氟噻唑吡乙酮抗性基因RORP1作为卵菌转化筛选标记的应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种新型的卵菌转化筛选标记。

背景技术：

卵菌主要包括水霉目和霜霉目，可引发多种植物或动物病害。19世纪40年代，卵菌中的致病疫霉(phytophthorainfestans)曾引起爱尔兰饥荒，对欧洲乃至整个世界造成了严重的冲击，对人类文明产生了巨大影响。

卵菌虽然在形态上与真菌非常相似，但是随着分子生物学技术的不断发展，人们逐渐发现，其与真菌及动物的亲缘关系较远(latijnhouwersetal.,2003；jiangandtyler,2012)。除了基因组亲缘关系较远，卵菌与真菌的差别还表现在多个方面(judelson,2005)。例如，在基因组大小方面，卵菌基因组的大小一般在50-250mb之间，而真菌基因组大小通常介于10-40mb；在染色体组成方面，卵菌生活史的主要阶段均为二倍体，而真菌在生活史的营养生长阶段主要以单倍体、双核体或多核体的形式存在；在细胞壁的组成方面，卵菌细胞壁的主要成分是纤维素(β-1,4-葡聚糖)，而真菌细胞壁的主要成分是几丁质(β-1,4-n-乙酰基葡萄糖胺)；在基础代谢方面，卵菌一般不能合成甾醇，甾醇类物质对卵菌营养生长也不是必需的，而真菌体内可以合成甾醇，其甾醇合成终产物麦角甾醇对真菌的生存具有重要意义。

卵菌与真菌之间的多种差异，尤其是因为卵菌主要以二倍体的形式存在，导致真菌中常用的通过基因重组对靶标基因进行敲除的方法很难在卵菌中应用。

在卵菌基因敲除体系建立之前，人们通常通过向卵菌生物体内引入外源片段来实现靶标基因的沉默或过表达。但是该方法由于沉默/过表达效率不可控、转化子不稳定、外源片段易丢失等问题，使其在实际应用中受到很大的限制。lamour等在2006年首先在大豆疫霉中建立tilling(targetedinducedlocallesionsingenomes)体系，但是由于tilling技术存在靶向性不强且卵菌基因冗余造成的筛选难度系数高等问题，限制了其在基因功能研究中的广泛应用(陈孝仁和王源超,2012)。锌指核酸酶(zfns)、类转录激活因子效应物核酸酶(talens)等工程核酸酶相关技术的发展也为基因的定点突变奠定了基础，但是由于操作复杂、成本高等原因受到应用限制。近期发展起来的crispr(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsequences)基因编辑技术为基因功能的研究提供了有力工具。2016年，brettm.tyler教授课题组利用crispr技术验证了效应因子avr4/6在大豆疫霉和寄主互作过程中的功能(fangandtyler,2016)。在具体操作过程中，crispr技术的大致步骤如下：首先根据靶标基因设计向导rna(sgrna)，构建sgrna表达载体，同时构建cas9蛋白表达载体和同源臂载体，最后通过原生质体转化的手段将三个载体同时导入靶标菌，对靶基因进行敲除。

对于植物病原卵菌的基因功能研究，常用的转化方法包括peg-cacl2介导的原生质体转化法、电击转化法、基因枪法和农杆菌转化法(cvitanichandjudelson,2003；judelsonetal.,1991；vijnandgovers,2003)。其中以peg-cacl2介导的原生质体转化法应用最为广泛。无论何种方法，其中很关键的一步就是对转化子的筛选，转化子的筛选效率以及获得的疑似转化子的阳性率对于实验的成败至关重要。但是目前卵菌中可利用的筛选标记非常有限，唯一的可靠筛选标记是nptⅱ基因，其编码的蛋白可赋予卵菌对遗传霉素(g418)的抗性，从而使转化子被筛选出来。但是nptii用于crispr/cas9基因敲除体系时，因携带该标记的转化子具有了g418抗性而不能被再次利用进行回补实验；由于筛选标记的限制，对于获得的具有g418抗性的敲除转化子其他基因的再敲除仍难以实现；另外，nptⅱ基因作为筛选标记用于一些卵菌如辣椒疫霉(phytophthoracapsici)的遗传转化时，存在筛选效率低等问题。因此，开发新型卵菌转化筛选标记，对于卵菌基因功能的研究具有重要意义。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种新型的卵菌转化筛选标记——氟噻唑吡乙酮抗性基因rorp1，以及其作为卵菌转化筛选标记，在进行卵菌转化时的应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

