一种检测人葡萄膜黑色素瘤细胞的核酸适体的制作方法

本发明涉及一种核酸适体及其应用，特别是涉及一种可用于人葡萄膜黑色素瘤细胞及临床样本组织检测的核酸适体及其制备检测试剂的应用方法。

背景技术：

葡萄膜恶性黑色素瘤(uvealmelanoma)是成年人中最常见的一种眼内恶性肿瘤，在国外其发病率占眼内肿瘤的首位，在国内则仅次于视网膜母细胞瘤，居眼内肿瘤的第二位。尽管在过去的几十年内葡萄膜黑色素瘤诊断及治疗有新进展，但其预后仍然很差，大约有31%的病人在诊断后5年内由于葡萄膜黑色素瘤而死亡，25年后将有半数的病人死亡。患者中常见转移，肝脏是最容易转移的部位。葡萄膜黑色素瘤患者10年累计转移率达34%。一旦发现转移，um病人的平均生存期只有仅仅6到8个月因此，临床上迫切需要采取新的方法和手段诊断和治疗葡萄膜黑色素瘤患者，提高患者的生存期。

核酸适体（aptamer)是从人工合成的随机单链核酸库中筛选出来的能高亲和性结合靶分子的的寡聚核苷酸，包括dna适体和rna适体。适体因其结构的多样性而具有靶分子广、亲和力高、特异性强等特点。同时，相比传统抗体，适体分子量小、易改造修饰、制备方便且无免疫原性，因此，适体在基础研究、临床诊断、药物研制等方面展现了广阔的应用前景。利用这些适体对其所结合的细胞表面的靶分子进行表征和检测，有助于发现新的生物标志物，用于肿瘤的诊断。适体还可作为靶向配体与药物直接结合形成靶向药物传递体系，也可作为靶向基团修饰到药物载体表面，从而实现药物的靶向传递，为提高药物的临床疗效提供了一种可行的方法．同时，有些核酸适体本身也具有生物功能活性，能够抑制肿瘤细胞的增殖和转移，如as1411。

技术实现要素：

发明人利用核酸适体筛选技术（cell-selex），针对葡萄膜恶性黑色素瘤黑色素瘤细胞(ocm-1）进行筛选。所用的筛选初始文库总长度为61个碱基，包括两端固定的18个碱基的pcr引物序列，和中间25个碱基组成的随机序列。筛选过程中，前两轮只进行正向筛选，在第三轮开始加入负筛细胞，经过多轮的筛选，富集序列终于与葡萄膜黑色素瘤细胞有非常好的结合能力，同时特异性也非常强。之后将第7轮的富集序列进行了高通量测序，并对结果进行同源家族分析和比对之后，最终挑选出了核酸适体zh-12。zh-12表现出了与人葡萄膜黑色素瘤细胞的高亲和性以及特异性。在小鼠活体肿瘤实验中，尾静脉注射30分钟时后，在肿瘤位置既开始富集，60分钟时后富集信号达到最强，180分钟时后肿瘤位置仍有信号，表明该核酸适体在复杂环境中仍能保持良好的识别能力，并且保持高度的组织特异性。这表明该适配体适合进行人葡萄膜黑色素瘤细胞表征和检测，以及今后癌症靶标分子的寻找以及后续靶向治疗的应用。

本发明的目的提供一种高度特异性、稳定性、可用于人葡萄膜黑色素瘤细胞检测的核酸适体及在其制备检测试剂的应用方法。具体提供的技术方案如下：

一种检测人葡萄膜黑色素瘤细胞的核酸适体，包含如下序列：

5’-tatcgggttggtaggggttggttga-3’，

其中5`端另有0至18任意一数值的核苷酸，3`端另有0至18任意一数值的核苷酸。优选地，其中5`端另有18个核苷酸，3`端另有18个核苷酸。

更优选为：

5’-atccagagtgacgcagcatatcgggttggtaggggttggttgatggacacggtggcttagt-3’，

上述适体的末端连接有荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或者酶标记。优选为cy5标记。

此外，还提供上述的检测人葡萄膜黑色素瘤细胞的核酸适体可以用于检测人葡萄膜黑色素瘤或其细胞，因而本发明还提供上述的检测人葡萄膜黑色素瘤细胞的核酸适体可以用于在制备检测人葡萄膜黑色素瘤或其细胞的制剂中的用途。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明通过筛选得到的核酸适体无免疫原性；能够体外化学合成，分子量小，可以对不同部位进行修饰和取代，且序列稳定，易于保存；便于标记等优势。采用本发明的核酸适体进行人葡萄膜黑色素瘤或其细胞检测时，操作更为简单、迅速，并且本发明核酸适体的合成成本较抗体制备成本低，且周期短，重现性好。

