本发明涉及一种编码甘薯花青素还原酶的ibanr基因及其应用，属于基因工程领域。
背景技术：
类黄酮类化合物(flavonoids)是广泛存在于植物界的一类非常重要的次级代谢产物。目前为止，已鉴定的类黄酮类化合物约有8000种。根据结构的不同可以进一步分为7个亚类，黄烷酮，异黄酮，花青素，黄烷醇，儿茶素，黄酮及原花青素。这些化合物在许多生物过程中起着重要的作用，对植物本身而言，具有抵御低温、干旱、真菌感染，防御紫外线伤害，虫害，吸引授粉者，利于种子传播等功能。还具有预防心血管疾病、神经元和衰老相关疾病、癌症、大脑中枢栓塞和缺血症状等，抑制肥胖和高血脂，改善血糖平衡，增强视力敏锐性等功能，已成为植物营养素或食品健康的重要标志之一。所以通过基因工程方法增强或减弱某些关键基因的表达，可促进类黄酮类物质的生物合成，提高其含量，这是提高植物营养成分，优化营养，改良品质的一条非常有效的途径。
苯丙氨酸代谢是植物中合成花青素、类黄酮等许多次生代谢物的生物合成途径，花青素的生物合成是类黄酮代谢途径中的一个分支，以苯丙氨酸为起始底物，经苯丙氨酸解氨酶(pal)，肉桂酸羟化酶(c4h)，4香豆酰coa连接酶(4cl)，查尔酮合成酶(chs)，查尔酮异构酶(chi)，黄烷酮-3-羟化酶(f3h)，类黄酮3’-羟化酶(f3’h)，二氢黄酮醇还原酶(dfr)，花青素合成酶(ans)，类黄酮3-葡糖基转移酶(ugts)等一系列结构基因及myb(v-mybavianmyeloblastosisviraloncogenehomolog)、bhlh(basichelix-loop-helix)wd40等类转录因子组成的mbw(myb-bhlh-wd40)转录复合体的协同调控合成花青素。花青素还原酶将花青素转变成相应的顺式黄烷3-醇，如将矢车菊素(anthocyanidin)与翠雀素(anthodelphinidin)有nadph存在下转换成表儿茶素(epicatechin，ec)和表没食子儿茶素(epigallocatechin，egc)。因此，花青素还原酶参与调控植物组织中花青素的水平及原花青素的形成，在花青素积累过程中具有重要的调节作用。
甘薯不仅是重要的粮食作物，而且还是重要的经济作物和能源作物。甘薯广泛种植在世界上的100多个国家，我国是世界上的最大生产国，甘薯生产约占世界甘薯的80％。因品种不同，甘薯薯肉颜色有白色，乳白色，黄色，橙色，浅紫色和深紫色等等。一般而言，白色薯肉甘薯富含淀粉，黄色尤其是橙色薯肉甘薯富含类胡萝卜素及类黄酮化合物，而紫色薯肉色甘薯则富含花青素。甘薯黄酮类物质含量及花青素含量是品种选育的重要指标之一。通过定向选育，优化甘薯营养成分，提高甘薯的营养附加值，对确保我国的粮食安全具有重要的战略意义。因此在甘薯中克隆新合成和调控基因，研究其基本的生物学特性和功能，可为整个植物类黄酮类代谢物质生物合成调控网络提供理论基础，并为改良作物品质优化营养成分提供一定的技术支撑。
技术实现要素：
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种编码甘薯花青素还原酶的ibanr基因及其应用，可有效为植物类黄酮类代谢物质生物合成调控网络提供理论基础，并为改良作物品质优化营养成分提供一定的技术支撑。
为了实现上述目的，本发明采用的一种编码甘薯花青素还原酶的ibanr基因，其具有seqidno.1所示的核苷酸序列，所述ibanr基因具有负责调控花青素合成的功能。
一种ibanr基因编码的蛋白质，具有seqidno.2所示的氨基酸序列。
一种ibanr基因在甘薯栽培品种徐紫薯3号植株中的应用，具体包括以下步骤：
分别取徐紫薯3号的新鲜的叶片、茎、膨大根和成熟根，每3株为一组混样，液氮速冻后存于-80℃冰箱，提取rna并反转成cdna，采用荧光定量试剂盒，反应在定量pcr仪上进行；
其中，甘薯β-actin基因作为反应中的内参；
β-actin引物序列：f：tgttgctattcaggctgtgc；
r：aaacgaagaatggcatgagg；
ibanr定量pcr引物：f:gacctgagcgacaagtggtt；
r:tttggcttgggtggttagag。
一种ibanr基因在甘薯品种块根中的应用，具体包括以下步骤：
分别取成熟期的大小适中健康薯块，每3个一组，切成0.5×0.5cm的小丁混样，液氮速冻后存于-80℃冰箱，提取rna并反转成cdna，采用荧光定量试剂盒，反应在定量pcr仪上进行；
其中，甘薯β-actin基因作为反应中的内参；
β-actin引物序列：f：tgttgctattcaggctgtgc；
r：aaacgaagaatggcatgagg；
ibanr定量pcr引物：f:gacctgagcgacaagtggtt；