氟噻唑吡乙酮是杜邦公司开发的一类全新的、对卵菌具有超高活性的杀菌剂，其在卵菌中的靶标蛋白是氧化固醇结合蛋白1(orp1)。研究发现，在辣椒疫霉中靶标蛋白orp1第769位氨基酸的突变(g769w)，可引起辣椒疫霉对氟噻唑吡乙酮产生300倍以上的抗性(miaoetal.,2016)。本发明尝试利用卵菌对该类杀菌剂的抗药性，以编码该突变蛋白的基因(rorp1)作为卵菌转化时的筛选标记，用于卵菌遗传转化实验。

本发明提供一种氟噻唑吡乙酮抗性基因作为卵菌转化筛选标记的应用。

其中，所述氟噻唑吡乙酮抗性基因编码辣椒疫霉中靶标蛋白rorp1，使其相对于野生型蛋白orp1，在第769位发生氨基酸的突变(g769w)，由甘氨酸突变为色氨酸。并将该抗性基因(也可称为抗性标记基因)作为新型的卵菌转化筛选标记rorp1。

所述氟噻唑吡乙酮抗性基因具体可为如下1)或2)或3)的dna分子：

1)如seqidno.1所示的dna分子；

2)在严格条件下与1)限定的dna序列重组且编码与氟噻唑吡乙酮抗性相关蛋白，并可引起卵菌对氟噻唑吡乙酮产生300倍以上抗性的dna分子；

3)与1)或2)限定的dna序列具有90％以上同源性且编码与氟噻唑吡乙酮抗性相关蛋白，并可引起卵菌对氟噻唑吡乙酮产生300倍以上抗性的dna分子。

可选的，所述筛选标记rorp1通过pcr扩增的方法，在orp1基因(野生型敏感基因)cds序列的第2305位引入g到t的碱基突变而获得。

在本发明的具体实施方式中，通过设计引物，以野生型辣椒疫霉菌株cdna为模板，分前后两个部分扩增辣椒疫霉orp1基因片段，通过in-fusion连接的方法获得定点突变的氟噻唑吡乙酮抗性基因(rorp1)，同时将抗性基因连入于pbluescriptiiks+载体(可购自stratagene公司)以大量克隆所述筛选标记rorp1。具体技术方案如下：

(1)利用限制性内切酶ecorv酶切pbluescriptiiks+载体，利用商业化的胶回收试剂盒回收线性化载体片段；

(2)以辣椒疫霉野生型菌株cdna为模板，设计引物，利用全式金高保真酶fastpfumix分段扩增pcorp1基因cds序列，在引物中引入突变位点，前部片段扩增引物为muorp1-1f(序列：atcgataagcttgatatgcaggcgcttcaggac)和muorp1-1r(序列：aacacgcacaggccacttgttggtgttgagcatag)，后部片段扩增引物为muorp1-2f(序列：tggcctgtgcgtgttacgttccctgacgcggat)和muorp1-2r(序列：ctgcaggaattcgatctaatgcccagccgaact)，利用商业化的胶回收试剂盒回收扩增产物片段；

(3)利用takara商业化in-fusionhd重组酶将步骤(1)和步骤(2)胶回收产物连接，实现抗性标记rorp1基因的插入，获得带有该抗性标记的载体(pb-rorp1)；

(4)将连接产物转入大肠杆菌感受态trans1-t1，涂于含氨苄青霉素的lb平板，挑取单菌落后利用通用引物m13f和m13r进行扩增，阳性菌落经测序验证后，于lb液体培养基摇培，并利用商业化的试剂盒小量提取质粒。

