一种提高蛹虫草菌液体发酵虫草素产量的方法与流程

本发明涉及真菌发酵技术领域，具体地说是一种提高蛹虫草菌液体发酵虫草素产量的方法。

背景技术：

虫草素（cordycepin）即3’脱氧腺苷，为嘌呤类生物碱，具有抗病毒、消炎、抑制肿瘤和提高机体免疫力等功效。此外，虫草素通过ros介导的细胞凋亡途径治疗t淋巴细胞白血病，其作为治疗t淋巴细胞白血病新药的研究已进入临床二期实验。而虫草素的产生菌主要为虫草属真菌，此外，无冠构巢曲霉亦可产生虫草素，但蛹虫草菌cordycepsmilitaris发酵液中虫草素含量高于其他真菌。

近年来，温度、光照、溶氧量、ph值、碳氮源等提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的研究很多，但利用微量添加物的补料策略提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的研究很少，而腺嘌呤和腺苷为虫草素生物合成的直接前体物质，对提高发酵液虫草素产量的作用显著，腺嘌呤比腺苷更容易通过细胞膜，使得细胞利用腺嘌呤合成虫草素的效率更高。然而，优化腺嘌呤补料策略提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的研究更少。如专利申请号为201610578793.4的中国发明专利申请所公开的《一种提高蛹虫草液体发酵生产虫草菌素产量的方法》、《食品科技,》2013,38（7）所公开的《甘氨酸补加产虫草素的蛹虫草液体发酵条件的优化》均未进行腺嘌呤的补料，发酵液虫草素产量的提高程度较低，最高只有238.52％。专利申请号为200810069010.5的中国发明专利申请所公开的《一种提高蛹虫草液体发酵虫草菌素产量的方法》联合添加腺嘌呤和甘氨酸，使得虫草素产量比对照提高了426%，但没有优化腺嘌呤和甘氨酸的联合添加浓度，同时也未进行腺嘌呤的补料。专利申请号为201510233106.0的中国发明专利申请公开了《一种虫草素发酵固体培养基及其制备方法与应用》，采取联合补料腺嘌呤和脂肪酸甘油酯提高固体培养基蛹虫草素产量，即未优化腺嘌呤的联合添加浓度，也未依据腺嘌呤的优化浓度进行精确补料，而且其采用的添加方式易造成发酵污染，进而影响虫草素产量的提高，增加了生产成本。专利申请号为201611245510.0、名称为《一种提高蛹虫草液态发酵生产虫草素和耐热蛋白酶产量的方法》的中国发明专利申请，利用营养液和复合激活剂多次补料以提高虫草素产量，但未对复合激活剂组分的添加浓度进行优化，亦未根据复合激活剂的优化浓度进行补料，易增加生产成本且工艺较复杂。

在“甘肃省科技计划资助”（资助项目编号：17jr5ra181）的资助下，以及“甘肃省科学院应用研究与开发项目”（项目编号：2017jk-14）协助支持下，本发明深入研究了提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的方法，并获得成功。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的方法，克服现有技术蛹虫草菌发酵液虫草素产量提高程度低、补料不精准、补料易污染和补料工艺复杂的技术缺陷。

一种提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的方法，其特征在于：使用的菌株为中国微生物菌种保藏中心的蛹虫草菌（cordycepsmilitaris）cgmcc3.4655；按照下述步骤进行：

