一种应用内参基因快速检测肉制品中羊源性成分含量的方法与流程

本发明属于分子生物学分析领域，具体涉及肉制品中羊源性成分含量的鉴定方法，是一种在实时荧光定量pcr技术基础上利用内参基因校正外源种属特异性基因对羊源性成分进行定量检测的方法。

背景技术：

多源化的肉类品种是人们餐桌文化日趋丰富的重要组成部分，然而随着市场上牛羊肉价格的不断大幅上涨，部分不法企业及商贩，为了自身经济利益的最大化，在高成本的牛肉或羊肉中掺入低廉的其他肉类品种，或通过牛羊油浸泡、作料添加等方式处理后冒充牛羊肉进行销售。

因此，大力提高市场监管水平，配合营养标签制度的顺利实施，适时修订和完善技术标准，依据掺假轻重情节(即掺假量化数值)针对性地加大处罚及治理力度，稳定市场秩序已显得尤为重要，然而，要想达到及时有效的市场监管效果，快速、精准、量化的肉类鉴别方法是必不可少的关键技术手段。

传统的肉类鉴别方法对熟肉制品的检测有很大的局限性，如耗时长、操作繁琐、费用昂贵、无法鉴别近缘品种、不能量化样品中异源动物成分含量等问题。因此，基于时效性和准确性上的优势，实时荧光定量pcr技术成为检测动物源性成分最常用的分子生物学方法。

然而，周彤等指出经多次高温烘焙会对dna造成一定的损伤，所以如果标准品采用未经高温烘焙的肉源品种，待测样品和标准品dna的断裂程度相差太大，必然会造成结果大幅偏低，让执法者造成误判，因此要想将实时荧光定量pcr技术发展成为分析动物源性食品掺假量化判定的一种有效方法，引入合适的内参基因对肉源品种的整体dna损伤程度和提取效率进行监控，校正外源种属特异性基因百分含量，消除量值结果的偏差是技术的关键，由此才可获得真实可信的食品掺假数值，有效提高检测方法的灵敏度和准确性。

虽然在目前的相关研究以及国家、商检的检测标准中并没有明确的将内参基因的职能定义为外源种属特异性基因量值判定的校正因子，只是将其作为监控反应正常进行与否，防止假阴性结果出现的定性判定指标，但内参基因的校正量化运用必将成为实时荧光定量pcr技术量化定值判定方法的发展趋势。国家相关标准只能进行成分定性检测，无法进行准确定量检测，即只能检测肉制品中是否含有其他成分，比例无法确定。

本发明旨在建立鲜冻畜、禽肉中羊源性成分的定量检测方法，该方法简单易行、灵敏、快速、费用低、便于推广，为动物源成分量化掺伪鉴定提供科学可靠的技术手段。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服传统的肉类鉴别方法耗时长、操作繁琐、不能量化样品中异源动物成分含量等缺点，公开了一种应用内参基因快速检测肉制品中羊源性成分含量的方法。本发明的羊源性成分含量鉴定方法具有简单易行、快速灵敏、费用低、便于推广等优势。

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

用于鉴定羊源性成分含量的pcr扩增引物及探针引物，其特征在于，包括内参基因16srdna引物正向序列：5′-gtccatatcgacgagagg-3′，16srdna反向序列：5′-gtaggactttaatcgttgaaca-3′，16srdna探针序列：5′-fam-tttacgacctcgatgttggatcaggaca-tamra-3′；外源种属特异性基因oa-prlp引物正向序列：5′-caacatgcctttaaaccctcaaa-3′，oa-prlp反向序列：5′-tgtagccttctgactcgctctgt-3′，oa-prlp探针序列：5′-fam-accattgagactggcgg-tamra-3′。

本发明所述快速检测羊源性成分含量的方法，该方法以供试样品基因组dna为模板，应用内参基因校正外源种属特异性基因计算羊源性成分含量，其包括如下步骤：

(1)采用内参基因pcr引物及premixextaq(probeqpcr)预混液，加入供试样品模板dna进行pcr扩增；其中的pcr扩增反应体系：扩增反应的总体积为20μl，其各种成分分别为：2×premixextaq(probeqpcr)预混液10μl，上下游引物各1μl，探针引物0.5μl，模板dna1μl，用灭菌去离子水补齐至20μl；

反应程序：95℃变性2min；进行45次循环扩增反应(95℃变性15s，60℃退火延伸1min)；在第二阶段的退火延伸(60℃)时段收集荧光信号。

(2)构建羊源性成分定量检测的标准参照物，采取sds-硅胶柱改良方法提取dna梯度稀释，配制标准曲线。标准溶液中羊源性成分的浓度为50、5、0.5、0.05、0.005ng/μl，每个反应加入1μldna做模板，每个反应分别对应50、5、0.5、0.05、0.0005ng。每个反应设置3个平行。根据标准dna溶液pcr反应的ct值及初始模板浓度的对数分别绘制16srdna和羊的标准曲线；

