本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的三元复合毒素及其制备方法。
背景技术：
根据世界卫生组织统计，全世界有3/5的人死于恶性肿瘤、糖尿病、心血管疾病、慢性呼吸系统疾病这4大类疾病，而恶性肿瘤则是最主要的死因之一。微生物来源的抗肿瘤活性成分结构新颖、作用机制独特，具有很好的发展潜力。夏立秋等分离到一株具有肿瘤靶向性的昆虫病原线虫共生致病杆菌xenorhabdusstockiaehn_xs01(cctccno:m2012069)，从中分离到了四种具有抗肿瘤活性的次级代谢产物——长沙霉素a、长沙霉素b、长沙霉素c、长沙霉素d；在进一步研究x.stockiaehn_xs01中抗肿瘤活性物质时，筛选到一种具有抗肿瘤活性的三元复合毒素。该三元复合毒素与细菌中普遍存在的srfabc毒素具有同源性。目前，已有研究报道主要集中在srfabc类毒素的所在基因岛序列特点、毒素表达调控研究上，有关srfabc类毒素的认识还存在较大的分歧、矛盾性观点较多；而关于srfabc毒素的抗肿瘤活性没有相关研究和报道。
技术实现要素：
本发明的目的是，克服现有技术的不足，提供一种具有抗肿瘤活性的三元复合毒素及其制备方法。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是，本发明之具有抗肿瘤活性的三元复合毒素，其编码基因来源于昆虫病原线虫共生致病杆菌xenorhabdusstockiaehn_xs01(cctccno:m2012069)(参见cn103074282a)，为xsrfabc基因(即srfabc毒素基因)，xsrfabc基因包含三个开放阅读框(orf)：xsrfa(1395bp)、xsrfb(3021bp)和xsrfc(2682bp)。xsrfa的核苷酸序列如序列表seqidno:1所示，xsrfb的核苷酸序列如序列表seqidno:2所示，xsrfc的核苷酸序列如序列表seqidno:3所示。
seqidno:1
xsrfa：
seqidno:2
xsrfb：
seqidno:3
xsrfc：
本发明之具有抗肿瘤活性的三元复合毒素(xsrfabc)的氨基酸序列，xsrfa基因编码的蛋白氨基酸序列如序列表seqidno:4所示，xsrfb基因编码的蛋白氨基酸序列如序列表seqidno:5所示，xsrfc基因编码的蛋白氨基酸序列如序列表seqidno:6所示。xsrfa编码产物xsrfa由464个氨基酸组成，xsrfb编码产物xsrfb由1006个氨基酸组成，xsrfc编码产物xsrfc由893个氨基酸组成。
seqidno:4
xsrfa：
seqidno:5
xsrfb:
seqidno:6
xsrfc：
本发明还包括序列表seqidno:4-6所示的氨基酸序列以及编码这些氨基酸序列的核苷酸序列。
通过实验发现，xsrfabc复合毒素对肿瘤细胞具有很好的抑制效果。
本发明之具有抗肿瘤活性的三元复合毒素的制备方法：首先我们提取了xenorhabdusstockiaehn_xs01的基因组，构建了基因组fosmid文库，筛选对hela细胞具有毒性的克隆子，对克隆子进行测序分析，将xsrfabc基因克隆获得表达载体psc101-bad-xsrfabc，将表达载体转化入gb05，得到重组菌株gb05(xsrfabc)，诱导表达xsrfabc毒素。可测定对肿瘤细胞的毒性(参见图1)。(从xenorhabdusstockiaehn_xs01的基因组fosmid文库中筛选到xsrfabc基因，将xsrfabc基因诱导表达得到复合毒素)。
本发明中，gb05(xsrfabc)重组菌株经诱导后，提取全蛋白对肿瘤细胞hela、b16进行毒性检测。与空白对照相比，诱导后全蛋白对细胞的影响更为明显，特别是诱导4h全蛋白造成细胞形态变圆，伪足消失，细胞结团，细胞贴壁性降低，细胞数目减少，说明诱导后全蛋白有明显的细胞毒性。说明xsrfabc毒素对肿瘤细胞具有很好的毒性。此外，本发明通过原核表达、纯化制备xsrfabc毒素，提供了一种新型的、细菌来源的抗肿瘤活性物质。xsrfabc毒素对正常细胞——人脐静脉内皮细胞(huvec)没有毒性。
本发明之具有抗肿瘤活性的三元复合毒素，还可以采用以下方法制备：(将三个基因片断分别表达三种蛋白，再收集，即得到复合毒素)
为了制备xsrfabc毒素，我们分别构建了xsrfa、xsrfb和xsrfc的原核表达载体，诱导表达复合毒素的各组分，并利用亲和层析纯化毒素蛋白，将三种组分混合后以hela细胞为靶标进行细胞毒性测定。具体过程：pcr分别扩增xsrfa、xsrfb和xsrfc基因片段，并克隆到表达质粒pgex-4t-2，获得三个重组质粒：pgex-4t-srfa，pgex-4t-srfb，pgex-4t-srfc(参见图2)。