在上述构建方法中，步骤(1)载体可选择其他载体(例如全式金公司的peasy-t1载体等)，线性化载体所使用的限制性内切酶也可以对应载体上其他酶切位点。

在上述构建方法中，步骤(2)所用的引物muorp1-1f和muorp1-2r与线性化载体两端的微同源序列需要根据步骤(1)载体或内切酶的变化而改变。前部片段代表突变位点之前的片段，后部片段代表突变位点之后的片段。

在上述构建方法中，步骤(3)也可以选择其他公司具有相同功能的重组酶。

在上述构建方法中，步骤(4)lb平板抗生素的选择需要根据载体上所带有的抗生素抗性基因(如氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因等)而确定。

进一步地，本发明所述的应用具体为：将所述氟噻唑吡乙酮抗性基因连入含有卵菌通用启动子的转化载体，用于卵菌遗传转化的筛选。

其中，所述卵菌通用启动子可为来自莴苣霜霉(bremialactucae)的ham34或hsp70。

更为具体地，所述应用为：将所述筛选标记连入卵菌crispr/cas9体系的sgrna表达载体，或是卵菌转化时所用的其他相关载体(如卵菌基因沉默、过表达常用的ptor载体，亚细胞定位所用的pgfpn载体，亦或是根据特殊目的自行构建的用于卵菌转化的其他载体)，以该标记进行卵菌遗传转化时转化子的筛选，或以该标记进行卵菌其他抗性标记筛选获得的基因敲除转化子的基因回补实验中的筛选，或以该标记进行卵菌其他抗性标记筛选获得的基因敲除转化子的其他靶标基因的再敲除的转化筛选。

其中，所述其他筛选标记基因可为现有技术中常用的nptii基因，但并不排除随着研究发展而开发的其他筛选标记基因。本发明所提供的新的筛选标记弥补了现有技术中筛选标记基因单一的不足。但无论是其单独作为筛选标记，还是与其他筛选标记组合使用，以进行更为复杂的基因工程实验(多步敲除或回补实验等)，均属于本发明的保护范围。

进一步地，本发明以辣椒疫霉pcdhcr7基因敲除转化子的回补实验为例，说明所述筛选标记(rorp1)的具体应用如下：

s1、采用已报道的方法将辣椒疫霉bya5菌株的pcdhcr7基因替换为传统的筛选标记基因nptⅱ，获得辣椒疫霉pcdhcr7基因敲除转化子。

s2、以nptⅱ为靶基因，http://grna.ctegd.uga.edu/在线设计sgrna(sgrna序列：ccatcatggctgatgcaatg)，将sgrna连入sgrna表达载体pyf2.3g-ribo-sgrna(已发表载体，fangandtyler,2016,efficientdisruptionandreplacementofaneffectorgeneintheoomycetephytophthorasojaeusingcrispr/cas9)，得到靶向nptⅱ基因的sgrna表达载体(pyf2.3g-n)。

s3、将所述筛选标记rorp1连入上述sgrna表达载体，实现筛选标记rorp1替换原sgrna表达载体中的gfp基因，使筛选标记rorp1被强启动子ham34启动，获得带有筛选标记rorp1的sgrna表达载体。具体步骤如下：

(1)利用限制性内切酶claⅰ和apaⅰ酶切构建的上述sgrna表达载体(pyf2.3g-n)，将gfp基因切除，利用商业化的胶回收试剂盒回收线性化载体片段；

(2)以含有筛选标记rorp1的载体质粒(pb-rorp1)为模板，设计引物muorp1f(序列：atatcaagcttatcgatatgcaggcgcttcaggac)和muorp1r(序列：taggctccggaaccgggcccctaatgcccagccgaact)，利用高保真酶fastpfumix扩增抗性基因，同时在抗性基因两侧引入步骤(1)线性化载体的微同源序列，利用商业化的胶回收试剂盒回收pcr产物；

(3)利用takara商业化in-fusionhd重组酶将步骤(1)和步骤(2)获得的胶回收产物连接，实现抗性基因替换原来sgrna表达载体中的gfp基因，获得带有筛选标记rorp1的sgrna表达载体(pyf2.3g-rorp1-n)；