（1）将菌株转接于无菌pda斜面培养基上进行培养、活化，制得斜面母种；

（2）将斜面母种转接至平皿培养基培养，制得平板母种；

（3）将平板母种接种至种子培养基，摇床培养，制得种子液；

（4）将种子液接种至优化培养基并用无菌聚丙烯袋封住三角瓶口，摇床培养，制得待补料发酵液；

（5）依据腺嘌呤补料公式配制腺嘌呤补料溶液，向待补料发酵液添加100ml腺嘌呤补料溶液,使得发酵液腺嘌呤达到其优化质量浓度，制得已补料发酵液；

（6）将已补料发酵液于摇床培养后，继续静置培养，静置培养结束后制得含菌丝体的发酵液；

（7）将含菌丝体的发酵液中的菌丝体滤除，收集滤液，制得虫草素发酵滤液。

上述步骤（1）的斜面母种制作中，pda斜面培养基为公知培养基。

上述步骤（2）的平板母种制作中，平皿培养基组方为：由蛋白胨10g、牛肉粉3g、氯化钠5g与琼脂15g组成的营养琼脂33g与纯净水1000ml混匀，ph7.3±0.1；方法：从斜面母种取3mm大小菌块，接种至平皿培养基，于黑暗、20℃培养9d，制得平板母种。

上述步骤（3）的种子液制作中，种子培养基组方为：葡萄糖30g、蛋白胨8g、酵母粉8g、kh2po41g与水1000ml混匀，ph自然；方法：无菌条件下用打孔器取平板母种同一半径上3mm大小的6个菌块接种至种子培养基装载量为300ml/500ml的三角瓶中，于25℃、黑暗、120r/min摇床培养3d制成种子液。

上述步骤（4）的待补料发酵液制作中，优化培养基组方为：葡萄糖35g、蛋白胨17g、腺嘌呤2g、甘氨酸14g、kh2po41g、mgso4·7h2o1g与纯净水1000ml混匀，ph自然；方法：无菌条件下将种子液以体积比5%（优化培养基装载量200ml的5%）接种量接种至优化培养基装载量200ml/500ml的三角瓶中，用无菌聚丙烯袋封住三角瓶瓶口，于黑暗、25℃、160r/min摇床培养12d，制得待补料发酵液。

上述步骤（5）的已补料发酵液制作中，腺嘌呤补料参数：腺嘌呤补料溶液的质量浓度按照腺嘌呤补料公式计算，每个待补料发酵液添加腺嘌呤补料溶液的体积为100ml；方法：将步骤（4）装有待补料发酵液的三角瓶从摇床取出并置于超净工作台，无菌条件下，取下三角瓶瓶口的聚丙烯袋和瓶塞后，将装载量100ml/150ml的无菌腺嘌呤溶液倒入待补料发酵液，制成已补料发酵液。

上述步骤（6）的含菌丝体的发酵液制作中，摇床培养条件为黑暗、25℃、160r/min、培养6d，静置培养条件为黑暗、25℃、培养6d。

上述步骤（7）的虫草素发酵滤液制作方法为：含菌丝体的发酵液经0.22µm滤膜滤除菌丝体，收集滤液，即得虫草素发酵滤液。

以上方法中，腺嘌呤补料溶液、聚丙烯袋和各培养基均在0.15mpa条件下灭菌30min。

以下为本发明的主要实验设计和相关说明：

本发明涉及的发酵液虫草素产量、腺嘌呤剩余量、ph值和体积所指为发酵滤液的相关指标。

hplc法测定发酵液虫草素产量条件：美国waters1525高效液相色谱；色谱柱：zorbaxsbc18柱（4.6mm×250mm，5µm）；流动相：甲醇:水15∶85（v/v）；流速：1ml/min；柱温：35℃；进样量：20µl；检测波长：260nm。

上述步骤（4）已对甘氨酸和腺嘌呤的添加质量浓度的进行了优化，发现腺嘌呤和甘氨酸的优化添加质量浓度分别为2g/l和14g/l，实验结果如图1和图2所示。实验方法为：设置基础培养基的腺嘌呤添加质量浓度梯度为0.5g/l、1g/l、2g/l、4g/l，对照不添加腺嘌呤，于黑暗、25℃、160r/min条件下摇床培养6d，以发酵液虫草素产量为指标筛选腺嘌呤的优化质量浓度；利用腺嘌呤优化质量浓度，设置基础培养基中甘氨酸和腺嘌呤质量浓度比值分别为：0∶1、1∶1、4∶1、7∶1、10∶1、13∶1，发酵液虫草素产量为指标筛选腺嘌呤和甘氨酸联合添加的优化质量浓度。其中，基础培养基组方：葡萄糖35g、蛋白胨17g、腺嘌呤2g、甘氨酸14g、kh2po41g、mgso4·7h2o1g、ph自然、纯净水1000ml。

