一种花生转录因子AhJ11‑FAR1‑5基因的克隆及功能表达方法与流程

【技术领域】

本发明涉及生物基因工程领域，具体地说是一种花生转录因子ahj11-far1-5基因的克隆及功能表达方法。

背景技术：

我国是世界花生生产大国，种植面积居世界第二位，而总产量占世界花生总产量的40％以上，居世界第一位。但是，花生产业的进一步发展受到旱灾的威胁。据统计，我国每年因干旱引起的花生减产达30％～50％。除产量下降外，干旱还有可能导致花生黄曲霉毒素污染、品质下降等一系列后果。此外，随着干旱气候出现频率的增加，如果在逆境胁迫下保持甚至增加花生的产量，成为科学研究的一个方向。

随着科技的发展，利用转基因技术提高植物胁迫耐受能力的研究取得了巨大进步。当胁迫信号产生后，花生会启动一系列相应信号，最后传导到相关基因，启动该基因表达以协助花生适应或抵御逆境。转录因子是调控这些基因表达的重要因素。转录因子是指能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的dna结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，调控基因的表达。

farl作为phya信号通路的正调控因子，1999年通过图位克隆得到(hudsoneta1.1999)。在随后的研究中发现，该转录因子含有一个与玉米mutator家族的转座酶mura(hudsoneta1.2003)以及转座酶jittery相似的序列(lisch，2002；xuetal.2004)。作为一个起源进化于转座子的基因新家族，farl能够稳定地存在于拟南芥基因组中，且没有检测到显著的末端反向重复序列(tir)和其他的转座子类似结构(hudsoneta1.2003)。farl和mutator类似的转座子拥有相似的结构，包括n端c2h2锌指结构域，中部推测的转座子核心结构域以及c端swim锌指结构域。其中n端c2h2结构域具有dna结合活性，c端结构域具有转录激活活性。基于这种进化过程，farl成为了一种新型的转录因子，能够特异的识别fbs(fhy3-bindingmotif，cacgcgc)顺式作用元件(lineta1.2007)，因此能够与启动子上含有fbs序列的基因特异性结合，调控它们的表达，行使生物学功能。到目前为止，花生中farl基因的研究报道较少，关于其功能的研究报道更少。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种花生转录因子ahj11-far1-5基因的克隆及功能表达方法，显著提高花生的抗干旱能力。

本发明提供了一种花生转录因子ahj11-far1-5基因的克隆方法，主要包括以下步骤：

(a)材料的准备与处理，其包括花生种子的萌发、生长以及干旱胁迫处理。具体步骤如下：材料选择花生品种j11，花生种子在hoagland培养液培养萌发，萌发及幼苗生长条件为14h光照/10h黑暗，温度为26-28℃，生长12天用于后续的干旱胁迫处理；

干旱胁迫用peg6000处理，花生根浸泡在15％peg6000溶液中，在处理0h、6h、12h、18h、24h、36h和48h时取花生的根作为材料，所有材料均保存于-80℃超低温冰箱中备用。

(b)花生幼苗的rna的提取和cdna的合成

其具体步骤如下：用takara的minibestuniversalrnaextractionkit试剂盒方法分离提取花生幼苗rna，将得到的rna去除dna污染后再进行cdna合成，用smart-race试剂盒方法进行cdna合成，之后将反转录产物于-20℃低温冰箱中保存备用，以上所用器皿都需经过去除rna酶处理。器皿用0.1％的depc浸泡12小时，然后高压灭菌去除。溶液试剂用0.1％的depc处理(37℃放置12小时后高压消毒)，不耐高温的试剂直接用depc-h2o配制。

(c)通过race进行克隆

具体步骤如下:

race所用试剂盒为clontech的smart-race试剂盒，race扩增基因全长所用引物为3-gps-ahj11-far1-5:5’-cgtgctgagggtgcagaaatga-3’、5-1-ahj11-far1-5:5’-tgttgcccgccgagaaagatg-3’、5-2-ahj11-far1-5:5’-cgtagcaacgcccttgatctgtt-3’、5-3-ahj11-far1-5:5’-atccgacatcatctcaccatccac-3’和ngps-ahj11-far1-5：5’-gtataatcagtcactgggaag-3。

race克隆产物经过1％琼脂糖凝胶电泳分离后用uniq-10pcrpurificationkit试剂盒(上海生工)回收纯化。纯化产物与pgem-teasy载体(北京全是金生化科技有限公司)连接后转化至感受态大肠杆菌(北京全是金生化科技有限公司)中，lb培养基培养，随机挑取10个阳性克隆进行扩大培养，菌液pcr扩增预检测是否有插入片段并测序。