r:tttggcttgggtggttagag。
作为改进，选用的甘薯品种为徐薯28号、徐薯32号、徐渝34号、徐紫薯1号和徐紫薯3号。
一种所述ibanr基因的获得方法，具体包括以下步骤：
根据甘薯转录组测序结果，获得comp111253_c0共747个碱基的核苷酸序列，通过blastn在线比对与其他植物anr基因同源性高达90％以上，以该段核苷酸序列为核心序列，将3’、5’race测序结果与核心序列拼接获得cdna全长序列。
ibanr是甘薯类黄酮类代谢物质生物合成途径中的关键酶，负调控甘薯花青素的生物合成，可作为高花青素甘薯品种筛选的一个重要指标；本发明可有效为植物类黄酮类代谢物质生物合成调控网络提供理论基础，并为改良作物品质优化营养成分提供一定的技术支撑。
附图说明
图1为ibanr氨基酸序列的系统进化树分析结果；
图2为ibanr基因在徐紫薯3号植株中的表达；图中：l3、第三叶，l4、第4叶，st、茎，dt、膨大根，mt、成熟根；
图3为ibanr基因在不同薯肉色甘薯块根中的表达；
图4为不同薯肉色甘薯品种块根中花青素含量比较；
图5为不同薯肉色甘薯品种块根中儿茶素及其衍生物的含量比较。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
甘薯中花青素还原酶基因ibanr基因序列的获得，具体包括以下步骤：
根据甘薯转录组测序结果，获得了comp111253_c0共747个碱基的核苷酸序列，通过blastn在线比对与其他植物anr基因同源性高达90％以上，以该段核苷酸序列为核心序列并利用引物设计软件(primerpremier5)设计引物：
1)5’race特异性引物：anrr1:5’-gagatgtgaaaacagaaccgac-3’；
anrr2:5’-catgacgcctttgaaaccactc-3’；
a)依据天根多糖多酚植物总rna提取试剂盒(天根生物科技，中国，北京)提供的步骤提取甘薯薯块总rna：
(1)实验中所有使用的耗材用depc溶液浸泡过夜后蒸汽高压灭菌三次；
(2)称取约0.1g的甘薯组织在液氮中研磨成粉，随后加入500μl的细胞裂解液，涡旋混匀，使细胞裂解液充分与植物组织粉末融合；
(3)在12000rpm的转速下，4℃离心2min；
(4)用移液器小心吸取上清至rnase-free的过滤柱中；
(5)在上述的过滤柱中加入2/3体积的无水乙醇并轻缓混匀，可以看到丝丝白色沉淀，随后将沉淀与管中液体一起转移至2mlrnase-free的收集管吸附柱中，12000rpm，离心15s，取出吸附柱倒去收集管中的废液，并将吸附柱重新放回收集管中；
(6)加入350μl去蛋白液，尽量去除提取物中的蛋白质的污染，提高rna质量，12000rpm离心2分钟，倒去收集管中的废弃液体；
(7)去除提取物中的dna污染：在rnase-free的新的离心管中加入70μlrdd缓冲溶液和10μldnasei，混合后取80μl至含有提取物的吸附柱中，4℃，静置15min；
(8)重复步骤(6)一次；
(9)在漂洗液中提前加入规定体积的乙醇，加500μl漂洗液到吸附柱中，12000rpm离心15秒，弃废液；
(10)重复步骤(9)1-2次；
(11)12000rpm离心2分钟后将吸附柱转移到新的rnase-free的1.5ml离心管中，加30-50μlrnase-freeddh2o于吸附膜中央，静置2分钟后12000rpm离心2分钟，得到的液体即为rna溶液。
于nanodropnd-1000(nanodropnd技术公司，美国，威明顿)分光光度计和2100生物分析仪(安捷伦科技公司，美国，帕洛阿尔托)检测rna含量和质量。
b)mrna反转录
在rnase-free的离心管中按如下比例配置反应液：
具体反应体系如下：总rna1ug；
5′-cds引物1ul；
无菌水5ul；
反应条件：72℃，3min→42℃，2min；
然后加入下列组分：
5×第一链缓冲液(first-strandbuffer)2ul，smarterⅱaoligo1ul，二硫苏糖醇(dtt)(20mm)1ul，dntp(10mm)1ul，rnase抑制剂(40u/ul)0.25ul，smart反转录酶(100u/μl)1ul；反应条件：42℃，90min→70℃，10min→加入100ultricine-edta缓冲液，混匀，得反转录反应液；
c)pcr扩增：使用dna聚合酶(takaradnapolymerase)(codeno.r060a)进行pcr扩增；
外轮反应体系：上述的反转录反应液2.5ul，缓冲液(mg2+，dntpplus)25ul，dna聚合酶(dnapolymerase)(1.25units/ul)1ul，upm(10×)5ul，r2引物(10um)1ul，dh2o15.5ul；反应条件为94℃1min1循环，再以98℃10s、60℃15s和68℃1min进行30个循环；