上述步骤（4）筛选补料时间的实验方法：设置16个发酵实验，其中1个作为对照，对照置于黑暗、25℃、160r/min、基础培养基条件下发酵6d；其他15个实验置于黑暗、25℃、160r/min、优化培养基条件下发酵，从第2d开始，每隔2d取出1个三角瓶，于60℃水浴处理30min后，置于3-4℃冰箱中冷藏备用，至第30d收集全部三角瓶后，测定全部三角瓶发酵液的虫草素产量、腺嘌呤剩余量和ph值。实验结果如图3所示：发酵第12d至30d，发酵液虫草素产量无显著变化（p<0.05），故明确发酵液补料时间为第12d。

上述步骤（5）明确腺嘌呤补料溶液质量浓度的实验方法：设置12个发酵实验，于黑暗、25℃、160r/min、优化培养基条件下发酵12d，制得12份待补料发酵液；将12份待补料发酵液分为6组，每组设置待补料和未补料两个处理，取出一组，测定其中未补料发酵液腺嘌呤剩余量、虫草素产量、ph值和体积，测得该发酵液腺嘌呤剩余量和体积分别为239.896µg/ml和106ml，代入腺嘌呤补料公式可计算出腺嘌呤补料溶液的质量浓度为3.866g/l，该质量浓度参数用于实施例1；配置装载量为100ml/150ml的腺嘌呤溶液6份，无菌条件下将灭菌后的6份腺嘌呤溶液分别单独倒入6份待补料发酵液中（即每份待补料发酵液添加腺嘌呤溶液100ml），将其中一份待补料发酵液于60℃水浴处理30min后，置于3-4℃冰箱中冷藏备用，其余5组共10份发酵液置于黑暗、25℃、160r/min条件继续发酵，每隔2d取出一组，同等方法处理后冷藏备用，直至补料后第10d收集全部发酵液后，同时测定发酵液腺嘌呤剩余量、虫草素产量、ph值和体积。

上述步骤（5）的腺嘌呤补料公式为ρ=（vc*ρc+v0*ρ0）/（vc+v0）；其中，ρ为腺嘌呤的优化质量浓度2g/l，ρ0为腺嘌呤补料溶液质量浓度，v0为每个待补料发酵液中添加腺嘌呤补料溶液的体积100ml，ρc和vc分别为第12d未补料发酵液腺嘌呤剩余量和发酵液体积。

上述步骤（6）的发酵液补充添加腺嘌呤溶液后，发酵液体积发生变化，虫草素产量和腺嘌呤剩余量亦发生了变化，因此需利用未补料发酵液体积校正补料发酵液相关指标数据。指标数据校正公式为ρt*vt=ρe*ve，其中：ρt为未补料发酵液虫草素产量或腺嘌呤剩余量，vt为未补料发酵液体积，ρe为已补料发酵液虫草素产量或腺嘌呤剩余量，ve为已补料发酵液体积。

对上述步骤（6）的摇床培养的未补料和已补料发酵液体积进行了测定，实验结果：补料后摇床培养第0、2、4、6、8、10d未补料发酵液体积对应为106、92、83、75、67、53ml，补料后摇床培养第0、2、4、6、8、10d已补料发酵液体积对应为206、190、179、172、162、139ml。利用上述步骤（6）的指标校正公式校正虫草素产量和腺嘌呤剩余量，如图4所示：第6d与第4d发酵液虫草素产量差异极显著（p<0.01），而第6、8、10d的发酵液虫草素产量无显著变化（p<0.05），因此，步骤（6）选择发酵第6d为摇床转静置培养时间较合理。

