与肝癌标志物GPC3相关的亲和肽的制作方法

本发明属于生物工程制药技术领域和蛋白质多肽类药物及生物医学工程领域，具体涉及针对肝癌特异性磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，gpc3)具有高亲和力的多肽及其应用，例如用于肝癌的特异性诊断和治疗。

背景技术：

当前在中国，癌症已超过其他病因成为疾病死因之首，发病率和死亡率还在逐年攀升之中，因此癌症已成为非常重要的公共健康问题。其中，肺癌、胃癌、食管癌和肝癌是我国发病率和死亡率较高的常见肿瘤，且在60岁以下男性中，肝癌是最常见和死亡率最高的癌症。肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是肝癌的主要类型，尽管手术和放化疗等方法可以缓解患者症状、延长生存时期，但hcc患者5年存活率仍低至15％。由于现有肝癌诊断缺乏灵敏有效的方法，当肿瘤确诊时一般已发展为晚期，因此如何提高诊断的灵敏度和特异度、开发早期筛查和早期诊断的新方法将有助于提高肝癌的诊疗水平。

现有研究表明，gpc3可作为检出早期肝癌的理想分子标志物，具备良好的临床应用价值。gpc3是硫酸乙酰肝素(heparansulphate，hs)蛋白聚糖家族的一员，是一种细胞外跨膜糖蛋白，可通过糖基磷脂酰肌醇锚定附着在细胞表面。gpc3高表达于胚胎和胎儿期肝脏，而在正常成人肝细胞和其他器官组织中均不表达，此外约有75％的肝癌组织、尤其是hcc组织中gpc3mrna呈高水平表达，而肝母细胞瘤、肝腺瘤、胆管癌及肝转移性瘤不表达或极低水平表达。由于gpc3易受细胞的蛋白转换酶水解作用形成游离sgpc3进入循环系统，因此在hcc临床诊断方面，gpc3可与afp联用诊断来协助确认肝癌病变，能显著提高诊断的准确性。当患者血清中gpc3出现降低或消失，表明预后良好，而gpc3出现高表达可能是癌症复发或转移的潜在标志。病理学诊断方面，gpc3可作为一种新的肿瘤标志物应用于肝癌的临床病理免疫组化诊断与鉴别诊断，用于疾病诊断和预后评估。除了作为诊断的靶点，由于其特有的生理功能，gpc3还能作为hcc分子靶向治疗的作用靶点，例如，靶向gpc3的cart细胞，能够有效地消除gpc3阳性的hcc细胞，从而为治疗肝癌提供了一种很有前景的免疫治疗新方法。

在肝癌的活体诊断方面，靶向gpc3的活体成像检测探针能够无损实时在位地检测gpc3阳性的hcc，能够区分正常组织和恶性病变部位。例如已有报道，用⁸⁹zr偶联抗人gpc3mab所形成的探针(89zr-dfo-1g12)能够成功地检测到高表达gpc3的hepg2肿瘤。有研究也采用gpc3抗体的(fab’)2片段作为gpc3的靶向单元，可高度亲和gpc3阳性的细胞。虽然抗体具有突出的靶向能力和特异性，但其尺寸和分子质量导致其肿瘤渗透不深、免疫原性强、代谢缓慢，不利于体内代谢和活体靶向、存在交叉反应并且难以制备。相反，小分子多肽所介导的分子影像探针具有靶向性高、易制备、低免疫原性、稳定性好和易传送等优势，鉴于这些优势，开发出理想的多肽分子探针对hcc的诊断和治疗具有重大的意义。

目前公开的关于肝癌靶向多肽分子相关的研究主要是针对单一肝癌细胞，并主要采用噬菌体随机肽库体内展示技术进行筛选。该筛选方法主要针对肝细胞肝癌细胞系或肝癌裸鼠模型进行筛选，如cn201110451767.2公开的是特异性结合肝癌细胞系hepg2的多肽，以及cn1224630c公开的肝肿瘤靶向多肽。然而，这些多肽大多不是肝癌特异性标志物相关的靶向多肽，而且其功能仅仅停留在细胞和动物水平上的有效性。由于这些多肽不具有靶点特异性，因而在实际临床应用中在体内对肝癌的结合能力和靶向特异性可能会出现较大的偏差，如产生脱靶效应。