内轮pcr反应体系：
外轮pcr反应液1ul，2×缓冲液(mg2+，dntpplus)25ul，dna聚合酶(1.25units/ul)1ul，nup(10μm)1ul，r3引物(10um)1ul，dh2o21ul；
反应条件：94℃1min1循环；98℃10s、60℃15s和68℃1min进行30个循环；
d)pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶回收试剂盒(takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0)切胶回收上述pcr产物，使用takaradnaligationkitver.2.1中的连接酶，与t-载体(t-vectorpmdtm20)连接后，热转化至大肠杆菌感受态细胞(e.colicompetentcells)jm109中，涂布平板，37℃过夜培养。挑选阳性菌落，送上海生物工程技术有限公司测序。
2)3’race特异性引物：
anrf1:5’-ggagtgaagaacgtggcata-3’；
anrf2:5’-ttgggtggttagagatgtcc-3’；
a)反转录：使用3′-fullracecoresetwithprimescripttmrtase(takara)合成cdna；
b)pcr扩增：使用dna聚合酶(takaracodeno.r060a)进行pcr扩增；
外轮pcr反应体系：
反转录反应液2ul，2×缓冲液(mg2+,dntpplus)25ul，dna聚合酶(1.25units/ul)1ul，3′race外轮引物(10um)2ul，ctg0156fn引物(10um)2ul，dh2o18ul；
反应条件：94℃1min1循环；98℃10s、55℃15s和68℃1min进行30个循环；
内轮pcr反应体系：
外轮pcr反应液1ul，缓冲液(mg2+,dntpplus)25ul，dna聚合酶(1.25units/ul)1ul，3′race内轮引物(10um)2ul，ctg0156fn引物(10um)2ul，dh2o19ul；
反应条件：94℃1min1循环；98℃10s，55℃15s和68℃1min进行30个循环；
c)pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收pcr产物，使用takaradnaligationkitver.2.1中的连接酶，与t-载体连接后，热转化至菌感受态细胞中，涂布平板，37℃过夜培养。挑选阳性菌落，提取质粒送上海生物工程技术有限公司测序。
将3’、5’race测序结果与核心序列拼接获得cdna全长序列，如seqidno.1所示序列。
实施例2
ibanr蛋白序列同源分析，具体如下：
测序获得cdna全长1026bp，编码341个氨基酸如seqidno.2所示，将翻译获得氨基酸序列与ncbi蛋白数据进行比对，获得了与ibanr蛋白序列相似的植物种属同源基因。
在多重比较分析的基础上，建立了各同源植物种属基因的系统进化树，详见图1。包括甜樱桃(prunusavium)、野草莓(fragariavescasubsp.vesca)、葡萄(vitisvinifera)、茸毛烟草(nicotianatomentosiformis)、番茄(solanumlycopersicum)、梅(prunusmume)、大豆(glycinemax)、甜椒(capsicumannuum)、碧桃(prunuspersica)、芝麻(sesamumindicum)、土豆(solanumtuberosum)。利用mega5.1软件进行系统进化树的构建，ibanr亲缘关系与这14种植物分属不同的分支进化。
实施例3
ibanr在甘薯植株中的表达模式(如图2所示)，具体如下：
分别取徐紫薯3号的新鲜的叶片、茎、膨大根和成熟根，每3株为一组混样，液氮速冻后存于-80℃冰箱。triol法提取rna并反转成cdna。采用takara公司的荧光定量试剂盒。反应在定量pcr仪(appliedbiosystemssteponeplus)上进行，按照相对定量的方法检测基因的表达量，反应程序按照takara提供的操作手册进行，甘薯β-actin基因作为反应中的内参；
β-actin引物序列：f：tgttgctattcaggctgtgc；
r：aaacgaagaatggcatgagg；
ibanr定量pcr引物：f:gacctgagcgacaagtggtt；
r:tttggcttgggtggttagag；
结果发现该基因在甘薯徐紫薯3号的叶、茎及根中都有表达，其中在块根膨大期的表达量较其他组织或时期要弱。