附图说明

图1为cell-selex的流程示意图（a）以及实验筛选进程图(b,c)；

图2为通过分析高通量测序结果后，挑选出几条具有代表性的序列与ocm-1的结合情况；

图3人葡萄膜黑色素瘤细胞在经过蛋白酶k以及胰酶处理之后，zh-12与人葡萄膜黑色素瘤细胞的结合情况(a);以及计算了zh-12与ocm-1细胞的亲和力常数（b）；

图4为cy5标记的zh-12与人葡萄膜黑色素瘤细胞成瘤裸鼠的结合情况。

具体实施方式

以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定于本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，实验材料如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买所得到的。

细胞来源：

本实验所用到的细胞系人葡萄膜黑色素瘤细胞（ocm-1）来自温州医学部附属眼视光科医院，葡萄膜黑色素永生化细胞（uc）由复旦大学附属眼耳鼻喉科医院进行构建。

实施例1：人葡萄膜黑色素瘤细胞（ocm-1）特异性核酸适体的筛选

(1)所用核酸文库和引物的设计：

随机核酸文库：

5’-atccagagtgacgcagca(n25)tggacacggtggcttagt-3’

上游引物：5’-异硫氰酸荧光素-atccagagtgacgcagca--3’；

下游引物：5’-生物素-tggacacggtggcttagt-3’。

(2)正筛选：

2.1孵育：用结合缓冲液（d-pbs，5mm氯化镁）溶解上述的随机核酸文库，95℃恒温变性5分钟，迅速放入冰中，静置10分钟；然后与已经培养和预处理好的人葡萄膜黑色素瘤细胞（ocm-1）在4℃孵育1小时。

2.2解离：孵育完成后移除孵育培养皿中溶液，用洗涤缓冲液（pbs，含0.45%的葡萄糖，5mm氯化镁）洗涤孵育培养皿中的细胞；用1ml无菌水刮取孵育培养皿中细胞，置于1.5ml离心管，95℃加热变性10分钟，5500转每秒离心后取上清，分离结合ocm-1细胞的核酸序列，即为ocm-1细胞的第一轮筛选的核酸文库。

(3)进行pcr扩增文库：取步骤（2）中筛选所得的核酸文库进行常规pcr扩增，上游引物：5’-异硫氰酸荧光素-atccagagtgacgcagca--3’；下游引物：5’-生物素-tggacacggtggcttagt-3’；扩增条件为：95℃，3分钟；95℃，30秒；56℃，30秒，72℃，30秒，经合适循环轮数，72℃，5min。第一轮筛选后将全部所得的ocm-1细胞的第一轮筛选的核酸文库进行预扩增8个循环，然后以扩增产物为模板再进行大量扩增。

(4)制备dna单链文库：用链霉亲和素葡聚糖微球分离生物素标记步骤（3）中的pcr扩增产物；然后利用0.2m氢氧化钠使双链dna变性解链，收集异硫氰酸荧光素标记的dna单链文库。

(5)反筛：将步骤（4）所得到的dna单链文库与非靶细胞uc细胞株孵育，然后收集细胞孵育后的上清，即排除掉非特异性结合的核酸序列。

(6)正筛：将步骤（5）中所制上清液与靶细胞孵育，洗脱保留结合靶细胞的核酸序列，即为第二次筛选的核酸文库。

(7)核酸适体循环筛选：以步骤（6）所得的核酸文库取代步骤（2）所得到的扩增产物，并重复步骤（4）～（6）的筛选过程，直到筛选得到与靶细胞ocm-1细胞株结合能力强的核酸文库。