将测序的结果进行拼接后设计全长pcr扩增产物，用uniq-10pcrpurificationkit试剂盒纯化，纯化产物与pgem-teasy载体连接后转化至感受态大肠杆菌中，lb培养基培养，随机挑取10个阳性克隆进行扩大培养，菌液pcr扩增预检测是否有插入片段并测序，扩增引物为ahj11-far1-5-s1：5’-cgcagtggtttccaatggattt-3’和ahj11-far1-5-s2：5’-gccacacctgggttggtggacccc-3’。

进一步的，所述全长pcr扩增所用聚合酶为takarapcrmix，在20μl体系中加入以下成分：10μltakarapcrmix、1μl总cdna、0.5μlahap2er-s1、0.5μlahap2er-s2和8μl无菌双蒸水；

全长pcr扩增反应条件：a)94℃5min；(b)94℃1min；57℃1min；72℃4min；共30cycles；(c)72℃10min。

进一步的，本发明所述的ahj11-far1-5基因开放阅读框为2727bp，共编码908个氨基酸。

进一步的，本发明所述的ahj11-far1-5基因的氨基酸序列在ncbi网站上通过blast分析后发现该基因氨基酸序列与arachisipaensis的far1-5蛋白(xp_016184350.1)的相似性为94％、arachisduranens相关蛋白(xp_015950391.1))的相似性为68％，见图1。

进一步的，本发明所述的ahj11-far1-5基因的核苷酸序列是序列表中sequence1。

进一步的，本发明所述的ahj11-far1-5基因的氨基酸序列是序列表中sequence2。

进一步的，本发明还提供了所述花生转录因子ahj11-far1-5基因的功能表达方法，其使用荧光定量rt-pcr对ahj11-far1-5基因干旱下的表达进行分析，其方法如下：

荧光定量rt-pcr所用cdna模板稀释到8ng/μl，用的聚合酶是sybrgreen，采用的仪器是7500fast荧光定量pcr仪，每反应体系加2μl稀释的cdna；

pcr反应程序如下：(a)95℃，10s；(b)95℃，5s；(c)60℃，30s；(d)72℃，10s；40个循环；绘制溶解曲线，温度增加梯度为每10s增加0.5℃，actin为rt-pcr的内参基因。

所述的ahj11-far1-5荧光定量用的引物序列为：ahj11-far1-5-r：5’-aggactacttcaagatgtg-3’和ahj11-far1-5-f:5’-gctgttacttcattattacga-3’。

所述的内参基因actin所用引物序列为：actin-f:5’-gaggagaagcagaagcaagttg-3’和actin-r:5’-agacagcatatcggcactcatc-3’。

本发明通过荧光定量pcr验证了ahj11-far1-5基因在干旱胁迫下的表达模式，结果表明该基因干旱胁迫下转录水平均有明显升高。从图2可以看出，该基因在干旱胁迫处理后相对表达量一直处于上升的趋势。以上结果表明ahj11-far1-5基因在花生对干旱胁迫的适应性中发挥重要作用。将该基因通过转基因手段导入花生中，转基因植株具有明显的抗旱特性，说明ahj11-far1-5基因能显著提高花生抗旱性。

【附图说明】

图1是花生ahj11-far1-5蛋白与其他花生中far1-5类蛋白氨基酸序列比较；

图2是花生ahj11-far1-5基因在干旱胁迫下的表达模式分析。

【具体实施方式】

以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明，但并不是对本发明的进一步限定。

1.1实施材料：

材料准备与处理：材料选择花生品种j11，花生种子在hoagland培养液培养萌发，萌发及幼苗生长条件为14h光照/10h黑暗，温度为26℃，生长12天用于后续的干旱胁迫处理。干旱胁迫用peg6000处理。花生根浸泡在15％peg6000溶液中，在处理0h，6h，12h，18h，24h，36h和48h时取花生的根作为材料，所有材料均保存于-80℃超低温冰箱中备用。

1.2rna的提取和cdna的合成

所用器皿都需经过去除rna酶处理。器皿用0.1％的depc浸泡12小时，然后高压灭菌去除。溶液试剂用0.1％的depc处理(37℃放置12小时后高压消毒)，不耐高温的试剂直接用depc-h2o配制。总rna提取按takara的minibestuniversalrnaextractionkit的操作要求单链cdna合成，具体参照clontech的smart-race试剂盒方法。反转录产物于-20℃低温冰箱中保存备用。