上述步骤（6）的静置培养工艺的实验方法：设置6组平行实验，每组设置未补料和待补料两个处理，均于黑暗、25℃、160r/min、优化培养基条件下培养12d，待补料组发酵液分别单独添加100ml腺嘌呤溶液，未补料组不补料，两组发酵液置于黑暗、25℃、160r/min条件下培养6d后，取出已补料和未补料发酵液各一份，于60℃水浴处理30min后，置于3-4℃冰箱中冷藏备用，其他发酵液于黑暗、25℃条件下静置培养，每隔3d取出已补料和未补料发酵液各一份，以上相同方法处理后冷藏备用，直至取出全部发酵液后，同时测定补料发酵液虫草素产量、腺嘌呤剩余量和ph值以及未补料发酵液的体积，对补料发酵液虫草素产量和腺嘌呤剩余量数据进行校正，矫正方法同以上步骤（5）。

对上述步骤（6）的静置培养的未补料和已补料发酵液体积进行了测定，实验结果：摇床转静置培养后的第0、3、6、9、12、15d，未补料发酵液体积分别对应为70、68、65、63、62、61ml，补料发酵液体积分别对应为163、161、153、151、150ml。利用上述步骤（6）的指标数据校正公式校正虫草素产量和腺嘌呤剩余量，如图5所示：因静置培养的虫草素积累较慢，故比较虫草素产量的时间间隔为6d。静置培养第0d和第6d虫草素产量差异显著（p<0.01），第6d后虫草素产量无显著差异（p<0.05），因此，步骤（6）摇床培养结束后再继续静置培养6d较合理。

本发明通过系统的实验研究，提出了通过添加微量添加物、微量添加剂补料和培养方式的联合策略提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的方法。

本发明优化了腺嘌呤和甘氨酸质量浓度，确定了腺嘌呤补料时间和配置腺嘌呤溶液的经验公式，明确了腺嘌呤补料后摇床+静置培养的策略，使得蛹虫草菌发酵液虫草素产量最高达到956.020µg/ml，比对照提高了535.66%。本发明采用无菌腺嘌呤溶液补料方式，降低了补料时的污染，而且进行了充分的发酵，更有利于虫草素的提取，提供了一套工艺简单、无污染、成本低、虫草素产量提升程度高的生产方法，适合于工业化生产。

附图说明

图1为腺嘌呤对虫草素产量的影响图；

图2为甘氨酸和腺嘌呤质量比对虫草素产量的影响图；

图3为30d内发酵液虫草素、腺嘌呤质量浓度和ph的变化图；

图4为腺嘌呤补料对虫草素产量的影响图；

图5为静置培养对虫草素产量的影响图。

图中：数据标识上的字母为多重检验结果，大写字母均不同表示差异极显著(p<0.01)，小写字母均不同表示差异显著(p<0.05)。

具体实施方式

实施例1；步骤（1）、将蛹虫草菌（cordycepsmilitaris）cgmcc3.4655转接至无菌pda斜面培养基，于20℃、黑暗条件下培养6d、活化3次制得斜面母种。

步骤（2）、从斜面母种取3mm大小菌块，接种至无菌平皿培养基中心位置，平皿培养基培养为：营养琼脂33g与纯净水1000ml混匀，ph7.3，于黑暗、20℃培养9d后制得平板母种；营养琼脂33g的具体组分是：蛋白胨10g、牛肉粉3g、氯化钠5g与琼脂15g。