(4)将连接产物转入大肠杆菌感受态trans1-t1，涂于含氨苄青霉素的lb平板，挑取单菌落，设计引物resgf(序列：actcgcccacgatcggaagg)和resgr(序列：cacaaaatctgcaacttcgc)进行扩增，阳性菌落经测序验证后，于lb液体培养基摇培，并利用商业化的试剂盒大量提取质粒。

在上述构建方法中，酶切载体还可以是靶向其他基因的sgrna表达载体或sgrna表达载体衍生物。

在上述构建方法中，步骤(2)还可以利用其他带有同样氟噻唑吡乙酮抗性基因rorp1的载体质粒或cdna为模板。

在上述构建方法中，步骤(3)也可以选择其他公司具有相同功能的重组酶。

在上述构建方法中，步骤(4)质粒的提取步骤依据质粒试剂盒所提供的方法。

s4、以s1所述的辣椒疫霉pcdhcr7基因敲除转化子kd1-1为实验材料，获得原生质体，通过peg-cacl2介导的方法向原生质体中同时转入带有氟噻唑吡乙酮抗性基因的载体(pyf2.3g-rorp1-n)、cas9蛋白表达载体和同源臂载体；经筛选获得阳性转化子。

所述筛选方法具体为：

18℃黑暗条件下使原生质体再生1天，利用氟噻唑吡乙酮进行转化子的第一次筛选，25℃黑暗条件下培养3天，利用氟噻唑吡乙酮进行第二次筛选，继续在25℃黑暗条件下培养2-3天，待菌落长出后将菌落转接至含有氟噻唑吡乙酮的带药v8平板，进行第三次筛选。

为保证转化子筛选效率及转化子的阳性率，第一次、第二次和第三次筛选转化子时氟噻唑吡乙酮在培养基中的浓度最好介于0.005-0.25μg/ml之间。

经过二次筛选获得的转化子菌落均能在第三次筛选时长出，且经过三次筛选获得的转化子均含有该筛选标记rorp1基因，说明筛选阳性率为100％。

本发明所提供的筛选标记rorp1抗药性基因来源于辣椒疫霉敏感菌株orp1基因cds序列，不包含任何内含子，该基因包括2874个核苷酸，可编码957个氨基酸。通过pcr扩增的方法向orp1基因cds序列中引入核苷酸的突变，即将敏感型基因cds序列的第2305位的g突变为t，对应的，该基因所编码的蛋白由自n端第769位氨基酸由甘氨酸突变为色氨酸。

所述卵菌包括辣椒疫霉(phytophthoracapsici)、大豆疫霉(phytophthorasojae)和荔枝霜疫霉(peronophythoralitchii)等。本发明以辣椒疫霉为例，说明该筛选标记的应用方式和应用效果，同时在大豆疫霉和荔枝霜疫霉的转化实验中，也实现了良好的应用效果。

上述位点的突变仅是引起卵菌对该类杀菌剂(ptis)产生抗药性的一种情况，筛选标记若为能引起该类杀菌剂抗药性的带有其他突变位点的或其他卵菌的orp1基因也属于本发明的保护范围。

本发明的有益效果在于：

本发明获得的改造载体因携带有氟噻唑吡乙酮抗性基因rorp1的筛选标记，从而可以用于辣椒疫霉转化时转化子的筛选，同时，该标记也可以应用于大豆疫霉、荔枝霜疫霉等其他卵菌的遗传转化，且转化子筛选阳性率均为100％。该抗药性基因作为筛选标记用于卵菌的遗传转化实验，以氟噻唑吡乙酮作为筛选药剂，具有筛选效率高、筛选阳性率高、应用范围广、成本低等显著优点，同时，该筛选标记的开发解决了卵菌转化时筛选标记单一等问题，为卵菌转化时基因回补、基因多敲除等方面的工作提供了有力保障。

附图说明

图1为通过pcr扩增获得辣椒疫霉抗氟噻唑吡乙酮基因rorp1的过程。a：氟噻唑吡乙酮敏感基因orp1cds区域；b：带有抗性突变位点的氟噻唑吡乙酮抗性基因rorp1前部片段；c：带有抗性突变位点的氟噻唑吡乙酮抗性基因rorp1后部片段；d：带有抗性突变位点的氟噻唑吡乙酮抗性基因rorp1；a：引物muorp1-1f；b：引物muorp1-1r；c：引物muorp1-2f；d：引物muorp1-2r。