目前，针对肝癌特异性标志物gpc3设计高亲和力和高靶向性的多肽分子探针鲜有报道。我们注意到，有文献报道了通过噬菌体展示库筛选出了gpc3靶向多肽，其序列为：dhlaslwwgtel(在这里我们将其命名为yp)，并通过细胞实验和动物实验证明了其靶向性，但该多肽对gpc3的亲和力还是有限。

技术实现要素：

本发明公开了能高度亲和gpc3的多肽，通过不同层面的比较，其所展现出的gpc3靶向性要显著优于文献所报道的多肽yp。本发明所述多肽能高效而特异性地结合gpc3，通过标记示踪的荧光物质所形成的多肽探针，在体内和体外实验中均能高效靶向hcc肝癌细胞，显示了良好的肿瘤靶向性和hcc检测应用前景。本发明多肽为制备肝癌早期诊断试剂、肝癌治疗药物和肿瘤靶向制剂等方面提供了新的途径。

本发明多肽氨基酸序列如seqidno:1(简称ygq-1)或seqidno:2(简称ygq-2)所示。

所述多肽为十多个氨基酸长度的短肽，分子量小，合成成本低廉。

所述多肽特异性结合于肝癌组织但不限于肝癌组织，如还可能特异性结合于其他gpc3表达的乳腺癌等肿瘤组织。

本发明公开了肿瘤特异性靶向多肽在制备肽类肿瘤早期诊断的用途，特别是作为肿瘤靶向分子影像探针和检测试剂盒方面的应用。

本发明公开了肿瘤特异性靶向多肽在制备肿瘤治疗药物和肿瘤靶向制剂方面的用途，包括多肽偶联抗肿瘤药物、靶向纳米制剂等方面的应用。

进一步地，本发明公开了一种绿色荧光探针，将本发明多肽与荧光染料异硫氰酸荧光素(英文简称fitc)偶联后形成探针，与细胞共孵育以检测荧光标记的多肽对gpc3的靶向作用，结果显示荧光标记的多肽结合gpc3后定位于细胞膜上，具有良好的靶向性。

进一步地，本发明还公开了一种近红外荧光探针，将多肽与近红外染料icg-der-02(mpa)偶联后形成探针，注射于荷瘤鼠体内以检测其对肿瘤的体内靶向性和代谢分布，结果显示荧光标记的多肽对gpc3阳性的肝癌皮下移植瘤展现出了良好的示踪能力，具有良好的靶向性。

本发明公开了一种用于肝癌检测的靶向探针诊断试剂盒，试剂盒中至少包括本发明多肽偶联的探针、封闭液、洗涤液等，具有出色的特异性和灵敏度。

本发明的多肽与现有技术相比，所具有的有益效果在于：本发明所述的靶向多肽是由gpc3抗体可变区优化得到，具有分子量小、免疫原性小、生物毒性低、靶向性高、容易达到肿瘤组织等特点，且与yp相比，具有更优的肿瘤靶向作用。将本发明多肽应用于肿瘤的早期诊断和治疗，具有十分重要的临床意义。

下面详细描述本发明的功效：

一、体外细胞亲和力实验

分别将人肝癌细胞hepg2、人脑胶质瘤u87细胞和人正常肝细胞l-02培养于六孔板中。待细胞生长到对数期时，分别与fitc标记的荧光多肽yp-fitc、ygq-1-fitc、ygq-2-fitc(均为1μm)共孵育4h，并通过流式细胞术检测其平均荧光强度。当多肽探针与细胞上的受体亲和力强时，流式细胞仪检测出的细胞平均荧光强度值高。图1是多肽探针ygq-1-fitc和ygq-2-fitc对不同细胞系hepg2、u87和l-02的亲和能力，并与yp-fitc进行比较。柱状图代表流式结果的定量分析。由图1可见，与gpc3高表达的hepg2细胞孵育后，yp-fitc、ygq-1-fitc和ygq-2-fitc其平均荧光强度分别为30、60和115，表明本发明的ygq-1和ygq-2对gpc3的亲和特性比yp-fitc更强，且ygq-2更优。同时，在gpc3低表达或无表达的细胞系u87和l-02中，多肽探针平均荧光强度都很低。体外亲和力实验证明，本发明的多肽具备良好的gpc3亲和选择性和靶向能力。