步骤（3）、用打孔器取平板母种中心的同一半径上3mm大小的6个菌块接种至无菌种子培养基（装载量为300ml/500ml）的三角瓶中，即将6个菌块接种至装载有300ml无菌种子培养基、体积为500ml的三角瓶中，于25℃、黑暗、120r/min摇床培养3d制成种子液；其中种子培养基组方为：葡萄糖30g、蛋白胨8g、酵母粉8g、kh2po41g、ph自然、水1000ml。

步骤（4）、以体积比5%（优化培养基装载量200ml的5%）接种量分别接种种子液至装有无菌优化培养基（装载量为200ml/500ml）的三个三角瓶中，即将10ml的种子液接种至装有200ml无菌优化培养基、体积为500ml的三角瓶中，用无菌聚丙烯袋封住三角瓶瓶口，于黑暗、25℃、160r/min摇床培养12d，制得一份待补料发酵液和两份未补料发酵液；其中优化培养基组方为：葡萄糖35g、蛋白胨17g、腺嘌呤2g、甘氨酸14g、kh2po41g、mgso4·7h2o1g、ph自然、纯净水1000ml。

步骤（5）、测得其中一份未补料发酵液的体积和腺嘌呤剩余量依次为106ml和239.896µg/ml，代入腺嘌呤补料公式可计算出腺嘌呤补料溶液的质量浓度为3.866g/l；

无菌条件下，将质量浓度为3.866g/l、装载量为100ml/150ml的无菌腺嘌呤溶液全部加入步骤（4）装载着待补料发酵液的三角瓶中，制得已补料发酵液。

步骤（6）将已补料和剩余的一份未补料发酵液均置于黑暗、25℃、160r/min的条件下培养6d后，再于黑暗、25℃、静置培养6d，得到大部分菌丝体形态为菌丝球的发酵液。

步骤（7）、将发酵液通过0.22µm滤膜滤除菌丝体，收集发酵滤液，通过反向hplc方法测得已补料发酵滤液的体积和虫草素产量依次为139ml和536.472µg/ml，用规格为100ml的量筒测定未补料发酵滤液体积78ml，利用指标数据校正公式校正虫草素产量。同时，将蛹虫草菌于黑暗、25℃、160r/min、基础培养基条件下发酵6d制得的发酵滤液虫草素含量作为对照；基础培养基组方为：葡萄糖35g、蛋白胨17g、kh2po41g、mgso4·7h2o1g、ph自然、纯净水1000ml。

腺嘌呤补料溶液、聚丙烯袋和各培养基均在0.15mpa条件下灭菌30min。

检测结果显示：对照组发酵滤液虫草素产量测定值为150.398µg/ml，而本实施例制得的发酵滤液虫草素产量校正值达到956.020µg/ml，比对照提高了535.66%。

实施例2；

步骤（1）、同实施例1；

步骤（2）、ph7.2；余同实施例1；

步骤（3）、同实施例1；

步骤（4）、同实施例1；

步骤（5）、测得未补料发酵液的体积和腺嘌呤剩余量依次为95ml和192.286µg/ml，代入腺嘌呤补料公式可计算出腺嘌呤补料溶液的质量浓度为3.717g/l。

步骤（6）与步骤（7），同实施例1。

检测结果显示：对照组发酵滤液虫草素产量测定值为171.231µg/ml，而本实施例制得的发酵滤液虫草素产量校正值达到893.798µg/ml，比对照提高了421.98%。

实施例3；

步骤（1）、同实施例1；

步骤（2）、ph7.4；余同实施例1；

步骤（3）、同实施例1；

步骤（4）、同实施例1；

步骤（5）、测得未补料发酵液的体积和腺嘌呤剩余量依次为115ml和281.632µg/ml，代入腺嘌呤补料公式可计算出腺嘌呤补料溶液的质量浓度为3.976g/l。

步骤（6）与步骤（7），同实施例1。

检测结果显示：对照组发酵滤液虫草素产量测定值为138.601µg/ml，而本实施例制得的发酵滤液虫草素产量校正值达到856.207µg/ml，比对照提高了517.75%。