OsMTP11基因在改良水稻转运锰离子能力中的应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，涉及osmtp11基因在改良水稻转运锰离子能力中的应用。

背景技术：

锰是植物生长和发育所必需的营养元素之一,它直接参与植物光合作用中电子传递系统的氧化还原过程及psii系统中水的光解；同时,锰是超氧化物歧化酶(sod)活性所必需，对维持叶绿体膜正常的结构有重要的作用。另外，锰离子还是苯丙氨酸解氨酶和硝酸还原酶等酶的辅助因子。尽管锰作为一种营养元素对植物生长具有它的重要性，但是植物对锰的吸收量往往会超过需求量而导致植物中毒，这主要发生在酸性土壤或是还原性高的土壤中。据统计，全世界约有40％的可耕地属酸性土壤,我国约有203万平方公里酸性土壤，约占全国耕地面积的21％。在酸性土壤条件(ph<5.5)下,可溶性锰含量增加易导致植物遭受锰的毒害。研究表明，锰毒是酸性土壤上仅次于铝毒的限制因素。我国南方大面积的酸性土壤、一些矿区土壤及由于长期淹水、氧化还原电位低，大量的锰在土壤中积累，从而严重影响作物生长发育与产量。

目前,研究认为植物的锰耐性和累积机制包括区域化作用、有机酸的螯合、限制吸收和外排作用、抗氧化作用以及离子的交互作用等，其中一些金属转运蛋白在这个过程中发挥了重要的作用。转运蛋白在细胞水平上参与锰向细胞内的转运和向不同细胞器(叶绿体和线粒体等)的释放,以及锰离子在内膜系统(液泡、高尔基体和内质网等)的屏蔽作用；而在整个植株水平上参与植物对锰的吸收、长距离运输和在地上部的累积过程。

与其它作物相比，水稻是比较耐锰的作物，这很可能是因为其长期生活在淹水土壤中形成的机制，但是具体耐性机理仍不完全清楚。目前水稻中发现一些与锰转运相关的蛋白基因，如osnramp5、osysl6、osysl2等，很可能与锰的解毒机制有关。

金属耐受蛋白(mtp，metaltoleranceprotein)属于cdf(cationdiffusionfacilitator)家族中的离子转运蛋白。cdf家族是一个阳离子转运蛋白家族，可以增强植物器官对zn²⁺、cd²⁺、co²⁺、ni²⁺的耐性,该家族成员广泛分布于细菌、真菌、动物及植物中，与生物对金属耐受和细胞内金属离子平衡密切相关，影响细胞内金属离子的积累、金属离子的耐受、信号传导、抵抗氧化胁迫和蛋白质周转等功能。目前为止还没有在水稻中发现参与锰离子运输的mtp蛋白基因。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供osmtp11基因在改良水稻转运锰离子能力中的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

osmtp11基因在改良水稻转运锰离子能力中的应用。

osmtp11基因在构建抗锰胁迫的转基因水稻中的应用。

一种构建耐锰水稻的方法，将osmtp11基因转入锰离子敏感的水稻中获得耐锰水稻。

有益效果：

本发明通过酵母突变株互补试验说明osmtp11具有转运锰离子的功能，结合过表达、干扰osmtp11的植株以及t-dna插入的突变体的表型分析和离子含量测定，进一步验证了osmtp11具有转运锰离子的功能。在水稻原生质体中的表达以及相关抑制剂处理，发现osmtp11定位于反面高尔基体网状结构上。在锰胁迫的情况下，osmtp11能从反面高尔基体网状结构迁移到质膜上去，推测osmtp11通过胞吐的方式把锰离子转运到细胞膜外。以上结果显示osmtp11是水稻中的一个锰离子转运蛋白，能够通过外排的方式减少水稻中锰离子的含量来达到减缓水稻受到锰毒害的水平。同时过表达osmtp11相当于野生型水稻更能耐受锰毒害，为水稻中锰毒害的研究提供了理论基础以及为今后的水稻育种提供了思路和材料储备。

附图说明

图1osmtp11能够互补锰离子缺陷型酵母突变体的耐锰性

(a)酵母突变株pmr1(mn),zrc1d(zn),cot1d(co),cup2d(cu),ycf1(cd)中转入osmtp11基因，能够互补pmr1的生长。

(b)分别转化空载以及pyes2-osmtp11质粒的△pmr酵母突变体在含有3mm锰元素的sd-ura的液体培养基中生长24h，起始od600＝0.3，之后测定酵母生长曲线。

(c)转入osmtp11基因的pmr1突变株相对于空载体能显著降低酵母中的锰离子含量，100μmmn处理转化空载以及基因的突变体，250rpm生长24h，测定元素含量。