(3)设定阈值后，荧光定量pcr仪的数据分析软件自动计算每个反应的ct值和靶标浓度，并记录。将羊源性成分种属特异性基因的靶标浓度除以16srrna内参基因的靶标浓度，计算出试样中羊源性成分种属特异性基因百分含量。

本发明所述的检测方法，其中每条引物分别配制成浓度为100μmol/l的贮存液，工作浓度为10μmol/l。

本发明所述的检测方法，其中模板浓度为50～100ng/μl。

为了能更加清楚的说明本发明的测定方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明。

1、原理

根据牛、羊、猪、鸡、鸭等的dna特征序列，筛选种间保守区域设计一对通用引物和种内特异性区域设计一对种属特异性引物，通用引物可同时扩增牛、羊、猪、鸡、鸭等多种动物源性dna，采用taqman实时荧光pcr技术，根据标准参照物模板含量与ct值间的线性关系，绘制标准曲线，计算试样中种属特异性基因和内参基因的比值，从而对鲜冻畜、禽肉中动物源性成分进行定量检测。

2、引物设计

本发明依据牛、羊、猪、鸡、鸭等的dna特征序列的种间保守区域和种内特异性区域设计1对pcr扩增内参基因和1对外源种属特异性引物。引物由上海生物工程公司合成。

表1引物序列表如下：

3、反应条件

采用内参基因pcr引物及premixextaq(probeqpcr)预混液，加入供试样品模板dna进行pcr扩增；其中的pcr扩增反应体系：扩增反应的总体积为20μl，其各种成分分别为：2×premixextaq(probeqpcr)预混液10μl，上下游引物各1μl，探针引物0.5μl，模板dna1μl，用灭菌去离子水补齐至20μl；

反应程序：95℃变性2min；进行45次循环扩增反应(95℃变性15s，60℃退火延伸1min)；在第二阶段的退火延伸(60℃)时段收集荧光信号。

4、绘制标准曲线

构建羊源性成分定量检测的标准参照物，采取sds-硅胶柱改良方法提取dna梯度稀释，配制标准曲线。标准溶液中羊源性成分的浓度为50、5、0.5、0.05、0.005ng/μl，每个反应加入1μldna做模板，每个反应分别对应50、5、0.5、0.05、0.0005ng。每个反应设置3个平行。根据标准dna溶液pcr反应的ct值及初始模板浓度的对数分别绘制16srdna和羊的标准曲线；

5、计算试样中动物源性成分种属特异性基因含量

将动物源性成分种属特异性基因的靶标浓度和16srdna内参基因的靶标浓度带入公式，计算出试样中动物源性成分种属特异性基因百分含量。计算试样中动物源性成分种属特异性基因百分含量的公式：

式中：

c—试样中动物源性成分种属特异性基因的百分含量(％)；

noa-prlp—羊源性成分种属特异性基因靶标浓度；

n16srdna—内参基因16srdna浓度。

附图说明:

图1为根据标准dna溶液的扩增曲线，绘制的16srrna基因的标准曲线。

图2为根据标准dna溶液的扩增曲线，绘制的羊种属特异性基因的标准曲线。

图3盲样s1羊源性成分含量扩增结果图。

图4盲样s2羊源性成分含量扩增结果图。

图5盲样s3羊源性成分含量扩增结果图。

具体实施方式

为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面结合实施例对本发明做进一步的描述，在此需加以说明的是：本发明所述的引物序列见表1。试样模板dna的提取：sds-硅胶柱改良法提取(见附件)。

实施例1

(1)试剂：takara公司生产的premixextaq(probeqpcr)预混液；上海生工合成的内参基因和外源种属特异性基因扩增引物和探针。

(2)扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为20μl，其各种成分分别为：2×premixextaq(probeqpcr)预混液20μl，10μmol/l上下游引物各1μl，10μmol/l探针引物0.5μl，模板dna1μl(模板dna浓度50ng/μl)，用灭菌去离子水补齐至20μl；反应程序：95℃变性2min；进行45次循环扩增反应(95℃变性15s，60℃退火延伸1min)；在第二阶段的退火延伸(60℃)时段收集荧光信号。

(3)构建羊源性成分定量检测的标准参照物，采取sds-硅胶柱改良方法提取dna梯度稀释，配制标准曲线。标准溶液中羊源性成分的浓度为50、5、0.5、0.05、0.005ng/μl，每个反应加入1μldna做模板，每个反应分别对应50、5、0.5、0.05、0.0005ng。每个反应设置3个平行。根据标准dna溶液pcr反应的ct值及初始模板浓度的对数分别绘制16srdna和羊的标准曲线；