图2为辣椒疫霉pcdhcr7基因回补情况pcr验证。泳道1-18为氟噻唑吡乙酮筛选获得的转化子；泳道19为pcdhcr7基因敲除转化子kd1-1；泳道20为野生型菌株bya5；泳道21为空白对照ck。其中，泳道11、13和15是pcdhcr7基因回补成功的转化子。

图3为以rorp1为筛选标记获得辣椒疫霉疑似回补转化子时菌落生长情况。a：以浓度为0.2μg/ml氟噻唑吡乙酮的v8培养基进行第二次筛选3d后菌落生长情况；b：将经过第二次筛选长出的菌落转接至浓度为0.25μg/ml氟噻唑吡乙酮的v8培养基2d后菌落生长情况。

图4为以rorp1为筛选标记获得的辣椒疫霉疑似回补转化子抗性基因验证结果。泳道1-22为以rorp1为筛选标记获得的疑似转化子；泳道23为pcdhcr7基因敲除转化子kd1-1；泳道24为空白对照ck。

图5为以rorp1为筛选标记获得大豆疫霉转化子时菌落生长情况。a：以含有0.01μg/ml氟噻唑吡乙酮的v8培养基进行第二次筛选3d后菌落生长情况；b：将经过第二次筛选长出的菌落转接至含有0.01μg/ml氟噻唑吡乙酮的v8培养基3d后菌落生长情况。

图6为以rorp1为筛选标记获得的大豆疫霉转化子抗性基因验证结果。泳道1-22为以rorp1为筛选标记获得的转化子；泳道23为大豆疫霉野生型菌株；泳道24为空白对照ck。

图7为以rorp1为筛选标记获得荔枝霜疫霉转化子时菌落生长情况。a：以含有0.01μg/ml氟噻唑吡乙酮的v8培养基进行第二次筛选3d后菌落生长情况；b：将经过第二次筛选长出的菌落转接至含有0.01μg/ml氟噻唑吡乙酮的v8培养基3d后菌落生长情况。

图8为以rorp1为筛选标记获得的荔枝霜疫霉转化子抗性基因验证结果。泳道1-22为以rorp1为筛选标记获得的转化子；泳道23为荔枝霜疫霉野生型菌株；泳道24为空白对照ck。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中使用的菌株信息：辣椒疫霉野生型菌株bya5，采自中国甘肃地区；辣椒疫霉基因敲除转化子kd1-1，以野生型菌株bya5为亲本获得的pcdhcr7基因敲除的转化子，其pcdhcr7基因被外源基因nptii所取代；大豆疫霉野生型菌株p6497，是经过基因组测序的标准菌株，由美国brettm.tyler教授实验室馈赠；荔枝霜疫霉野生型菌株pelzb2-4，采自中国广东地区。

以上菌株仅为本发明在实施例所使用的材料，事实上，在应用本发明所述筛选标记时，可使用任何商购途径获得的卵菌菌株。

上述菌株均已经过现有的形态学和分子生物学方法鉴定。

下述实施例中所使用的筛选药剂：96.7％氟噻唑吡乙酮原药，由杜邦公司提供。药剂以二甲基亚砜配成相应浓度的母液，以千倍稀释的方法加入培养基中。

实施例1、筛选标记rorp1在辣椒疫霉基因回补中的应用

由于上述质粒改造时所用的sgrna表达载体(pyf2.3g-n)表达的sgrna可靶向nptii基因，故该载体可用于上述辣椒疫霉pcdhcr7基因敲除转化子的回补。

构建pcdhcr7基因回补所需的同源臂载体；同时改造cas9蛋白表达载体pyf2-psnls-hspcas9(已发表载体，fangandtyler,2016,efficientdisruptionandreplacementofaneffectorgeneintheoomycetephytophthorasojaeusingcrispr/cas9)，利用限制性内切酶ecori酶切pyf2-psnls-hspcas9载体，去除nptii基因及其启动子和终止子，之后经t4连接酶连接，获得不含nptii基因的cas9蛋白表达载体，命名为pyf2-cas9ei。利用商业化的试剂盒大量提取回补同源臂载体和pyf2-cas9ei载体。