二、体外细胞亲和力阻断实验

为了进一步评价本发明多肽荧光探针对gpc3高表达肿瘤细胞的靶向能力，预先将不同浓度的ygq-1和ygq-2(0，2.5，5，10μm)分别与hepg2细胞共孵育4h，以达到封闭gpc3的目的。随后，ygq-1阻断组中加入ygq-1-fitc(1μm)，ygq-2阻断组中加入ygq-2-fitc(1μm)，共孵育4h后，再使用流式细胞术检测其平均荧光强度。图2是用不同浓度多肽ygq-1或ygq-2阻断gpc3后，多肽探针ygq-1-fitc或ygq-2-fitc与hepg2细胞共孵育后荧光强度的变化。

如图2所示，随着多肽阻断浓度的增加，平均荧光强度逐渐降低，表明与hepg2结合的探针浓度也逐渐降低，说明ygq-1和ygq-2的确能够结合并阻断gpc3，证明了本发明多肽与gpc3亲和特性。

三、体外细胞摄取实验

在共聚焦培养皿中加入用dmem培养基培养的hepg2、u87mg和l-02细胞系，并在37℃、co2浓度为5％、加湿空气环境下孵育24h，细胞完全贴壁并长至30％密度。各细胞皿中分别加入探针yp-fitc、ygq-1-fitc和ygq-2-fitc，使其终浓度为1μm，37℃孵育3.5h后，加入染核试剂hochest33342染色0.5h，用pbs溶液清洗三遍除去未结合的探针，最后用激光共聚焦显微镜观察细胞对探针的摄取情况。图3是多肽探针ygq-1-fitc和ygq-2-fitc对不同细胞系hepg2、u87和l-02的摄取情况和细胞共定位，并与yp-fitc进行比较。柱状图代表对荧光的半定量分析。

如图3显示，在hepg2细胞中，多肽探针yp-fitc、ygq-1-fitc和ygq-2-fitc其平均荧光强度分别为8、16和21，表明ygq-1和ygq-2的亲和性要高于yp，且ygq-2亲和性更好。荧光分布于细胞膜而非胞浆或胞质内，证明所设计的多肽靶向到表达gpc3的肿瘤细胞膜上。在gpc3低表达的u87和l-02细胞中，在胞浆或细胞膜上无绿色荧光。这一结果说明本发明的多肽ygq-1和ygq-2对gpc3高表达的细胞具有很强的亲和力而对低表达的细胞几乎无亲和力，因此具备极好的gpc3靶向能力。

四、活体肿瘤靶向检测实验

本发明应用于体内动物实验的荧光染料为近红外有机染料icg-der-02(又称mpa)，与多肽ygq-1和ygq-2通过酰胺键连接形成近红外探针，简称ygq-1-mpa和ygq-2-mpa。连接具体方法为取2mgmpa溶于1mlpbs中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，n-羟基琥珀酰亚胺(edc/nhs)(摩尔比icg-der-02:edc:nhs＝1:1.5:1.5)，避光反应4h，进行基团活化反应。称取1mmol多肽溶于上述含有荧光染料mpa的1mlpbs缓冲液，室温避光搅拌过夜。反应结束后，反应液浓缩后通过葡聚糖凝胶g-25柱，pbs缓冲液作洗脱液进行洗脱，得到纯化的ygq-1-mpa和ygq-2-mpa，常温浓缩后，低温冻干，-20℃储存备用。

将1×10⁶个hepg2细胞皮下接种于裸鼠的腋下部位，待三周瘤体长至一定体积后，荷瘤鼠模型建立完成。给予hepg2荷瘤鼠尾静脉注射ygq-1-mpa探针，在注射不同的时间点(0，1，2，6，12，24h)通过近红外成像系统对荷瘤鼠进行活体在位成像检测。对肿瘤部位荧光信号强度的目标特定区域(roi)分析，进行如下计算：肿瘤/正常组织比值＝[肿瘤信号强度-背景信号强度]/[正常组织(肌肉)信号强度-背景信号强度]，来定量不同探针在不同肿瘤中的靶向，该值越大说明该探针靶向性越强。图4显示的是多肽探针ygq-1-mpa和ygq-2-mpa在hepg2荷瘤小鼠的体内分布和靶向能力，并与yp-mpa进行比较。柱状图代表各组肿瘤/正常组织信号的比值。