将三个重组质粒分别电转至e.colibl21中，获得重组菌株bl21-srfa、bl21-srfb、bl21-srfc。三种重组菌株经iptg诱导后，均表达可溶性的目的蛋白。将三种可溶性表达蛋白的菌体上清用0.22μm滤膜过滤，用清洗缓冲液清洗gst琼脂糖树脂，加入蛋白裂解液，加入5倍柱体积的洗涤缓冲液洗脱蛋白，重复洗脱一次，加入2倍柱体积elutionbuffer洗脱，收集蛋白，sds-page检测所纯化蛋白的纯度(参见图3)。分别表达再收集的复合毒素。
诱导后复合毒素对肿瘤细胞有明显的细胞毒性。但对正常细胞——人脐静脉内皮细胞(huvec)没有毒性。
微生物来源说明
昆虫病原线虫共生致病杆菌hn_xs01(xenorhabdusstockiaehn_xs01)；于2012年03月09日在中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址：中国·武汉·武汉大学)保藏，菌种保藏编号为cctccno：m2012069。(参见cn103074282a)
附图说明
图1为表达质粒psc101-bad-xsrfabc示意图；
图2为表达质粒pgex-4t-xsrfa、pgex-4t-xsrfb、pgex-4t-xsrfc示意图；
图3为毒素蛋白xsrfa、xsrfb、xsrfc可溶性表达及纯化检测图；
图4为毒素蛋白xsrfabc对hela细胞的毒性；图中，a，对照(pbs处理肿瘤细胞)；b～f，实验组(毒素蛋白xsrfabc的浓度分别为50ng/μl、100ng/μl、150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl)；
图5为毒素蛋白xsrfabc对b16细胞的毒性；图中，a，对照(pbs处理肿瘤细胞)；b～f，实验组(毒素蛋白xsrfabc的浓度分别为50ng/μl、100ng/μl、150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl)；
图6为毒素蛋白xsrfabc对人脐静脉内皮细胞(huvec)的毒性；图中，a，对照(pbs处理人脐静脉内皮细胞细胞)；b～f，实验组(毒素蛋白xsrfabc的浓度分别为50ng/μl、100ng/μl、150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl)。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本实施例之具有抗肿瘤活性的三元复合毒素，其编码基因来源于昆虫病原线虫共生致病杆菌xenorhabdusstockiaehn_xs01(cctccno:m2012069)(参见cn103074282a)，为xsrfabc基因(即srfabc毒素基因)，xsrfabc基因包含三个开放阅读框(orf)：xsrfa(1395bp)、xsrfb(3021bp)和xsrfc(2682bp)。xsrfa的核苷酸序列如序列表seqidno:1所示，xsrfb的核苷酸序列如序列表seqidno:2所示，xsrfc的核苷酸序列如序列表seqidno:3所示。
本实施例之具有抗肿瘤活性的三元复合毒素(xsrfabc)的氨基酸序列，xsrfa基因编码的蛋白氨基酸序列如序列表seqidno:4所示，xsrfb基因编码的蛋白氨基酸序列如序列表seqidno:5所示，xsrfc基因编码的蛋白氨基酸序列如序列表seqidno:6所示。xsrfa编码产物xsrfa由464个氨基酸组成，xsrfb编码产物xsrfb由1006个氨基酸组成，xsrfc编码产物xsrfc由893个氨基酸组成。
致病杆菌基因组fosmid文库构建
制备昆虫病原线虫共生致病杆菌hn_xs01(xenorhabdusstockiaehn_xs01)过夜菌，提取基因组；用200μl的枪头进行机械剪切50次～100次，回收取目的dna片段。将基因组dna末端补齐及磷酸化修复，与载体pcc1fo进行连接，进行噬菌体包装，并感染epi300-t1r，稀释涂板，涂布在含cm12.5μg/ml的lb固体平板上，37℃倒置培养，待克隆子长出。待克隆子都长出，进行计数并做好记录，加2mllb培养基于第一个平板上，将菌落洗脱下来后吸入另外一个平板上，每两个平板的洗脱液吸入同一个2ml的ep管中，加上终浓度为10wt％的甘油保菌，-80℃保存。
实施例2对肿瘤细胞具有毒性的克隆子筛选
从液氮罐里面取出肿瘤细胞(hela细胞和b16细胞)冻存管，于37℃水浴锅中快速来回划动使其融化，加入7ml1640培养基后，放入37℃培养。肿瘤细胞生长24h后倒掉废液，用3mlpbs(磷酸盐缓冲液)洗涤两次后加入1ml0.25wt％的胰酶于37℃消化30s，加入4ml新鲜培养基终止酶的反应，将细胞按“z”字打散，1000rpm离心5min，将上清倒掉后加入8ml培养基将细胞悬浮后全部转移到培养皿中，37℃培养。