1.3ahj11-far1-5基因克隆

通过race进行克隆，race所用试剂盒为clontech的smart-race试剂盒方法参照试剂盒说明。race扩增基因全长所用引物为3-gps-ahj11-far1-5:5’-cgtgctgagggtgcagaaatga-3’、5-1-ahj11-far1-5:5’-tgttgcccgccgagaaagatg-3’、5-2-ahj11-far1-5:5’-cgtagcaacgcccttgatctgtt-3’、5-3-ahj11-far1-5:5’-atccgacatcatctcaccatccac-3’和ngps-ahj11-far1-5：5’-gtataatcagtcactgggaag-3。

race克隆产物经过1％琼脂糖凝胶电泳分离后用uniq-10pcrpurificationkit试剂盒(上海生工)回收纯化。纯化产物与pgem-teasy载体(北京全是金生化科技有限公司)连接后转化至感受态大肠杆菌(北京全是金生化科技有限公司)中，lb培养基培养，随机挑取10个阳性克隆进行扩大培养，菌液pcr扩增预检测是否有插入片段并测序(sangon，shanghai)。

将测序的结果进行拼接后设计全长pcr扩增产物，pcr扩增所用的聚合酶为takarapcrmix，在20μl体系中加入以下成分10μltakarapcrmix，1μl总cdna，0.5μlahap2er-s1，0.5μlahap2er-s2，8μl无菌双蒸水。反应条件：94℃5min→(94℃1min→57℃1min→72℃4min)30cycles→72℃10min。uniq-10pcrpurificationkit试剂盒(上海生工)回收纯化。纯化产物与pgem-teasy载体(北京全是金生化科技有限公司)连接后转化至感受态大肠杆菌(北京全是金生化科技有限公司)中，lb培养基培养，随机挑取10个阳性克隆进行扩大培养，菌液pcr扩增预检测是否有插入片段并测序(sangon,shanghai)。

扩增引物：ahj11-far1-5-s1：5’-cgcagtggtttccaatggattt-3’和ahj11-far1-5-s2：5’-gccacacctgggttggtggacccc-3’。

1.4荧光定量pcr

用荧光定量pcr对ahap2er基因进行功能表达：荧光定量pcr所用cdna模板稀释到8ng/μl，用的聚合酶是sybrgreen，用的仪器是7500fast荧光定量pcr仪(abi公司)，每反应体系加2μl稀释的cdna；pcr反应程序如下：95℃10s；95℃5s，60℃30s，72℃10s，40个循环；绘制溶解曲线，温度每10s升高0.5℃。以2-δδct计算相对表达量。actin为rt-pcr的内参基因。

ahj11-far1-5基因荧光定量rt-pcr用的引物序列为：ahj11-far1-5-r：5’-aggactacttcaagatgtg-3’和ahj11-far1-5-f:5’-gctgttacttcattattacga-3’。

内参基因actin所用引物序列为：actin-f:5′-gaggagaagcagaagcaagttg-3′；和actin-r:5′-agacagcatatcggcactcatc-3′。

2试验结果

2.1ahj11-far1-5核苷酸全长及其编码的氨基酸序列

通过pcr扩增及测序，得到了目的基因，该基因开放阅读框为2727bp，共编码908个氨基酸。图1显示了将该基因的氨基酸序列在ncbi网站上通过blast分析后发现该基因氨基酸序列与arachisipaensis的far1-5蛋白(xp_016184350.1)的相似性为94％、arachisduranens相关蛋白(xp_015950391.1)的相似性为68％，故将该基因命名为ahj11-far1-5(arachishypogaeaj11far1-5-liketranscriptionfactor)。

图2是花生ahj11-far1-5基因在干旱胁迫下的表达模式分析。本发明通过荧光定量pcr验证了ahj11-far1-5在干旱胁迫下的表达模式，结果表明：该基因干旱胁迫下转录水平均有明显升高。从图2可以看出，干旱胁迫处理后相对表达量一直处于上升的趋势。以上结果表明ahj11-far1-5基因在花生对干旱胁迫的适应性中发挥重要作用。将该基因通过转基因手段导入花生中，转基因植株比对照具有明显的抗旱特性，说明ahj11-far1-5基因能显著提高花生抗旱性。

以上所述，仅是本发明的最佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，利用上述揭示的方法内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，均属于权利要求书保护的范围。