(8)将筛选获得的最终核酸文库进行高通量测序，从高通量测序结果中挑选出5条富集程度较高的链，分别命名为zh-1，zh-5，zh-6，zh-9，zh-12，其中zh-12的序列为：5’-atccagagtgacgcagcatatcgggttggtaggggttggttgatggacacggtggcttagt-3’。再利用流式细胞术检测所挑选出的dna序列与靶细胞ocm-1细胞株结合选择性和亲和性，确定核酸适体。

以上所述筛选流程，如图1所示。

实施例2：鉴定与ocm-1细胞系特异性结合能力最强的序列

首先，用0.2%edta将贴壁状态的ocm-1细胞从培养皿上消化下来，分别将细胞收集到离心管中，并用洗涤缓冲液（pbs，含0.45%的葡萄糖，5mm氯化镁）离心洗涤几次；其次，将终浓度为200nm的5条序列以及随机文库分别加入到结合缓冲液（d-pbs，含0.45%的葡萄糖，5mm氯化镁，100mg/ltrna，1g/lbsa）浸泡的ocm-1细胞中；然后放置于4℃摇床孵育30min；孵育完成之后并用洗涤缓冲液（pbs，含0.45%的葡萄糖，5mm氯化镁）离心洗涤一次，并通过流式细胞仪进行荧光检测（结果见图2）。检测结果显示zh-12与ocm-1细胞结合能力最强。

实施例3：靶标类型鉴定以及其对ocm-1细胞的亲和力测定

首先，取3个已接皿24小时的ocm-1细胞皿，分别用0.2%edta，胰酶，蛋白酶k将细胞从培养皿上消化下来（其中0.2%edta消化1分钟，胰酶和蛋白酶k消化5分钟），再用离心管分别收集起来（edta消化的细胞分装2管，胰酶和蛋白酶k消化的细胞各一管），之后用洗涤缓冲液（pbs，含0.45%的葡萄糖，5mm氯化镁）离心洗涤，然后向细胞加入200nm的zh-12，另外的一管edta消化的细胞中加入200nm的随机文库，放置在4℃摇床中孵育30min，孵育完毕后用洗涤缓冲液离心洗涤一次，最后用流式细胞仪进行荧光信号检测（结果如图3a）。流式细胞仪的结果显示，经过蛋白酶k以及胰酶处理之后zh-12与ocm-1的结合量会有所下降，说明zh-12结合在ocm-1细胞膜表面的蛋白上。

将得到的核酸适体zh-12，分别配置终浓度为0nm、20nm、40nm、60nm、80nm、100nm、120nm、140nm、160nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm的溶液，与2×10⁵个ocm-1细胞进行冰上孵育30分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤一次，用流式细胞仪测定细胞表面的荧光强度。如细胞能结合荧光标记的核酸适体，则以荧光强度对探针浓度作图，用公式y＝bmaxx/（kd+x）计算核酸适体的平衡解离常数kd（结果如图3b）,。结果表明，核酸适体的平衡解离常数均在纳摩尔范围内。

实施例4：cy5标记的核酸适体在体内靶向中的应用测试

购买五周裸鼠，待裸鼠适应新环境后，每只裸鼠皮下注射2千万个ocm-1细胞，使裸鼠成瘤，约2周裸鼠长成瘤。通过尾静脉注射的方法，给裸鼠注射cy5标记的zh-12和文库8nmol，一定时间后，用小动物成像仪进行拍照观察。结果如图4所示，尾静脉注射30分钟时后，在肿瘤位置既开始富集，60分钟时后富集信号达到最强，180分钟时后肿瘤位置仍有信号，表明该核酸适体在复杂环境中仍能保持良好的识别能力，并且保持高度的组织特异性。

<110>湖南大学，中南大学湘雅二医院

<120>一种检测人葡萄膜黑色素瘤细胞的核酸适体

<160>2

<210>1

<211>25

<212>dna

<400>1

tatcgggttggtaggggttggttga25

<210>2

<211>61

<212>dna

<400>2

atccagagtgacgcagcatatcgggttggtaggggttggttgatggacacggtggcttagt61