图2osmtp11在正常生长条件下全生育期的转录水平分析

水稻正常生长情况下，在不同时期分别取样，实时定量rt-pcr分析osmtp11的表达情况。

图3osmtp11在营养胁迫下的转录水平分析

(a)正常生长12天不同浓度锰元素处理15天的水稻，qrt-pcr测定根，茎osmtp11的表达量。

(b)正常生长12天后在缺少各种生长元素处理15天的水稻，qrt-pcr测定根中osmtp11的表达量。

(c)正常生长12天后在缺少各种生长元素处理15天的水稻，qrt-pcr测定地上部分osmtp11的表达量。

图4osmtp11在水稻原生质体中的亚细胞定位

选取不同的高尔基体标志基因：syp61(tgn，trans-golginetwork)、man1(cis-golgi)、ara7(pvc,pre-vacuolarcompartments)、st(golgi)、vsr2(pvc,pre-vacuolarcompartments)和osmtp11在水稻原生质体中共表达，激光共聚焦观察。标尺长度为5μm。

图5osmtp11在水稻中发挥排毒的功能

过表达，野生型，突变体和干扰材料在普通营养液中生长2个星期之后在含有0.05,0.5，100，500,1000μm的不同浓度的mn营养液中生长2个星期。观察，拍照。

图6过表达，野生型，突变体和干扰材料中锰离子含量测定

过表达，野生型，突变体和干扰材料在普通营养液中生长2个星期之后在含有0.05,0.5，100，500,1000μm的不同浓度的mn营养液中生长2个星期，对根中(a)以及地上部分(b)进行离子含量测定。

具体实施方式

实施例1osmtp11的转运金属离子(mn²⁺、fe²⁺、cu²⁺、zn²⁺、cd²⁺、ni²⁺)的功能验证

本实验室提取日本晴水稻的rna，反转录成cdna，保藏于-20℃冰箱中备用，以此作为目的基因扩增模板。利用引物：osmtp11-f5'gcggccgcatggacggcgacgacc3'(seqidno.1)以及osmtp11-r5'gcggccgcctatttttcatgggacagagcgtg3'(seqidno.2)扩增出osmtp11基因片段。对于酵母的互补试验，我们采用酵母突变体分别为pmr1，ycf1，cot1，zrc1，cup2。这些突变体分别对mn，cd，co，zn，cu敏感(hypersensitive)。将构建好的表达载体，空载，野生型通过peg转化的方式转化到不同的酵母突变体中。挑取阳性克隆放入液体培养基中(sc-u/glu)，摇匀20h，测od600离心机离心收样，清洗。无菌水重悬。稀释10倍4个梯度，取10μl点样在含有2％半乳糖(galactose)的sc-u的平板上30℃培养3到5天。这些平板分别含有3mmmn，100umcd，3mmco，15mmzn，150umcu。观察并拍照。

osmtp11能够互补酵母锰离子转运突变体菌株pmr1的耐锰性，而对其它金属离子包括cd、cu、zn以及co转运突变体没有互补作用(图1a)。同时，测定了转入osmtp11基因的pmr1突变株生长情况，结果表明，转入osmtp11基因的pmr1突变株生长接近野生型，而转入空载体的突变株要差于野生型及转入osmtp11基因的pmr1突变株(图1b)。另外，测定了相关酵母的离子含量，其中转入osmtp11基因的pmr1突变株相对于空载体能显著降低酵母中的锰离子含量(图1c)而其他金属没有显著变化。以上结果说明osmtp11具有转运锰离子的功能。

实施例2osmtp11的亚细胞定位研究

2.1质粒的酶切酶连

用酶bamhⅰ和kpnⅰ对pmd19tsimple-osmtp11质粒及载体pxp008进行双酶切并连接。

2.2提取原生质体

取水稻幼苗，茎，包括年轻幼苗的鞘，用刀片切成0.5～1.0mm小段，立即放入一个装有k3包含1.5％纤维素酶r-10和0.3％混合酶r-10的培养皿中。真空20mmhg浸泡1h,之后室温黑暗，40rpm轻摇下裂解4h。用移液管将混合液轻轻地转移到有盖培养皿中，加入等体积的w5溶液，80rpm摇1h来释放原生质体。用35-到75-μm的尼龙网过滤混合液，室温150g离心4min,收集原生质体。收集的原生质体用w5洗两次，显微镜下血球计数板计数。

2.3转染原生质体

(1)w5混合液中的原生质体(1×10⁶ml^-1)在冰上培养30min。原生质体被压成小球状，在1×10⁶ml^-1的mmg溶液中重悬。取100μl原生质体(1×10⁵在mmg溶液中),逐渐加入等体积的peg溶液(40％(v/v)peg4000,0.4m甘露醇，0.1mcacl2)，加入5-10μgdsrna(质粒)，混合液室温下黑暗孵育15min。转染后的原生质体150g离心力下离心2min，收集原生质体加入600μlw5溶液稀释。原生质体在1mlw5溶液中重悬，28℃黑暗下在六孔板上孵育指定时间。