实施例4
ibanr在不同薯肉甘薯品种块根中的表达模式(如图3所示)，具体如下：
实验材料为甘薯栽培品种徐薯28号(薯肉色为白色)、徐薯32号(薯肉色为浅黄色)、徐渝34号(薯肉色为橘黄色)、徐紫薯1号(薯肉色为浅紫色)和徐紫薯3号(薯肉色为深紫色)。
分别取成熟期的大小适中健康薯块，每3个一组，切成0.5×0.5cm的小丁混样，同实施例3中方法提取总rna，反转录cdna，qrt-pcr检测结果表明，在黄肉色甘薯品种徐薯32和徐渝34号中的表达量大于白肉甘薯徐薯28号，且橘黄肉的徐渝34号的ibanr表达量高于浅黄色薯肉甘薯徐薯32号；ibanr在紫肉甘薯品种徐紫薯1号和徐紫薯3号的表达量也高于白肉甘薯，且浅紫色甘薯品种徐紫薯1号的表达量高于深紫色薯肉徐紫薯3号。
实施例5
不同薯肉色甘薯中花青素的含量，具体测量过程如下，结果如图4所示：
1)实验材料为甘薯栽培品种徐薯28号(薯肉色为白色)、徐薯32号(薯肉色为浅黄色)、徐渝34号(薯肉色为橘黄色)、徐紫薯1号(薯肉色为浅紫色)和徐紫薯3号(薯肉色为深紫色)；分别取成熟期的大小适中健康薯块，从薯块的中间处剖开，每3个一组混样切成细丝，冷冻干燥，用小型粉碎机粉碎，100目过筛，分品种收集密封，4℃避光存放。
2)总花青素含量的提取：
采用超声波辅助有机溶剂提取法提取甘薯块根总花青素含量，操作流程如下：
1、称取0.2g甘薯块根组织干粉到2ml离心管中；
2、加入1ml提取试剂(酸性50％甲醇/0.5％hcl)，用涡旋混匀器充分震荡混匀；
3、将离心管置于超声波清洗器中超声5min；
4、室温下于5000rpm离心10min，收集上清转移到新的5ml离心管内，重复步骤2、3、4两次，合并上清液；
5、将合并的上清液用45μm的滤膜过滤到新的离心管中即为花青素提取液，避光保存。
3)总花青素含量的测定：吸取100μl花青素提取液于酶标板孔中，在synergytmh4酶标仪上读取530nm波长下的od值。每个品种3个重复取平均值。
可以很明显地看出，紫肉甘薯品种的花青素最高，且深紫色甘薯徐紫薯3号花青素含量高于浅紫色甘薯品种徐紫薯1号；黄肉甘薯品种中能检测到极少量的花青素。
实施例6
不同薯肉色甘薯中儿茶素及衍生物的相对含量测定(结果如图5所示)，具体步骤如下：
1)称取实施例5中的粉末100mg，溶解于1.0ml甲醇溶液中，样品于4℃冰箱中过夜，期间涡旋三次，使提取更为充分，提取后，离心(转速10000g)10分钟，吸取上清，用微孔滤膜(0.22μm)过滤样品，并保存在进样瓶中随后用于lc-ms/ms分析。
质控样本(qc)由样本提取物混合制备而成，用于分析样本在相同的处理方法下的重复性。在仪器分析的过程中，每10个检测分析样本中插入一个质控样本，以监测分析过程的重复性。
2)色谱质谱采集条件
数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱(ultraperformanceliquidchromatography，uplc)和串联质谱(tandemmassspectrometry，ms/ms)。
分析条件主要包括：
a)色谱柱：watersacquityuplchsst3c181.8μm，2.1mm*100mm；
b)流动相：水相为超纯水(加入0.04％的乙酸)，有机相为乙腈(加入0.04％的乙酸)；
c)洗脱梯度，水：乙腈，0min为95:5v/v，11.0min为5:95v/v，12.0min为5:95v/v，12.1min为95:5v/v，15.0min为95:5v/v；
d)流速为0.4ml/min；
e)柱温为40℃；
f)进样量为5μl。
api4500qtraplc/ms/ms系统中，线性离子阱和三重四级杆的主要参数包括：电喷雾离子源(electrosprayionization，esi)温度为550℃，质谱电压为5500v，帘气(curtaingas,cur)为25psi，碰撞诱导电离(collision-activateddissociation，cad)参数设置为高。在三重四级杆(qqq)中，每个离子对是根据优化的去簇电压(declusteringpotential，dp)和碰撞能(collisionenergy，ce)进行扫描检测。
所得到的数据利用软件analyst1.6.1(absciex)进行数据处理。
浅紫色甘薯品种徐紫薯1号的儿茶素及表儿茶素衍生物含量明显高于深紫色甘薯徐紫薯3号，也明显高于白肉和黄肉甘薯品种。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>江苏师范大学
