cm时（20-30天），取顶芽放于ms+ba0.2mg/l（壮芽，使其快速成长）培养基上，继代培养；

(6)继代培养14天后（有小叶片即可），取叶片，大小1cmx1cm，切去叶柄，叶片表面及叶边缘划伤，放入ms+ba1.0mg/lph6.0-6.5的预培养培养基上，正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗条件下预培养2-3天；

(7)然后取出预培养的叶片或茎段，放入侵染液中进行侵染。侵染前一天晚上，摇菌农杆菌2瓶。将2ml离心管装满菌液，4000rpm离心5min，用悬菌液清洗两次。以1:10比例（10ml悬菌液放1管1.5ml菌体）放入悬菌液，加入as25mg/l（40ml中加40ulas）不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液；

(8)将叶片及茎段放回到预培养基上，28℃黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切口周围有微菌斑形成；

(9)洗菌，取出共培养的烟草叶片及茎段，用添加500mg/lcef的无菌水冲洗5次，第一次放置于摇床摇30min，后面每次5min，以洗去外植体表面的农杆菌；

(10)取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为ms+ba1.0mg/l+hyg25mg/l+cef500mg/lph5.8；过2周观察，如果发现不长菌，则降低cef浓度。如果长菌，则继续保持cef浓度；

(11)每两周更换一次培养基，直至长出不定芽（一般情况为2周）。切下再生的小苗（1cm左右），转入继代培养基ms+ba0.2-0.1mg/l+hyg25mg/l+cef500mg/lph5.8；

(12)至小苗长至2cm长时（有小芽即可），转接入生根培养基ms+naa0.2-0.1mg/l上，24士1℃、12h光照、1500lx培养三周左右即可长出粗壮根系；

(13)待根生长至2-3cm。苗高7-10cm左右时，移出三角瓶洗去根部培养基，移栽于花盆中，温室培养。

采用qiagen公司dna提取试剂盒，提取转基因烟草幼苗的基因组dna，设计basta抗性基因引物进行pcr扩增，筛选阳性植株,检测到25株阳性植株；

按照实例2中所述方法提取野生型植株和25株转ntsap5基因t0代植株的总rna,进行realtime-pcr分析，内参基因为26s，分析不同株系的表达情况。选取表达量最高的两株植株（图5）。单株收取种子分别播种，用basta抗生素筛选t1代植株的分离情况，如此重复直至t3代获得遗传稳定的转基因株系。

ntsap5qrt引物

26s内参基因引物

实施例4

ntsap5过量表达烟草植株对干旱胁迫的抗性表型鉴定

1、将野生型烟草云烟87植株和2个转基因系(过表达_1和过表达_2)转基因烟草种子均匀播于含营养土的小盆中，置于光照培养室中培养。待幼苗长至5-6片叶时(30天)，停止浇水2周，观察植株生长情况，并记录相关数据。

2、烟草植株经干旱处理2周后，ntsap5转基因烟草生长状况明显优于野生型烟草植株，转基因植株叶片萎焉，野生型植株萎蔫情况更为明显，大部分叶片萎焉(图6)。表明ntsap5过表达的转基因烟草对干旱胁迫表现出较好的抗性。

sequencelisting

<110>云南省烟草农业科学研究院

<120>一种烟草抗旱基因ntsap5及其克隆方法与应用

<130>2017

<160>10

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>471

<212>dna

<213>ntsap5的核苷酸序列

<400>1

atggctcagagaacagagaaagaagagactgaatacaacaaagtcgtacatgagaaaacc60

ttaacactttgcgttaaaagttgcggtgtcatcggcaatccagccaccaataatatgtgc120

caaaattgctctaacgctagctcctccaaggtcgcatatcctcataaattcgccaacata180

ttaaccagatctacctcgtccgatctaaaaaaatatgtcgatcgagcggtgaaagatgat240

gataaggcaaaggagagcgtttcaccggcgaagagggaggtgaaccgttgctctggttgt300

cggaggaagctaggattaaccggcttccgttgccggtgcggtgaattattctgcggcgaa360

caccgttactctgaccgtcatgattgcagctatgattacagaaccgccggccgagaggcg420

atcgcgaggcagaatccgctcgtcaaagccgcgaagatcgttaaactttga471

<210>2

<211>160

<212>prt

<213>ntsap5编码的氨基酸序列

<400>2

metgluthralaglnargthrglulysglugluthrglutyrasnlys

151015

valvalhisglulysthrleuthrleucysvallyssercysglyval

202530

ileglyasnproalathrasnasnmetgluthrcysglnasncysser

354045

asnalaserserserlysvalalatyrprohislysphealaasnile

505560

leuthrargserthrserseraspleulyslystyrvalaspargala

65707580

vallysaspaspasplysalalysgluservalserproalalysarg

859095

gluvalasnargcysserglycysargarglysleuglyleuthrgly

100105110

pheargcysargcysglygluleuphecysglygluhisargtyrser

115120125

asparghisaspcyssertyrasptyrargthralaglyarggluala

130135140

ilealaargglnasnproleuvallysalaalalysilevallysleu

145150155160

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>正向引物

<400>3

atggctcagagaacagagaaag22

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>反向引物

<400>4

tcaaagtttaacgatcttcg20

<210>5

<211>53

<212>dna

<213>gateway反应正向引物

<400>5

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgcatggctcagagaacagagaaag

53

<210>6

<211>50

<212>dna

<213>gateway反应反向引物

<400>6

ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctcaaagtttaacgatcttcg50

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>ntsap5qrt正向引物

<400>7

ccaaggtcgcatatcctcat20

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>ntsap5qrt反向引物

<400>8

gccggttaatcctagcttcc20

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>26s内参基因正向引物

<400>9

gaagaaggtcccaagggttc20

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>26s内参基因反向引物

<400>10

tctccctttaacaccaacgg20