hepg2肝癌细胞是典型的具备高gpc3表达特性的hcc细胞系，靶向gpc3的探针理应能够通过血液循环达到全身分布，随后应逐渐靶向hepg2肿瘤部位并在该部位富集。注射多肽探针yp-mpa、ygq-1-mpa和ygq-2-mpa约2h后荧光分布全身，然后逐渐转移到肾-膀胱代谢。探针在肿瘤部位聚集越来越多，其荧光强度在注射6h达到峰值，肿瘤边缘轮廓较清晰。在6h时，yp-mpa、ygq-1-mpa和ygq-2-mpa的肿瘤/正常组织比值分别为5.5、7.6和8.4，表明在ygq-1和ygq-2的靶向能力比yp更强，且ygq-2更优。这一结果从动物水平上说明本发明的亲和肽能够靶向到gpc3高表达的肿瘤组织，证明了本发明多肽ygq-1和ygq-2可应用于活体靶向的示踪。

综上所述，本发明的多肽能够靶向到gpc3高表达的细胞上，而对gpc3低表达的细胞无靶向性，阻断性实验也证明了多肽与gpc3结合的特性。体外细胞摄取实验证实多肽能结合gpc3并且定位于肿瘤细胞膜上。体内动物实验则证实多肽可靶向到gpc3高表达的肿瘤组织。由此可见，本发明多肽能够通过靶向gpc3从而为肝癌分子影像学检测提供了新的方法。

附图说明

图1是多肽探针对不同细胞系的亲和力作用

图2是gpc3受体阻断后多肽探针对不同细胞系的亲和力作用

图3是多肽探针对不同细胞系摄取情况和细胞共定位

图4是多肽探针在动物水平的靶向示踪能力

具体实施方式

实施例1

本发明多肽的合成

1：偶联

选用rinkamidembharesin，第一氨基酸偶联到树脂上的方法为：3倍量fmoc保护氨基酸，3倍量dic，0.2倍量dmap，反应3小时后，洗涤，用ac液(10％乙酸酐，6％nmm，84％dmf)封端30分钟。随后用dmf洗涤5次后，再用20％的哌啶/dmf溶液脱fmoc约30分钟；dmf洗5次后，得到nh2-aa-mbharesin。按照此法依次完成剩余氨基酸的偶联，偶联过程中采用kaiser法检测，如检测结果为阴性，说明偶联反应完成，则接下去进行脱帽；如检测结果仍为阳性，则说明偶联反应未完成或反应不完全，需要延长偶联时间或重新投料偶联，直至偶联反应完成。重复上述步骤，即缩合-洗涤-去保护-洗涤-缩合，直至得到目的肽链。然后，用20％的哌啶/dmf溶液脱fmoc约30分钟，验色反应，dmf洗5次后，得到nh2-acp-peptide-nh2-mbharesin，真空干燥箱里充分干燥。

2：树脂与肽的分离裂解

将120ml裂解液(10ml/gpeptidylresin)加入树脂中，25℃条件下，磁力搅拌2.5h后用砂芯漏斗将裂解液与树脂分离，弃去树脂，保留滤液。将滤液缓慢滴加到10倍体积的冰无水乙醚中，滴加完毕后，自然沉降30min。用高速离心机4000rpm离心10min，弃去上清液，保留沉淀，将所得沉淀在干燥箱中干燥8-10h，得到干粉粗品。

3：纯化

取上述干粉粗品1g，用0.1％三氟乙酸/水溶解。经过滤后，上样到c18制备柱，用高效液相进行梯度洗脱，收集目标肽的洗脱液体，检测液体纯度。把合格的样品混合后旋蒸，最后用冻干机冻干，得到多肽纯品，纯度大于98％。

得到序列为seqidno:1和seqidno:2的多肽。

紫外光谱图中均在273nm处有肽的吸收峰。

实施例2

异硫氰酸荧光素(fitc)标记的多肽探针合成

在实施例1合成的两种多肽ygq-1和ygq-2中，分别加入2倍当量的fitc，用少量dmf溶解，氮气搅拌助溶。分别加入4倍当量的dipea，反应2小时后取样，用kaisertest检测合成反应是否完成。反应完成后，用dmf洗5次，meoh洗涤3次后，取出树脂并真空干燥，备用。随后进行多肽裂解：用切割f液(95％tfa+2.5％edt+2.5h2o)切割3小时，用10倍体积的乙醚沉淀，过滤洗涤后，真空干燥，得到两种多肽ygq-1和ygq-2偶联fitc的荧光多肽探针粗品，其名称分别为ygq-1-fitc和ygq-2-fitc。将上述得到的多肽探针粗品，通过pre-hplc纯化，收集纯度＞95％的洗脱液，常温浓缩后，低温冻干，得到荧光多肽成品ygq-1-fitc和ygq-2-fitc，-20℃保存。