以上述辣椒疫霉pcdhcr7基因敲除转化子kd1-1为实验材料，参考fang等方法获得原生质体，通过peg-cacl2介导的方法向原生质体中同时转入带有氟噻唑吡乙酮抗性基因的载体(pyf2.3g-rorp1-n)、cas9蛋白表达载体(pyf2-cas9ei)和同源臂载体。

18℃黑暗条件下使原生质体再生1天，利用氟噻唑吡乙酮进行转化子的第一次筛选，25℃黑暗条件下培养3天，利用氟噻唑吡乙酮进行第二次筛选，继续在25℃黑暗条件下培养2-3天，待菌落长出后将菌落转接至含有氟噻唑吡乙酮的带药v8平板，进行第三次筛选。

上述实验过程优选的参数如下：

为保证转化子筛选效率及转化子的阳性率，第一次、第二次和第三次筛选转化子时氟噻唑吡乙酮在培养基中的浓度最好介于0.005-0.25μg/ml之间。

经过三次筛选获得的转化子转接至铺有玻璃纸的v8平板，菌落长出后收集菌丝，提取dna，设计引物redf(序列：agcgatccagaccgagcgatttcac)和redr(序列：ttacaggatctttggcaggatg)对筛选获得的转化子进行pcr扩增，以验证基因回补情况，并以敲除转化子kd1-1作为阴性对照，以野生型菌株bya5作为阳性对照。

设计引物resgof(序列：actcgcccacgatcggaagg)和resgor(序列：ctaatgcccagccgaactgc)对筛选获得的转化子抗性标记进行扩增，并以敲除转化子kd1-1作为阴性对照。

经过二次筛选获得的转化子菌落均能在第三次筛选时长出，且经过三次筛选获得的转化子均含有该筛选标记rorp1基因，说明筛选阳性率为100％。

实施例2、筛选标记rorp1在大豆疫霉遗传转化中的应用

为扩大该筛选标记的应用范围，将上述带有氟噻唑吡乙酮抗性基因的质粒(pyf2.3g-rorp1-n)转入大豆疫霉原生质体，以验证本发明所述筛选标记是否可应用于大豆疫霉遗传转化时转化子的筛选，以及该筛选标记用于大豆疫霉遗传转化时的工作效率。

具体操作过程如下：

以大豆疫霉野生型菌株为实验材料，参考fang等方法获得原生质体，向原生质体中转入带有氟噻唑吡乙酮抗性基因的载体(pyf2.3g-rorp1-n)。

18℃黑暗条件下使原生质体再生1天，利用氟噻唑吡乙酮进行转化子的第一次筛选，25℃黑暗条件下培养3天，利用氟噻唑吡乙酮进行第二次筛选，继续在25℃黑暗条件下培养2-3天，待菌落长出后将菌落转接至含有氟噻唑吡乙酮的带药v8平板，进行第三次筛选。

为保证转化子筛选效率及转化子的阳性率，第一次、第二次和第三次筛选转化子时氟噻唑吡乙酮在培养基中的浓度最好介于0.005-0.1μg/ml之间。

经过三次筛选获得的转化子转接至铺有玻璃纸的v8平板，菌落长出后收集菌丝，提取dna，利用引物resgof(序列：actcgcccacgatcggaagg)和resgor(序列：ctaatgcccagccgaactgc)对筛选获得的转化子抗性标记进行扩增，并以大豆疫霉野生型菌株作为阴性对照。

经过二次筛选获得的转化子菌落均能在第三次筛选时长出，且经过三次筛选获得的转化子均含有该筛选标记rorp1基因，说明该标记应用于大豆疫霉遗传转化时，筛选阳性率为100％。