(4)设定阈值后，荧光定量pcr仪的数据分析软件自动计算每个反应的ct值和靶标浓度，并记录。将羊源性成分种属特异性基因的靶标浓度和16srdna内参基因的靶标浓度带入公式，计算出试样中羊源性成分种属特异性基因百分含量为11.95％，结果如图3。计算试样中羊源性成分种属特异性基因百分含量的公式：

式中：

c—试样中动物源性成分种属特异性基因的百分含量(％)；

noa-prlp—羊源性成分种属特异性基因靶标浓度；

表2盲样测试结果

实施例2

(1)试剂：takara公司生产的premixextaq(probeqpcr)预混液；上海生工合成的内参基因和外源种属特异性基因扩增引物和探针。

(2)扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为20μl，其各种成分分别为：2×premixextaq(probeqpcr)预混液20μl，10μmol/l上下游引物各1μl，10μmol/l探针引物0.5μl，模板dna1μl(模板dna浓度50ng/μl)，用灭菌去离子水补齐至20μl；反应程序：95℃变性2min；进行45次循环扩增反应(95℃变性15s，60℃退火延伸1min)；在第二阶段的退火延伸(60℃)时段收集荧光信号。

(3)构建羊源性成分定量检测的标准参照物，采取sds-硅胶柱改良方法提取dna梯度稀释，配制标准曲线。标准溶液中羊源性成分的浓度为50、5、0.5、0.05、0.005ng/μl，每个反应加入1μldna做模板，每个反应分别对应50、5、0.5、0.05、0.0005ng。每个反应设置3个平行。根据标准dna溶液pcr反应的ct值及初始模板浓度的对数分别绘制16srdna和羊的标准曲线；

(4)设定阈值后，荧光定量pcr仪的数据分析软件自动计算每个反应的ct值和靶标浓度，并记录。将羊源性成分种属特异性基因的靶标浓度和16srdna内参基因的靶标浓度带入公式，计算出试样中羊源性成分种属特异性基因百分含量为28.56％，结果如图4。计算试样中羊源性成分种属特异性基因百分含量的公式：

式中：

c—试样中动物源性成分种属特异性基因的百分含量(％)；

noa-prlp—羊源性成分种属特异性基因靶标浓度；

表3盲样测试结果

实施例3

(1)试剂：takara公司生产的premixextaq(probeqpcr)预混液；上海生工合成的内参基因和外源种属特异性基因扩增引物和探针。

(2)扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为20μl，其各种成分分别为：2×premixextaq(probeqpcr)预混液20μl，10μmol/l上下游引物各1μl，10μmol/l探针引物0.5μl，模板dna1μl(模板dna浓度50ng/μl)，用灭菌去离子水补齐至20μl；反应程序：95℃变性2min；进行45次循环扩增反应(95℃变性15s，60℃退火延伸1min)；在第二阶段的退火延伸(60℃)时段收集荧光信号。

(3)构建羊源性成分定量检测的标准参照物，采取sds-硅胶柱改良方法提取dna梯度稀释，配制标准曲线。标准溶液中羊源性成分的浓度为50、5、0.5、0.05、0.005ng/μl，每个反应加入1μldna做模板，每个反应分别对应50、5、0.5、0.05、0.0005ng。每个反应设置3个平行。根据标准dna溶液pcr反应的ct值及初始模板浓度的对数分别绘制16srdna和羊的标准曲线；

(4)设定阈值后，荧光定量pcr仪的数据分析软件自动计算每个反应的ct值和靶标浓度，并记录。将羊源性成分种属特异性基因的靶标浓度和16srdna内参基因的靶标浓度带入公式，计算出试样中羊源性成分种属特异性基因百分含量为80.92％，结果如图5。计算试样中羊源性成分种属特异性基因百分含量的公式：

式中：

c—试样中动物源性成分种属特异性基因的百分含量(％)；

noa-prlp—羊源性成分种属特异性基因靶标浓度；

表4盲样测试结果

附件：sds-硅胶柱改良法提取肉制品dna

(1)取待测动物肌肉组织样本清水洗净后，剔去动物组织中的结缔组织和脂肪，剪成约200mg的小块，放入用液氮预冷的研钵中，然后缓缓的向研钵中加入液氮，迅速研磨，直到样品成细微的粉末状为止，取100mg加入2ml灭菌离心管中；

(2)加入500μlsds裂解液和6μl蛋白酶k，65℃水浴60min，期间不停颠倒混匀；

(3)水浴后13200rpm/min，离心5min；小心地将上层水相转入一个新的离心管中，加入0.8倍异丙醇；将混匀的液体转入吸附柱中，13200rpm/min，离心30s，弃掉废液；

(4)向吸附柱中加入70％乙醇，13200rpm/min，离心30s，弃掉废液，重复此步骤一次；

(5)将吸附柱放回收集管中，13200rpm/min，离心2min，倒掉废液；将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇；将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间位置悬空滴加100μl的洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，13200rpm/min，离心2min，所得溶液即为dna。