取出实施例1中所得致病杆菌基因组fosmid文库克隆管，分别取10μl接种于20ml含cm(氯霉素)12.5μg/ml的lb液体培养基中，37℃振荡培养24h；离心收集上述菌体，用去离子水洗涤两次，加入2ml去离子水混匀，进行超声破碎；离心收集上清，将上清溶液通过0.22μm滤膜在超净台中进行过滤，取50μl上清液作用于各肿瘤细胞，筛选出对肿瘤细胞有毒性的fosmid克隆；对克隆子进行测序分析。
实施例3表达载体psc101-bad-xsrfabc的构建
设计引物(hyg-pbad-f：acgcggatccacctgcagtgttacattgc；hyg-pbad-r：acgcgtcgacatagtgaattcctcctgctagc)，采用高保真taq酶扩增xsrfabc基因的orf，扩增反应的条件为94℃5min，(94℃30s，56℃30s，72℃4min)共30个循环，72℃10min。bamhi和sali双酶切后将其克隆到实验室保存的psc101-bad-hyg质粒上，转化大肠杆菌宿主gb05菌株，得到重组菌株gb05(xsrfabc)，诱导表达xsrfabc毒素。并通过pcr鉴定挑选出转化阳性的克隆子，进一步通过测序鉴定。图1为表达质粒psc101-bad-xsrfabc示意图。
将xsrfabc毒素配制成不同浓度的溶液，将不同浓度的xsrfabc毒素蛋白加入肿瘤细胞和正常细胞中，培养48h后观察毒素对细胞的作用情况。
图4为毒素蛋白xsrfabc对hela细胞的毒性；图中，a，对照(pbs处理细胞)；b～f，实验组(毒素蛋白xsrfabc的浓度分别为50ng/μl、100ng/μl、150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl)；
图5为毒素蛋白xsrfabc对b16细胞的毒性；图中，a，对照(pbs处理细胞)；b～f，实验组(毒素蛋白xsrfabc的浓度分别为50ng/μl、100ng/μl、150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl)。
图6为毒素蛋白xsrfabc对人脐静脉内皮细胞(huvec)的毒性；图中，a，对照(pbs处理人脐静脉内皮细胞细胞)；b～f，实验组(毒素蛋白xsrfabc的浓度分别为50ng/μl、100ng/μl、150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl)。
可见复合毒素对两种肿瘤细胞具有毒性，对正常细胞正常。
实施例4表达质粒pgex-4t-srfa，pgex-4t-srfb，pgex-4t-srfc的构建
分别设计引物(srfa-f:acgcggatccatgtgtatttttaataacaagg，srfa-r:acgcgtcgacttaatctgcctctcgctttatcg；srfb-f:acgcggatccatgctggcaactattactg，srfb-r:acgcgtcgacttagattttaatacttccac；srfc-f:acgcggatccatgaatcattttactcctgaac，srfc-r:acgcgtcgacttactccgacgacaattgaatacg)，采用高保真taq酶分别扩增xsrfa、xsrfb和xsrfc基因片段，扩增反应的条件为94℃5min，(94℃30s，56℃30s，72℃1～3min)共30个循环，72℃10min。bamhi和sali双酶切后将其克隆到表达质粒pgex-4t-2上，转化大肠杆菌宿主gb05菌株，并通过pcr鉴定挑选出转化阳性的克隆，进一步通过测序鉴定。得到重组菌株bl21(srfa)，bl21(srfb)，bl21(srfc)。
实施例5xsrfabc毒素的可溶性表达及表达产物的纯化
将实施例4所得重组菌株bl21(srfa)，bl21(srfb)，bl21(srfc)分别转接至lb液体培养基，37℃，160rpm培养过夜；按2wt％的接种量将过夜菌转接至50mllb液体培养基中，37℃培养2h，使od600为0.6，进行iptg诱导。