实施例3、筛选标记rorp1在荔枝霜疫霉遗传转化中的应用

为进一步证实该筛选标记的应用范围，将上述带有氟噻唑吡乙酮抗性基因的质粒(pyf2.3g-rorp1-n)转入荔枝霜疫霉原生质体，以验证本发明所述筛选标记是否可应用于荔枝霜疫霉遗传转化时转化子的筛选，以及该筛选标记用于荔枝霜疫霉遗传转化时的工作效率。

具体操作过程如下：

以荔枝霜疫霉野生型菌株为实验材料，参考fang等方法获得原生质体，向原生质体中转入带有氟噻唑吡乙酮抗性基因的载体(pyf2.3g-rorp1-n)。

18℃黑暗条件下使原生质体再生1天，利用氟噻唑吡乙酮进行转化子的第一次筛选，25℃黑暗条件下培养3天，利用氟噻唑吡乙酮进行第二次筛选，继续在25℃黑暗条件下培养2-3天，待菌落长出后将菌落转接至含有氟噻唑吡乙酮的带药v8平板，进行第三次筛选。

为保证转化子筛选效率及转化子的阳性率，第一次、第二次和第三次筛选转化子时氟噻唑吡乙酮在培养基中的浓度最好介于0.005-0.1μg/ml之间。

经过三次筛选获得的转化子转接至铺有玻璃纸的v8平板，菌落长出后收集菌丝，提取dna，利用引物resgof(序列：actcgcccacgatcggaagg)和resgor(序列：ctaatgcccagccgaactgc)对筛选获得的转化子抗性标记进行扩增，并以敲除转化子kd1-1作为阴性对照。

经过二次筛选获得的转化子菌落均能在第三次筛选时长出，且经过三次筛选获得的转化子均含有该筛选标记rorp1基因，说明该标记应用于荔枝霜疫霉遗传转化时，筛选阳性率为100％。

应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业大学

<120>氟噻唑吡乙酮抗性基因rorp1作为卵菌转化筛选标记的应用

<130>khp171116893.7

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2874

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgcaggcgcttcaggacgcgcaacagcgcttcaatgacctcgtgaataatgactggccg60

gaacgagtacctgtcgagtccatgccggactacgacccgacttacatgaaggaaggcttc120

ttgcagaagaaaggacagagactgaaaggctggaaacgccgctggtttgtctgtgacgga180

cgtacactgtcctactacatttccaggaaggaccgtaagcctaatgctgtcatccccttg240

gaaggatgcaccgtgcaggacggaggcctgagtgagacgtggaactcgcctcgtatctac300

ctgacggaccccgccactggcatcatgtactgcctgtcagctgaagaagggattgtagtc360

actcagtggctcgatgtccttcgagtggcagtggctcgtgttaataatggtacagcagct420

actgattcaagtgcagctccgtcatcgcagagctccagtcacaacaggacaaggcagcag480

gccaggacgcaggctcagagactcccgtcgtcgtcggatgatgaagattctcgtgcgcat540

ttaaagcgcgcagcatccctgggaccgtcacaggcacgtacaactacgttgaagtcggct600

tcgtcggctgtggtcagttccagtgcaggcaattccacgtcgaatggagatgggaaacgt660

tctacaaggatgacgtcggccccgtcagcagttaccacctcaaacagtaattcacagcac720

actcaacaccaccgtgttcaccgcacgaagactcagcgtctacctacgacgatttcactg780

gagaacgagctctcgcatggcttggatgtgctggaggcgctgctgtgtggccacagtgcg840

acgcgatcttcgtcttcactccgcaatcacgtcgtgtttcggcctattggcgcggtgaat900

ggtgttttacgcagcattggaacagattcgagttctgggaagcaatacgcacgtgctagt960

gtggtgctcccggtgtcttcagaagtagcggcgattctactggctgaccatgcgcgcaga1020

gctgaatgggacgtgcattttcctcaatcggcacatgttgctacattcgatgacgcgacg1080

aatctcgtgcatttgtcaagtggaagctttgcccagatccaacagaccaagccaattgtg1140

gctcctcatgtggctgctgctgcgtgtgccttgtgtgcagcactcttctctggtgcttca1200

tcttgggaggcgctgctgactgcgatgatctacgctgcagccgttggtggtatcgtgagt1260

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