<120>一种编码甘薯花青素还原酶的ibanr基因及其应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1026
<212>cdna
<213>甘薯栽培种徐紫薯3号(sweetpotatocv.xuzishu3)
<400>1
atggaggagagcaggcatagggtttgtgtaatcggaggtgcaggttatgtgggatcttca60
ttggtgaagaagcttgtagacgaaggctacactgttcatgcaacgcttaggagcttgagt120
gaggagtcgaaggtggggttgctgaagagcttcgccggcgcagatgagcgactgaagttg180
ttcgaagctgatcttttaaacaaatccgaacagatcgagcaggccatccatggctgcgaa240
tttgtgttccttgtggcaacgcccacaccgcaagccggaaggttgaacgtggatgaaata300
gtggagggagtgaagaacgtggcatatgcttgcagtagatgtgaaagcgttcgtcggctg360
atctataccgcctccaccggcgccgcttcgccgttaaaagaagacgggagtggtttcaaa420
ggcgtcatggacgaaacatgctggactcctttccctcttcctttccaccattccaatgat480
agcctaagggattatatggaaagcaagacattggccgggaaagaaatgttgaaaattgga540
aatgatgaagaaggattagaggtggtgagcttagcattgggggctgtgggaggagatacg600
tgtttatggtattgtgggtactctgtgtcggttctgttttcacatctcatccacgacgag660
aatggacacaagtcactgaaatttgttgaggatttgttggggaaaatcccaatcgtacac720
atagaagatgtgtgcgatgctcatatcttcgccatgaaagcaccaaatggttccatgtct780
gggcgtttcctctgcgccaactcctttgtttccgctgcacaaatcgctaactatttgcgc840
cacaattataatgaatttcttgtcaacctgcaagaccaagattgcagttgcattatgaat900
ggacctgagcgacaagtggttctgaattatgaaaagcttcttcacaaagggttcacgtac960
aaaaaatccttgaaagacgtggtagatgattctattagctgtgggaggagatttggacat1020
ctctaa1026
<210>2
<211>341
<212>prt
<213>甘薯栽培种徐紫薯3号(sweetpotatocv.xuzishu3)
<400>2
metglugluserarghisargvalcysvalileglyglyalaglytyr
151015
valglyserserleuvallyslysleuvalaspgluglytyrthrval
202530
hisalathrleuargserleuserglugluserlysvalglyleuleu
354045
lysserphealaglyalaaspgluargleulysleupheglualaasp
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serleulysphevalgluaspleuleuglylysileproilevalhis
225230235240
ilegluaspvalcysaspalahisilephealametlysalaproasn
245250255
glysermetserglyargpheleucysalaasnserphevalserala
260265270
alagluilealaasntyrleuarghisasntyrasnglupheleuval
275280285
asnleuglnaspglnaspcyssercysilemetasnglyprogluarg
290295300
glnvalvalleuasntyrglulysleuleuhislysglyphethrtyr
305310315320
lyslysserleulysaspvalvalaspaspserilesercysglyarg
325330335
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340