实施例3

一种用于肝癌检测的靶向探针诊断试剂盒

所述诊断试剂盒组成如下：

a)fitc标记的多肽ygq-1或fitc标记的多肽ygq-2；

b)fitc绿色荧光染料；

c)4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，dapi)；

d)洗涤液，配方为：kcl0.2g、kh2po40.2g、na2hpo4·12h2o2.08g、nacl8.0g；

e)固定液：4％多聚甲醛溶液；

f)封闭液：5％bsa的tbs缓冲液；

g)抗荧光淬灭封片液；

h)抗原修复液，配方为：edta(ph8.0)抗原修复液，edta(ph9.0)抗原修复液，柠檬酸(ph6.0)抗原修复液。

各组成成分作用如下：

a)fitc标记的多肽用于标记gpc3抗原或表达gpc3的细胞或表达gpc3的组织；

b)fitc用于非特异性行对照；

c)dapi是与dna强力结合的荧光染料，能对细胞核进行染色标记；

d)洗涤液可用作探针稀释液，也可用于探针洗涤液；

e)固定液对细胞成分进行固定，特别是活细胞成分或组织切片固定；

f)封闭液用于消除非特异性抗原干扰；

g)抗荧光淬灭封片液减少荧光淬灭，维持荧光强度；

h)抗原修复液去除醛类固定试剂导致的蛋白之间的交联，充分暴露石蜡切片等样品中的抗原表位，从而大大改善免疫染色效果。

实施例4

实施例3的靶向探针诊断试剂盒用于免疫荧光实验

采用上述诊断试剂盒进行免疫荧光实验，包括如下步骤：

(1)取瘤：将hepg2、u87肿瘤沿着肿瘤边缘剪出来并取一部分正常的肝脏组织，用otc包埋剂包埋，置于-80℃约30min。

(2)切片：将hepg2肿瘤组织、u87肿瘤组织和肝脏组织分别用冰冻切片机切成10μm厚的切片备用。

(3)固定：组织切片室温放置30min后，入4℃丙酮固定10min，烘箱干燥20min。pbs洗5min×3。

(4)封闭、通透：冰冻切片室温晾干15min，用含1％trixon-100、5％bsa的pbs溶液室温封闭、通透1h。

(5)探针孵育：在切片上滴加适量的ygq-1-fitc或ygq-2-fitc探针，所加体积视组织大小而定，原则上可均匀覆盖组织面即可，且保证整个过程不会使组织干涸，将切片加在加了pbs的免疫组化湿盒，室温孵育1h。

(6)洗脱：用pbs洗涤未结合的探针，5min×3。

(7)dapi染色：用含1％dapi的pbs液进行核染，在切片上滴加dapi，不透光湿盒中孵育10min。

(8)洗脱：用pbs洗涤，5min×3。

(9)封片：在切片上滴加适量抗荧光淬灭剂封片，4℃避光保存。

(10)切片于荧光显微镜下观察并采集图像(dapi紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；fitc激发波长465-495nm，发射波长515-555nm，发绿光)。

实验结果证实，由于gpc3主要锚定在细胞膜上同时hepg2高表达gpc3，因此，用多肽探针ygq-1-fitc或ygq-2-fitc孵育后，在hepg2的肿瘤细胞膜上能明显地观察到有绿色的荧光信号。在gpc3阴性的u87肿瘤以及肝脏上观察不到任何的绿色荧光信号。表明多肽探针ygq-1-fitc和ygq-2-fitc可靶向gpc3，该试剂盒具有出色的特异性和灵敏度。由于不需要通过二抗进行标记，因此操作过程更加方便快捷，使用该试剂盒能简化实验流程和时间。

序列表

<110>中国药科大学

<120>与肝癌标志物gpc3相关的亲和肽

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>14

<212>prt

<213>人工序列(artificial)

<400>1

lysasnalametasnserproasnglnglyglyleuproser

1510

<210>2

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