结果表明，srfa蛋白在iptg(异丙基硫代半乳糖苷)浓度为0.5mm，16℃诱导14h，可以使蛋白可溶性表达的量达到最大；srfb蛋白在iptg浓度为0.5mm，16℃诱导过夜，可以使蛋白可溶性表达的量达到最大；srfc蛋白在iptg浓度为0.2mm，16℃诱导过夜，可以使蛋白可溶性表达的量达到最大。收集各菌体并超声破碎，收集上清液进行sds-page检测。分别以空载体pgex-4t-2的菌体过夜诱导表达的上清为对照，在bl21(srfa)上清中表达分子量81kda的目的蛋白条带，在bl21(srfb)上清中表达分子量为136kda的目的蛋白条带，在bl21(srfc)上清中表达分子量为124kda的目的蛋白条带，表明srfa，srfb，srfc在重组菌株中均得到了可溶性表达。将诱导表达后的三种蛋白的菌体上清用0.22μm滤膜过滤，用10倍柱体积的清洗缓冲液清洗gst琼脂糖树脂，加入蛋白裂解液5ml，封闭底部，4℃结合6h，加入5倍柱体积的洗涤缓冲液洗脱蛋白，重复洗脱一次，加入2倍柱体elutionbuffer洗脱，收集蛋白，重复洗脱三次，收集洗脱液，进行sds-page检测。纯化结果srfa，srfb，srfc蛋白纯度较高，三种蛋白的纯度均在96～98％之间。图2为表达质粒pgex-4t-xsrfa、pgex-4t-xsrfb、pgex-4t-xsrfc示意图；图3为毒素蛋白xsrfa、xsrfb、xsrfc可溶性表达及纯化检测图。
从液氮罐里面取出肿瘤细胞(hela细胞和b16细胞)冻存管，于37℃水浴锅中快速来回划动使其融化，加入7ml1640培养基后，放入37℃培养24h，倒掉废液，用3mlpbs洗涤两次后加入1ml0.25％的胰酶进行37℃消化30s，加入4ml新鲜培养基终止酶的反应，将细胞按“z”字打散，1000rpm离心5min，将上清倒掉后加入8ml培养基将细胞悬浮后全部转移到培养皿中，37℃培养。待细胞状态极佳时，将细胞进行悬浮，通过血球计数板进行计数，加入培养基调整细胞悬液浓度(2×104细胞/ml)，将调整好的细胞悬液按100μl/孔加入到96孔板中。
将毒素蛋白xsrfa、xsrfb、xsrfc混合后，配制浓度为50ng/μl、100ng/μl、150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl的溶液，37℃孵育48h后观察毒素对正常细胞、hela细胞和b16细胞的作用情况。结果表明，混合毒素对两种肿瘤细胞具有毒性，对正常细胞无素性。
将毒素蛋白xsrfa、xsrfb、xsrfc分别配制浓度为50ng/μl、100ng/μl、150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl的溶液，分别于37℃孵育48h后观察毒素对正常细胞、hela细胞和b16细胞的作用情况。结果表明，所有浓度的单独的毒素蛋白xsrfa或xsrfb或xsrfc对正常细胞、hela细胞和b16细胞均没有毒性。
将毒素蛋白xsrfa、xsrfb混合，配制浓度为50ng/μl、100ng/μl、150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl的溶液，分别于37℃孵育48h后观察毒素对正常细胞、hela细胞和b16细胞的作用情况。结果表明，xsrfa、xsrfb混合蛋白对正常细胞、hela细胞和b16细胞均没有毒性。
将毒素蛋白xsrfa、xsrfc混合，配制浓度为50ng/μl、100ng/μl、150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl的溶液，分别于37℃孵育48h后观察毒素对正常细胞、hela细胞和b16细胞的作用情况。结果表明，xsrfa、xsrfc混合蛋白对正常细胞、hela细胞和b16细胞均没有毒性。
将毒素蛋白xsrfb、xsrfc混合，配制浓度为50ng/μl、100ng/μl、150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl的溶液，分别于37℃孵育48h后观察毒素对正常细胞、hela细胞和b16细胞的作用情况。结果表明，xsrfb、xsrfc混合蛋白对正常细胞、hela细胞和b16细胞均没有毒性。
序列表
<110>湖南师范大学
<120>一种具有抗肿瘤活性的三元复合毒素及其制备方法
<160>6
<210>1
<211>1395
<212>dna
<213>昆虫病原线虫共生致病杆菌xenorhabdusstockiaehn_xs01（cctccno:m2012069）
<220>
<400>1
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<213>昆虫病原线虫共生致病杆菌xenorhabdusstockiaehn_xs01（cctccno:m2012069）
<220>
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<213>昆虫病原线虫共生致病杆菌xenorhabdusstockiaehn_xs01（cctccno:m2012069）
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