2.4激光共聚焦显微镜下观察结果。

明场及488nm波长蓝光激发光下观察亚细胞定位结果。结果显示，osmtp1在水稻原生质体中表达成点状结构。为了进一步研究具体的亚细胞定位，选择了高尔基体上的marker基因syp61(tgn，trans-golginetwork)、man1(cis-golgi)、ara7(pvc,pre-vacuolarcompartments)、st(golgi)、vsr2(pvc,pre-vacuolarcompartments)，和osmtp11在水稻原生质体中共表达，结果显示，osmtp11和反面高尔基体网状结构(tgn，trans-golginetwork)共定位，而和其他蛋白只有很少部分的重合(图4)。

2.5quantitativert-pcr

osmtp11的表达量测定，在不同浓度mn的处理条件下野生型的根与地上部分基因的表达情况。野生型水稻在正常营养条件下生长15天后在含有0.05，0.5，100μm的mncl2处理10天，营养缺陷在正常的营养液中生长15天之后分别在缺mn，fe，zn，cu的营养液中处理7天。分别收取roots和shoots。结果显示，无论是在地上部分还是根部，在锰离子胁迫条件下(100mm)，osmtp11表达量显著上升(图3a)，而在缺素条件下，只有缺少锰离子营养条件的时候诱导了osmtp11表达量的上升，其他元素包括铁、锌、铜等元素的缺素条件没有影响osmtp11的表达水平(图3b，3c)。以上结果显示osmtp11响应了水稻对锰离子营养水平的变化，而对其他离子的变化不敏感。

整个水稻生长周期基因表达量的测定，在大田生长的野生型(中花11)水稻从6月中旬到10月初，分别取各个时期的组织。所有样品液氮冻存，用trizol法提取rna(takara)，总量为0.1μgrna反转录成第一条cdna用primescript^tmrtreagentkitwithgdnaeraser(takara)试剂盒。之后qrt-pcr用sybrpremixextaqtm(takara))试剂盒进行。机器为abi-7500fastreal-timepcrsystem(appliedbiosystems。采用的内参基因为histoneh35′-ggtcaacttgttgattcccctct-3′(seqidno.3)和5′-aaccgcaaaatccaaagaacg-3′(seqidno.4)。osmtp11的引物为5′cagaagtgaggcattagc3′(seqidno.5)和5′aagtggaggcaattatagc3′(seqidno.6)。结果显示，osmtp11在幼苗期直至孕穗期根中表达水平高于地上部分，在抽穗期地上部分表达量高于根部，且是全生育期中表达量水平最高的阶段(图2)。

实施例3osmtp11干扰及过表达植株的构建及表现分析

rnai构建：osmtp11cdna取324bp到800取477bp连入lh-fad2-1390rnaivector，引物为5′ggggtaccccaggaatgtccaaggaagagcgtgag3′(seqidno.7)、5′cgagctcgtcctgtgcataagccttcactattt3′(seqidno.8)、5′cgggatcccgaggaatgtccaaggaagagcgtgag3′(seqidno.9)以及5′cgacgcgtcgtcctgtgcataagccttcactattt3′(seqidno.10)。基因表达水平通过半定量rt–pcr进行检测。过表达载体构建：将osmtp11cdna全长连接到pcambia1304.1载体中，引物为5'actagtatggcggcggcggtc3'(seqidno.11)及5'actagtctatttttcatgggacagagcgtg3'(seqidno.12)。将构建好的载体转化进水稻愈伤组织培育转基因水稻。将过表达，野生型(中花11)，突变体，干扰植株在1/2的kimurabnutrientsolution中正常生长15天之后，转放到含有0.05,0.5，500.1000μm的mncl2营养液中处理10天，roots，shoots用无菌水清洗两次分别收样，70℃烘箱烘干2天。测量干重。hno3(60％)硝解20min，121℃。通过inductivelycoupledplasmaopticalemissionspectrometry(optima2100dv；perkinelmer)测定元素含量。

在不同锰离子处理的条件下，过表达osmtp11相比于野生型水稻能够耐受高水平的锰胁迫，而突变体以及干扰株系对锰胁迫表现出更敏感(图5)。同时，测量了水稻根和地上部分的离子含量，结果表明，锰离子含量在过表达株系根中(图6a)以及地上部分(图6b)要低于野生型，而突变体和干扰株系中含有更多的锰离子。同时，测定了其他离子的含量，没有表现出这种差异。以上结果显示，osmtp11是水稻中的一个锰离子转运蛋白，能够通过外排的方式减少水稻中锰离子的含量。